段　黎， 皮科武

(湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院， 湖北 武漢 430068)

硫酸鹽還原菌的馴化及硫酸鹽降解動力學研究

段黎， 皮科武

(湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院， 湖北 武漢 430068)

[摘要]為了有效處理酸性礦山廢水(Acid Mineral Drainage, AMD)，獲得耐低pH的硫酸鹽還原菌(Sulphate Reducing Bacteria, SRB)，先在pH為7的條件下用Postgate's C培養(yǎng)基對SRB進行富集培養(yǎng)，然后逐步降低培養(yǎng)基中的pH值，依次在pH為6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的Postgate's C培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)SRB，對馴化過程中溶液的pH和硫酸鹽濃度進行測定，并對硫酸鹽的降解過程進行動力學擬合。結果表明，經馴化后SRB可以在pH為4的環(huán)境中生長，馴化傳代后的SRB在pH為4的條件下pH上升到5.0左右，硫酸鹽的去除率達到38%，馴化效果比較明顯。硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型，且培養(yǎng)基中起始pH越低，降解速率越慢。

[關鍵詞]硫酸鹽還原菌；馴化；硫酸鹽；降解動力學

AMD是一類低pH、含高濃度硫酸鹽和可溶性重金屬離子的廢水，如果不經處理直接排入水體中，會使受納水體酸化，對河流中的水生生物造成極大的危害；另外，重金屬離子由于無法被降解，一旦進入環(huán)境中后就會不斷累積而難以去除，還會破壞土壤結構，造成環(huán)境的長期污染。因此，有效治理酸性礦山廢水是一個亟待解決的重大問題[1]。

用SRB處理AMD可以還原硫酸根，提高廢水pH及去除重金屬[2-3]。SRB處理酸性廢水的作用機理為：通過還原硫酸鹽，產生硫化物，同時在硫酸鹽降解的過程中會產生堿度，從而會讓酸性廢水中pH上升；另外廢水中的金屬離子與反應生成的S2-結合產生沉淀，由此降低廢水中金屬離子的濃度。

SRB利用有機物將SO42+還原，提高pH，去除金屬離子的過程可表示為：

(1)

(2)

(3)

其中，CH2指能提供電子的各種有機碳源物，如葡萄糖、氨基酸等；M2+指容易與硫化物產生沉淀的金屬陽離子，如Cu2+、Fe3+、Mn4+等[4-6]。本實驗以SRB法處理AMD為背景，在不同pH條件下對SRB進行逐步馴化，以得到耐酸性的SRB，并對馴化過程中硫酸鹽濃度的變化進行曲線擬合，對降解過程進行動力學分析。

1材料與方法

1.1菌種來源

硫酸鹽還原菌菌種由武漢理工大學資源與環(huán)境工程學院實驗室提供。

1.2培養(yǎng)基

采用Postgate's C培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分的質量濃度為：KH2PO4，0.5 g/L；CaSO4，l.0 g/L；NH4Cl 1.0 g/L；FeSO4·7H2O，0.01 g/L；Na2SO4，4.5 g/L；CaCl2·6H2O，0.06 g/L；MgSO4·7H2O，0.06g/L；檸檬酸鈉，0.3 g/L；乳酸鈉，3.5 g/L；酵母浸膏，1.0 g/L。20%NaOH調pH值[7]。

1.3pH的測定

在培養(yǎng)馴化的過程中每天用注射器在厭氧培養(yǎng)瓶中取樣，測定pH值的變化。

1.4SO42+濃度的測定

采用鉻酸鋇分光光度法[8]。在酸性溶液中，鉻酸鋇與硫酸鹽生成硫酸鋇沉淀，并釋放出鉻酸根離子。反應后溶液中剩余的鉻酸鋇和生成的硫酸鋇沉淀可通過過濾除去。鉻酸根離子在堿性條件下呈現(xiàn)黃色，測定其吸光度可知硫酸鹽的含量。用注射器在厭氧培養(yǎng)瓶中取20 mL水樣于錐形瓶中，向其中加入l mL 2.5 mol/L鹽酸溶液，加熱煮沸5 min 左右；取下后再加2.5 mL鉻酸鋇懸濁液，再煮沸5 min 左右；稍冷后，逐滴加入(1+1)氨水至溶液呈檸檬黃色，再多加2 滴，待溶液完全冷卻后過濾，用50 mL比色管收集濾液，然后用蒸餾水稀釋到刻度線。在420 nm 波長下，用10 mm比色皿，測定吸光度。用同樣方法以硫酸根標準溶液的吸光度做標準曲線，然后通過標準曲線計算硫酸根含量。

1.5實驗儀器設備

722N可見分光光度計, 上海光譜儀器有限公司；電子天平, 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C pH計, 上海精密科學儀器有限公司；SKY-2102恒溫搖床, 上海蘇坤實業(yè)有限公司；SHZ-DIII真空抽濾裝置, 鞏義市予華儀器有限責任公司；DL-1電子萬用電爐, 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

2實驗及結果

2.1SRB富集培養(yǎng)

用250 mL的厭氧培養(yǎng)瓶，Postgate's C培養(yǎng)基配置好，調節(jié)pH至7后，轉入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶中，用高純的氮氣排氧15 min，在35℃搖床中預熱1 h，將采集的厭氧泥水混合物以10%的接種比例轉入其中，再次用N2排氧15 min，最后將厭氧瓶在35℃轉速為120 r/min的搖床中暗室培養(yǎng)10 d左右至培養(yǎng)基顏色變黑，且用醋酸鉛試紙條置于瓶口測試，試紙變黑，說明此時已獲得了富集菌液。在培養(yǎng)過程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測定其pH值和SO42+質量濃度。圖1是pH和SO42+質量濃度的變化情況。

(a)pH變化

(b)SO42+質量濃度變化圖 1　在pH為7的條件下培養(yǎng)時pH和SO42+質量濃度

從圖1可看出SRB在最適pH條件下生長時，從開始培養(yǎng)到第8天左右pH保持穩(wěn)定持續(xù)上次，從起始值7.0上升到8.0左右，培養(yǎng)液中SO42+的起始濃度是1600 mg/L，培養(yǎng)到第8天時，SO42+濃度降低到200 mg/L，SO42+的去除率達到88%。第9天、第10天pH和SO42+濃度幾乎沒變化，可能是厭氧培養(yǎng)瓶中營養(yǎng)物質消耗殆盡，SRB的活性降低。

2.2SRB馴化培養(yǎng)

以Postgate's C培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)，逐步降低pH馴化SRB，用20%H2SO4調菌液pH，使pH降低，觀察菌的生長情況，當培養(yǎng)基顏色變黑，且用醋酸鉛試紙條置于瓶口測試，試紙變黑時，轉入pH更低的培養(yǎng)基中，以此培養(yǎng)方法最終獲得能耐受低pH的SRB，依次在pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的培養(yǎng)基以10%的接種比例轉入其中，在35℃轉速為120 r/min的搖床中暗室培養(yǎng)。根據(jù)富集培養(yǎng)過程中pH和SO42+濃度的變化情況，8 d以后營養(yǎng)物質消耗殆盡，因此每個批次培養(yǎng)8 d，在培養(yǎng)過程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測定其pH值和SO42+濃度。圖2是馴化過程中不同起始條件下pH的變化情況。

圖 2　不同起始pH條件下pH的變化

由圖2可知，起始pH為6.5 、6的培養(yǎng)液中，8 d后溶液中pH均上升到8左右，pH為5.5、5.0分別上升到7和6，而pH為4.5的培養(yǎng)液中pH上升到5.0，pH為4.0的培養(yǎng)液中pH上升到4.3，說明pH為4的培養(yǎng)液中SRB生長速率慢，代謝不旺盛，這是因為過酸的環(huán)境均對SRB的生長有顯著抑制作用。

(a)pH=6.5時

(b)pH=6.0時

(c)pH=5.5時

(d)pH=6.0時

(e)pH=4.5時

(f)pH=4.0時圖 3　不同起始pH條件下SO42+的變化及去除率

圖3是不同起始pH條件下SO42+的變化及去除率，可見pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的條件下培養(yǎng)8 d之后SO42+的去除率分別為73.7%、66.8%、54.5%、48.1%、26.1%、15.4%，說明pH值越低越不利于硫酸鹽的降解。

2.3SBR馴化后的傳代培養(yǎng)

在250 mL的厭氧培養(yǎng)瓶，Postgate's C培養(yǎng)基配置好后，調節(jié)pH至4后，以10%的接種比例將馴化至pH為4的菌液轉入其中，在35℃轉速為120 r/min的搖床中暗室進行傳代培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測定其pH值和SO42+質量濃度。圖4是pH和SO42+濃度的變化。由圖4可知傳代后pH值8 d后上升到5.0左右，SO42+的去除率為38%，比pH為4馴化第一代硫酸鹽降解效果明顯。

(a)pH變化

(b)SO42+質量濃度變化圖 4　pH為4的SRB傳代后pH和SO42+的變化及去除率

圖5是馴化前后SO42+去除率的比較，可知未經馴化的SRB在pH為4的條件下培養(yǎng)時SO42+去除率為0.9%，硫酸鹽幾乎沒有降解，這是因為過酸的環(huán)境不利于SRB的生長，對微生物的代謝有抑制作用。而馴化初期，第一代馴化的耐酸性SRB的SO42+去除率最后達到15%，由此傳代后SRB的SO42+去除率達到38%，說明馴化達到了比較明顯的效果。

圖 5　馴化前后SO42+去除率的比較

3硫酸鹽降解的動力學分析

為了進一步了解在SRB的作用下硫酸鹽降解的過程，對硫酸鹽降解速率進行了動力學分析。根據(jù)實驗結果進行曲線擬合，將實際降解時間t(d)作為自變量x，SO42+質量濃度(mg/L)作為因變量y，擬合結果如圖6所示。

圖 6　SO42+質量濃度隨時間變化曲線

硫酸鹽降解的關系式為

SO42+= A0+ A1t+ A2t2+A3t3+ A4t4

各參數(shù)和相關系數(shù)如表1所示。

假設硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型[9]，指數(shù)速度的數(shù)學模型為

(1)

式中：v為降解速度；K為速度常數(shù)，它表示單位濃度的反應速度，又稱反應比速；n為反應級數(shù)；c為SO42+質量濃度,mg/L；t為硫酸鹽降解時間,d。

對式(1)兩邊取對數(shù)得

lgV=lgK+nlgc

(2)

由lgc對lgV進行一元線性回歸，通過計算SO42+降解過程的速度，并對其速度和濃度求對數(shù)，再對數(shù)據(jù)進行擬合，求取降解過程中反應級數(shù)n和速率常數(shù)K的曲線(圖7)。

表1　SO42+濃度變化參數(shù)

(a)pH=7.0時

(b)pH=6.5時

(c)pH=6.0時

(d)pH=5.5時

(e)pH=5.0時

(f)pH=4.5時

(g)pH=4.0時圖 7　不同起始pH條件下SO42+降解動力學擬合曲線

表2說明硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型，且起始pH越低，K值越小，表示降解速度越慢。因為硫酸鹽的降解是SRB的作用，而微生物的生長代謝受pH的影響很大，pH越低，越不利于SRB的生長，進而不利于硫酸鹽的降解。

表2　不同起始pH條件下SO42+降解動力學擬合參數(shù)

表2中的各項相關系數(shù)R2均大于0.97，說明擬合度高。

4結論

本實驗采用Postgate's C培養(yǎng)基，在35℃厭氧的環(huán)境下，通過逐步降低培養(yǎng)基中pH值對SRB分批馴化培養(yǎng)，對培養(yǎng)液中的pH和硫酸鹽濃度變化情況進行分析比較，并對硫酸鹽降解的過程進行了動力學研究。研究結果表明，經馴化后，SRB能在pH為4的條件下生長，硫酸鹽的去除率能達到15%，傳代后硫酸鹽的去除率能達到38%，而沒有經過馴化的SRB在pH為4的條件下幾乎不能生長，硫酸鹽去除率僅為0.9%，說明馴化過程對SRB的耐低pH生長能力有顯著效果。

[參考文獻]

[1]饒俊, 張錦瑞, 徐暉. 酸性礦山廢水處理技術及其發(fā)展前景[J]. 礦業(yè)工程, 2005, 3(3): 47-49.

[2]李亞新, 蘇冰琴. 利用硫酸鹽還原菌處理酸性礦山廢水研究[J]. 中國給水排水, 2000;16:13-7.

[3]趙宇華, 劉學東. 硫酸鹽還原菌及其影響因子[J]. 環(huán)境污染與防治, 1997(19):41-3.

[4]Elliott P, Ragusa S, Catcheside D. Growth of sulfate-reducing bacteria under acidic conditions in an upflow anaerobic bioreactor as a treatment system for acid mine drainage[J]. Water Research. 1998,32:3724-30.

[5]Somlev V, Tishkov S. Application of fluidized carrier to bacterial sulphate-reduction in industrial wastewaters purification[J]. Biotechnology techniques. 1992(6):91-6.

[6]Kieu H T Q,ller E Mü, Horn H. Heavy metal removal in anaerobic semi-continuous stirred tank reactors by a consortium of sulfate-reducing bacteria[J]. Water Research, 2011, 45(13): 3863-3870.

[7]Garcia C, Moreno D A, Ballester A, et al. Bioremediation of an industrial acid mine water by metal-tolerant sulphate-reducing bacteria[J]. Minerals Engineering, 2001, 14(9): 997-1008.

[8]彭艷平, 余水靜, 賴和勁. 硫酸鹽還原菌生長條件優(yōu)化及馴化試驗研究[J]. 江西理工大學學報, 2013, 34(3): 6-10.

[9]殷士學. 環(huán)境微生物學[M]. 北京：機械工業(yè)出版社，2006，159-162.

[責任編校： 張眾]

Study on the Domestication of Sulphate Reducing Bacteria and the Kinetics of Sulphate Degradation

DUAN Li, PI Kewu

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：In order to obtain the Sulphate reducing bacteria which can grow under the condition of low pH to deal with low pH acid mine waste water effectively, the SRB was first enriched and cultured on the Postgate's C medium at pH 7. Then the pH value of the medium was gradually reduced, and the SRB was respectively acclimated and cultured on Postgate's C medium at pH 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4. In the process of domestication, the pH and sulphate concentration were determined, and the kinetics of the degradation of sulphate concentration was fitted. The results showed that the SRB can grow in the environment of pH 4. After domestication, the pH increased to about 5 under the condition of pH 4, and the removal rate of sulphate reached 38%, and the effect of domestication was obvious. The degradation rate of the sulphate was in accord with the exponential velocity model. The lower the initial Ph is, the slower the degradation rate is.

Keywords：SRB; domestication; sulphate; degradation kinetics

[收稿日期]2016-01-15

[作者簡介]段黎(1991-)， 女，湖北天門人，湖北工業(yè)大學碩士研究生，研究方向為酸性礦山廢水處理技術與設備

[文章編號]1003-4684(2016)02-0116-05

[中圖分類號]X522

[文獻標識碼]：A