郭　巍， 吳正奇， 萬端極， 吳　歡， 陳愛洋

(1 湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068; 2 湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院, 湖北 武漢 430068)

藤茶二氫楊梅素提取工藝優(yōu)化

郭巍1， 吳正奇2， 萬端極1， 吳歡1， 陳愛洋1

(1 湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068; 2 湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院, 湖北 武漢 430068)

[摘要]采用響應(yīng)面分析法對藤茶中二氫楊梅素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法(RSM)確定最佳提取條件為：提取溫度78℃，提取時間64 min，pH=8。在此最佳提取工藝條件下，二氫楊梅素提取率預(yù)測值可達(dá)15.926%，實測值為15.860%，相對誤差為0.42%；對二氫楊梅素進(jìn)行重結(jié)晶純化實驗，5次重結(jié)晶后二氫楊梅素純度達(dá)97.8%。

[關(guān)鍵詞]二氫楊梅素； 提取率； 響應(yīng)面法； Box-Behnken設(shè)計

藤茶是葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)的莖葉，味甘淡，性涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨之功效，廣泛分布于廣東、廣西、云南、湖南、湖北、江西等地[1]。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY)是一種多酚基雙氫黃酮醇，又稱蛇葡萄素，屬黃酮類化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。藤茶中二氫楊梅素的含量為30%～40%[2-3]。研究表明，二氫楊梅素是清除自由基、抗高血壓、降血脂、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等諸多生理活性物質(zhì)，此外，還具有良好的抑菌、抗氧化作用[4-7]，極具開發(fā)潛力。

圖 1　二氫楊梅素結(jié)構(gòu)式

本試驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以二氫楊梅素提取率為考查指標(biāo)，利用Design Expert統(tǒng)計軟件對影響顯著的3個因素作響應(yīng)面[8]優(yōu)化，確定最佳提取工藝，以便改進(jìn)提取條件，為規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1實驗部分

1.1實驗材料與主要儀器

主要原料和試劑：藤茶干葉；二氫楊梅素對照品(99.8%純度)；甲醇(色譜純)；冰乙酸(色譜純)；丙酮(分析純)；95%無水乙醇。其他試劑均為市售分析純。

主要儀器和設(shè)備：高效液相色譜儀，美國戴安；DFY-500搖擺式高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；三足式離心機(jī)，蘇州優(yōu)耐特機(jī)械制造有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化科技；PHS-2C數(shù)顯酸度計，上海方瑞儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋S21-4，上海醫(yī)療器械五廠；分析天平，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1DMY提取工藝流程藤茶干葉→粉碎→水提→抽濾→濾液→冷卻結(jié)晶→抽濾→干燥→粗提物→丙酮回流提取→濃縮→多次重結(jié)晶→二氫楊梅素[9]。

1.2.2DMY的HPLC檢測方法二氫楊梅素的檢測采用HPLC法。具體操作條件：色譜柱，Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm)；流動相，V(甲醇)∶V(含0.1%冰乙酸水)=28∶72，pH=3.5；柱溫，35℃；流速，1.0 mL/min；檢測波長，292 nm；進(jìn)樣量，20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法：先準(zhǔn)確稱取DMY標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，流動相精確定容至100 mL,得到1 mg/mL母液。然后取適量上述線液，分別稀釋至1、5、10、20、40倍，即分別得體積濃度梯度為1 、0.2 、0.1、0.05、0.025 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測定，得回歸線性方程為

y=738.17x-0.7232(R2=0.9998)

樣品濃度在0.025～1 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

y=738.17x-0.7232　R2=0.9998圖 2　HPLC法測定二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

1.2.3藤茶中DMY含量測定精確稱取粉碎并過40目篩的藤茶粉末15 g，置于索氏提取器中，用適量石油醚加熱回流2 h，脫脂后的樣品，再用無水乙醇在80℃下加熱回流6 h，得到醇提取液，趁熱過濾，然后經(jīng)真空濃縮后移至干燥皿，干燥至恒重，得到提取物[9]。平行5次，取平均值。測定得到藤茶中二氫楊梅素含量為30.5%[10-13]。

1.2.4DMY的純化方法藤茶粗提物中黃酮物質(zhì)主要為二氫楊梅素和楊梅素，兩者均易溶于甲醇、熱水和乙醇，但楊梅素不溶于丙酮。根據(jù)兩者在相同溶劑中溶解度的差異，可用丙酮將粗提物回流，進(jìn)而分離楊梅素，再對二氫楊梅素進(jìn)行多次重結(jié)晶，即可得到高純度二氫楊梅素[14-15]。

1.2.5提取率計算二氫楊梅素提取率

式中：m1為DMY粗品質(zhì)量；p為純度；m2為藤茶粉末質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

分別選用蒸餾水、30%乙醇(體積分?jǐn)?shù))、60%乙醇(體積分?jǐn)?shù))、90%乙醇(體積分?jǐn)?shù))、甲醇作為提取劑，每種溶劑平行3組。在提取溫度70℃、提取時間60 min、液料比30∶1、pH=8的條件下，按照1.2.1的提取流程進(jìn)行提取，測定結(jié)果取平均值，其提取率分別為15.30%、16.68%、13.15%、11.31%、13.12%，結(jié)果顯示30%乙醇提取效果最好，蒸餾水次之，90%乙醇效果最差。考慮水提取率較高，而且簡單易得，污染小，能耗小，所以選用蒸餾水作為藤茶二氫楊梅素的提取溶劑。

2.2單因素試驗設(shè)計

2.2.1提取溫度對二氫楊梅素提取率的影響固定提取時間60 min、液料比30∶1、pH=8，提取溫度梯度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，每個提取溫度平行3份，取平均值。由圖3可知，提取溫度對二氫楊梅素提取率影響較顯著，40℃～70℃之間，提取率呈上升趨勢，70℃后提取率反而下降。原因可能是溫度升高，二氫楊梅素發(fā)生氧化作用，反而導(dǎo)致提取率的下降。故溫度70℃為最優(yōu)條件。

圖 3　提取溫度對二氫楊梅素提取率的影響

2.2.2提取時間對二氫楊梅素提取率的影響固定提取溫度為70℃、液料比30∶1、pH=8，提取時間梯度為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，每個提取時間平行三份，取平均值。由圖4可知，二氫楊梅素提取率先升后降，60 min時提取率達(dá)到最大。可能原因是60 min時細(xì)胞內(nèi)外二氫楊梅素濃度達(dá)到平衡，時間延長，反而導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出[16]，不僅能耗增加，反而不利于最優(yōu)化提取。故提取時間60 min為最優(yōu)條件。

圖 4　提取時間對二氫楊梅素提取率的影響

2.2.3液料比對二氫楊梅素提取率的影響固定提取溫度70℃、時間60 min、pH=8，液料比梯度為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每個體積質(zhì)量平行三份，取平均值。由圖5可知，二氫楊梅素提取率隨液料比增大而升高，先上升較快，但到體積質(zhì)量為30 mL/g時，上升趨勢平緩?？梢姡?dāng)達(dá)到30 mL/g時二氫楊梅素溶出已經(jīng)比較完全，從生產(chǎn)節(jié)約資源、利益最大化考慮，故體積質(zhì)量30 mL/g為最優(yōu)條件。

圖 5　液料比對二氫楊梅素提取率的影響

2.2.4pH對二氫楊梅素提取率的影響固定提取溫度70℃、時間60 min、體積質(zhì)量30 mL/g，pH梯度為5、6、7、8、9，每個pH值平行3份，取平均值。由圖6可知，在pH值5～9的范圍內(nèi)，弱堿條件下的提取率比弱酸條件下的提取率要高。二氫楊梅素的等電點在5.0左右，所以弱堿條件有利于二氫楊梅素的提取，強(qiáng)堿條件會導(dǎo)致二氫楊梅素的開環(huán)[17]。故pH=8為最優(yōu)條件。

圖 6　pH值對二氫楊梅素提取率的影響

2.3響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，選擇提取溫度、提取時間和pH等3個因素為自變量，分別以x1、x2、x3表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-Xo)/X對自變量進(jìn)行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X為自變量的變化步長。采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，試驗因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken設(shè)計因素與水平

編碼值與真實值之間的關(guān)系x1=(X1-70)/10，x2=(X2-60)/10，x1=X3-8。

2.3.1響應(yīng)面分析方案及結(jié)果以3次平行實驗所得提取率平均值為響應(yīng)值(Y)，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。對表2實驗結(jié)果用Design Expert統(tǒng)計軟件包進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，得回歸方程

Y=15.63+0.51x1+0.32x2+0.20x3+

0.10x1x2+0.13x1x3+0.15x2x3-

0.37x12-0.51x22-0.64x32

回歸系數(shù)R2=0.8960，表明實驗值與預(yù)測值高度擬合。

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表3　回歸模型的方差分析

表3數(shù)據(jù)顯示，提取溫度、提取時間的“Pr>F”值小于0.05，表明其影響顯著，但pH的“Pr>F”值大于0.05表明其影響不顯著。整體模型的“Pr>F”值小于0.05，表明該二次方程模型高度顯著。

2.3.2提取工藝條件優(yōu)化根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線，以最大提取率為優(yōu)化指標(biāo)，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀[18]，分析提取溫度、提取時間和pH對其影響(圖7)所示。

(a)

(b)

(c)圖 7　DMY提取率的響應(yīng)面和等高線分析圖

通過Design-expert軟件分析，得到二氫楊梅素提取的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度77.8℃，提取時間64.3 min，pH8.29。在此條件下，提取率預(yù)測值為15.93%。為檢驗響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：提取溫度78℃，提取時間64 min，pH8.3，實際提取率為15.86%，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差為0.42%。因此，基于響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有使用價值。

2.4二氫楊梅素純化

將粗提物用丙酮回流提取兩次，液料比分別為5∶1和3∶1，合并丙酮提取液，濃縮至適當(dāng)體積，然后加水溶解進(jìn)行重結(jié)晶。采用30∶1的液料比進(jìn)行重結(jié)晶，結(jié)果見4表。

表4　重結(jié)晶次數(shù)對得率和純度的影響

由表4可知，結(jié)晶樣品隨重結(jié)晶次數(shù)的增加，得率從第1次的13.8%降低至第5次的3.1%，DMY的純度從第1次的67.8%降低到第5次的97.8%。且經(jīng)過3次重結(jié)晶后，純度提高不再明顯。考慮時間和能耗因素，重結(jié)晶次數(shù)取4次為宜。

3結(jié)論

1)以熱水為提取劑，通過單因素實驗對影響藤茶二氫楊梅素提取率的4個因素(提取溫度、提取時間、液料比、pH)進(jìn)行了考察，然后從中篩選出提取溫度、提取時間和pH進(jìn)行響應(yīng)面分析，最終確定藤茶中二氫楊梅素(DMY)提取的最佳工藝條件，即：提取溫度78℃，提取時間64 min，pH8.3，在此條件下，提取率可達(dá)到15.86%。

2)通過丙酮回流提取，對二氫楊梅素進(jìn)行除雜濃縮后，通過多次重結(jié)晶得到高純度二氫楊梅素。5次重結(jié)晶后，得率為4.2%，二氫楊梅素純度可達(dá)97.8%。

3)本實驗對二氫楊梅素的提取純度過程進(jìn)行了優(yōu)化，可為二氫楊梅素的工業(yè)化提取提供良好的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但沒有對二氫楊梅素在不同提取條件下的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究，這也是下一步工作的重點。

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[責(zé)任編校： 張眾]

The Extraction Process of Dihydromyricetin from Ampelopsis Grossedentata by Response Surface Analysis

GUO Wei1，WU Zhengqi2，WAN Duanji1，WU Huan1，CHEN Aiyang1

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.，HubeiUniv.ofTech. ,Wuhan430068,China；2SchoolofFoodandPharmaceuticalEngin.，HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：The opitimized extraction of dihydromyricetin from ampelopsis grossdentata by response surface analysis is researched in this paper. On the basis of single factor experiment, three key factors were screened out, and the best extraction condition was determined by the response surface method(RSM). The results showed that: extraction temperature78℃,extraction time 64min,the pH8.3. Under such condition, the predictive value of the dihydromyricetin extraction rate can reach 15.926%, and the measured value is 15.860%,the relative error 0.42%; and after five recrystallization and purification experiments, the purity of DMY can be 97.8%.

Keywords：Dihydromyricetin(DMY)；Extraction rate；Response Surface Methodology(RSM)；Box-Behnken design

[收稿日期]2016-01-20

[基金項目]“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD33B03)

[作者簡介]郭巍(1989-)， 男， 湖北隨州人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向為新型分離技術(shù) [通訊作者] 吳正奇(1966-)，男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向為食品加工、食品添加劑

[文章編號]1003-4684(2016)02-0106-05

[中圖分類號]TS21

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]：A