王輝，趙睿，黃陸軍，張世堯，王琦，徐凌川

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東　濟(jì)南　250355）

入侵植物春飛蓬的生物檢定與化學(xué)成分初探

王輝，趙睿，黃陸軍，張世堯，王琦，徐凌川*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355）

摘要：為了對(duì)入侵植物春飛蓬進(jìn)行生物檢定和化學(xué)成分初步研究，采用基原鑒別、顯微鑒別、分子鑒別、紫外光譜及高效液相色譜等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并與近似植物一年蓬進(jìn)行花粉粒和DNA序列比較。結(jié)果表明，春飛蓬粉末中的主要顯微特征為具三孔溝的花粉粒、不定式氣孔、多細(xì)胞非腺毛、冠毛以及導(dǎo)管等；春飛蓬與一年蓬的花粉粒形態(tài)差異顯著；二者的DNA序列區(qū)別明顯；春飛蓬總黃酮的含量為0.59%，未測(cè)出燈盞花乙素。

關(guān)鍵詞：春飛蓬；顯微鑒別；總黃酮；資源利用

春飛蓬（ErigeronphiladelphicusL）為菊科（Compositae）飛蓬屬（Erigeron）植物，又名費(fèi)城飛蓬，與一年蓬（Erigeronannuus（L）Pers）［1］的植物形態(tài)極其相似，該植物于2011年出現(xiàn)在我國(guó)浙江、福建、上海、江蘇和安徽等省市，是一種源自北美的外來(lái)入侵植物。2015年山東境內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有春飛蓬，我們對(duì)其進(jìn)行了初步研究。

1　實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試藥

1.1實(shí)驗(yàn)材料

所用實(shí)驗(yàn)樣品于2015年5月采自山東濟(jì)南，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室徐凌川教授鑒定為菊科飛蓬屬植物春飛蓬（E.philadelphicus）L.地上部分；花粉粒的對(duì)照樣品采自一年蓬（E.annuus（L）Pers）的花序，一并通過(guò)鑒定；春飛蓬的干燥地上部分，粉粹后過(guò)40目篩備用。

1.2儀器

SUPRATM55熱場(chǎng)掃描電子顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（GeneGenius公司）；U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日立公司）；Blospin植物基因組DNA提取試劑盒；移液器范圍（100～1000mL，20～200mL，0.5～10mL）（賽默飛世爾科技公司）；UV-5800（上海元析有限公司）；Waterse2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）等。

1.3試藥

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：YM0313SA14）；燈盞花乙素（野黃芩苷）對(duì)照品（批號(hào)：ZM0520XA14）。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇，所用試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1基原鑒別

春飛蓬為一年生或越年生草本植物。莖直立，高30～100cm，粗壯，上部有分枝，植物密被開(kāi)展長(zhǎng)硬毛及短硬毛（毛較多，明顯），葉互生，基生葉蓮座狀，卵形或卵狀倒披針形，兩面被倒伏的硬毛，葉緣具粗齒，花期不枯萎，莖生葉基部半抱莖；中上部葉披針形或條狀線形，頂端尖，基部漸狹無(wú)柄，邊緣有疏齒，被硬毛。頭狀花序數(shù)枚，直徑6～8mm，總苞片3層，草質(zhì)，披針形，長(zhǎng)3～5mm，淡綠色，邊緣半透明，中脈褐色，背面被毛；舌狀花2層，雌性，舌片線形，長(zhǎng)約6mm，平展，蕾期下垂，花期仍斜舉，舌狀花白色略帶粉紅色，管狀花兩性，黃色，花期為3～5月［2］。

圖1　春飛蓬粉末圖Fig.1　Powder　figure　of　E.philadelphicus　L.

2.2顯微鑒別

2.2.1粉末的顯微觀察

黃綠色。水合氯醛加熱透化裝片，可見(jiàn)具三孔溝、近圓形的花粉粒，表面為齒狀凸起，直徑約為18～20μm。非腺毛基部為2～3個(gè)細(xì)胞并列，頂端細(xì)胞尾尖，形如刺刀。氣孔橢圓形，為不定式。纖維多成束存在，壁厚。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管。莖部薄壁細(xì)胞，其壁呈念珠狀增厚（見(jiàn)圖1）。

2.2.2花粉粒的觀察

取春飛蓬與一年蓬的花粉于標(biāo)本托上，噴金后分別觀察兩者的花粉粒。

掃描電鏡圖顯示，春飛蓬花粉粒的齒狀紋飾稀疏，頂端刺漸尖，直徑約為18μm（圖2a）；而一年蓬的齒狀凸起相對(duì)較多且花粉粒直徑大，約為22μm，齒狀凸起基部膨大，頂端刺驟尖（圖2b）。

圖2　春飛蓬與一年蓬花粉粒的掃描電鏡圖Fig.2　SEM　figures　of　pollen　grains　of　E.philadelphicus　L.and　E.annuus（L）Pers.

2.3分子鑒別

2.3.1方法

通過(guò)Blospin植物基因組DNA提取試劑盒來(lái)分別提取兩種植物的總DNA，利用一對(duì)通用引物ITS1-ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taqmastermix25μL、DNA模板4μL、ITS1引物2μL、ITS4引物2μL、ddH2O17μL。將反應(yīng)體系中的所有成分精密移取至PCR管中并充分混勻后放入PCR儀中。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min，再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min，產(chǎn)物于-4℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：PCR產(chǎn)物5μL用3μLEB染色，在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀照相。PCR產(chǎn)物測(cè)序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)所得植物測(cè)得的ITS堿基序列分別如下：

1號(hào)（春飛蓬）序列：

GGCTGGTGGAGCTGCAGCAGACGACCCGCGAACATGTTAAAACAACCATGCCAGGATGTGTCGAGCATTCGTTCGATCGTTCTGGCATACCGTTGATGTGCCTGCCTAGTTGGCCCTCTGGGTCATCTTGGTGGTCGCATTGACGTAACAAAACCCAGGCACGGGATGTGCCAAGGAACTTAAAATTGAAGAATTGCCTGTCCCATAGTCCCGTTCGCGGTGTGCTCATGGGGTCTGGCATCTTTGTAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTCGGTTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCCCCAACATTTCCTTTGGGATGCTTGGTTGGGAGCGGATATTGGTCTCCCGTTTTCACCGAGCGGTTGGCCGAAATAAAAGCACCTCTTGACGGGCGCAAGACTATTGGTGACAAAACCATGAATTTTGTTGCGTGTCTCGTTAAAAGGATGCTTCTTATAGACCCAACGCGTTGTTTTCTTATGACGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAACCCGGAGGAAAAA（687bp）

2號(hào)（一年蓬）序列：

CGTCGGAGCTGCAAGCAGACGACCCGCGAACATGTTAAAACAATCATGCCAGGATGTATTGAGCATCCGTTTGATCGTCCTGGCATACCGTTGATGTGCCTGCCTCGTTGGCCCAGTGGGTCATCTTGGTGGTCGCTTTGACGTAACAAAACCCAGGCACGGGATGTGCCAAGGAACTTTAAACTGAAGAATTGCCCATCCCAATGAAGTCCCGTTCGCGGTGTGCTCATGGGGTGTGGCATCTTTGTAATCACAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTCGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCTCCCCCACCATTTCCTTTTGGATTGTTGGCTGGGAGCGGATATTGGCCTCCCGTTTTAACCGAGTGGTTGGCCAAAATAAAAGCACCTCTTGACGGGCGCAAGACTATTGGTGACAAAACCATGAATTTCGTTGCGTGTCTCGTCAAAAGGTTGCTTGTTATCGACCCAACGCGTTGTCTTTTGATGACGCTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAA（673bp）

將本實(shí)驗(yàn)所得的ITS序列輸入到NCBI上的GenBank上Blast后進(jìn)行同源率分析，結(jié)果顯示1號(hào)與春飛蓬同源率為99%，我們可以認(rèn)定為該植物即為春飛蓬；2號(hào)與一年蓬同源率為99%，可以判定該植物為一年蓬。故可從分子方面對(duì)兩者進(jìn)行區(qū)分。

2.4總黃酮含量測(cè)定

2.4.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0mg，置100mL量瓶，加70%乙醇定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.4.2供試品溶液的制備

取春飛蓬粗粉約2.5g，精密稱定后加入14倍量70%乙醇加熱回流提取3次（1h，1h，1h），3次回流后合并濾液，使其在水浴上蒸干溶劑，最后用70%乙醇定容至500mL量瓶中，即得［3］。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL量瓶，分別加入70%乙醇2mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，精密加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，混勻，放置6min，精密加入氫氧化鈉試液2mL，搖勻，放置10min，用70%乙醇稀釋至刻度。以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照品濃度為縱坐標(biāo)（Y），溶液吸光度值為橫坐標(biāo)（X），作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y＝0.0684X＋0.0028，R＝0.9999，結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品濃度在5～50μgmL范圍內(nèi)與溶液的吸光度之間呈良好的線性關(guān)系［4］。

2.4.4計(jì)算總黃酮含量

根據(jù)紫外-可見(jiàn)分光光度法，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出濃度，計(jì)算其總黃酮含量。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，春飛蓬中總黃酮含量約為0.59%。

2.5燈盞花乙素含量測(cè)定

對(duì)照品與供試品溶液均按2010版藥典方法制備［5］，按照2010版中國(guó)藥典燈盞花乙素含量測(cè)定方法測(cè)定［5］，結(jié)果未測(cè)出燈盞花乙素。

3　討論

春飛蓬原產(chǎn)北美，是一種外來(lái)入侵植物，最近幾年在中國(guó)南方城市發(fā)現(xiàn)，但在山東境內(nèi)發(fā)現(xiàn)屬首次報(bào)道。因其植物形態(tài)與一年蓬極近似，常會(huì)被誤認(rèn)為一年蓬?？上葟男螒B(tài)特征如葉先端的形態(tài)、花的開(kāi)放特點(diǎn)和花期以及毛茸等幾個(gè)方面仔細(xì)加以區(qū)別。再者可以通過(guò)分子鑒定方法進(jìn)一步區(qū)別。

通過(guò)對(duì)春飛蓬進(jìn)行初步鑒定研究，表明其粉末中主要顯微特征有花粉粒、多細(xì)胞非腺毛、螺紋導(dǎo)管、表皮細(xì)胞及不定式氣孔、纖維、冠毛、花藥碎片和莖部薄壁細(xì)胞等；從花粉粒掃描電鏡圖可以看出，春飛蓬花粉粒比一年蓬花粉粒的直徑小，且外壁紋飾的齒狀突起更稀疏、更短鈍；得到了春飛蓬的ITS序列；紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)得春飛蓬全植株中總黃酮含量為0.59%；燈盞花乙素未檢測(cè)出。

資料報(bào)道全世界飛蓬屬植物種類共計(jì)200余種，其中經(jīng)過(guò)研究的有30多種［6］，我國(guó)對(duì)飛蓬屬植物研究較深入的只有短亭飛蓬（Erigeronbreviscapus（Vant）Hand.Mazz）［7］，對(duì)同屬其他植物的研究均較少且不深入，總體看來(lái)，該屬植物大多含有黃酮、甾醇、萜類、揮發(fā)油和咖啡酞類等化合物［8］。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明春飛蓬含有黃酮類化合物，有理由推測(cè)其具有一定的資源利用價(jià)值，有必要對(duì)其開(kāi)展較系統(tǒng)的化學(xué)成分、藥理等方面的研究。

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BiologicalidentificationandchemicalconstituentsanalysisofinvasiveplantErigeronphiladelphicusL.

WANGHui，ZHAORui，HUANGLu-jun，ZHANGShi-yao，WANGQi，XULing-chuan*

（ShandongUniversityofTraditionalChinesemedicine，Jinan250355，China）

Abstract：Weuseoriginidentification，microscopeidentification，moleculeidentification，UVandHPLCtopreliminarilyanalyzechemicalconstituentsofthealieninvasiveplantErigeronphiladelphicusL.WealsocomparepollengrainandDNAsequencebetweenErigeronphiladelphicusL.anditssimilarplantErigeronannuus（L）Pers.ResultsshowthatpredominantmicroscopiccharactersofE.PhiladelphicusL.powderarepollengrain，infinitivestomata，multi-cellnon-glandularhairs，pappus，vessel，etc.Formdistinctionoftheirpollengrainsissignificant.ThedifferenceoftheirDNAsequenceisobvious.TotalflavonoidscontentofErigeronphiladelphicusL.is0.59%andwedonotfinditsbreviscapine.Keywords：ErigeronphiladelphicusL.；microscopicidentification；totalflavones；resourceutilization

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026（2016）01-0021-04

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.004

收稿日期：2015-07-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)專項(xiàng)基金（201407002）

作者簡(jiǎn)介：王輝（1990－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴?、生藥資源及質(zhì)量控制與資源開(kāi)發(fā)利用。Email：m15216440087＿1＠163.com。

*通訊作者，徐凌川（1962－），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯幹兴庂|(zhì)量控制、資源開(kāi)發(fā)利用及藥用真菌研究與應(yīng)用。Email：xulingchuan518＠sina.com。