王婷婷，趙敏，王岱杰，鄭媛媛，任漢書，耿巖玲*

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東　濟(jì)南　251100；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測試中心，山東　濟(jì)南　250014；3.廣饒縣中醫(yī)院，山東　東營　370523）

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

王婷婷1，趙敏1，王岱杰2，鄭媛媛3，任漢書3，耿巖玲2*

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南251100；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測試中心，山東濟(jì)南250014；3.廣饒縣中醫(yī)院，山東東營370523）

摘要：建立了松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制方法。采用柱色譜和高速逆流色譜聯(lián)用對松果菊苷進(jìn)行分離制備，采用質(zhì)譜、紫外、紅外和核磁等方法對松果菊苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。經(jīng)國內(nèi)8個(gè)有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值為99.15%，不確定度值為0.66%（置信度95%），達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求，可用于松果菊苷檢測和相關(guān)產(chǎn)品的分析測試和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：松果菊苷；標(biāo)準(zhǔn)樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值

肉蓯蓉（HerbaCistanche）為列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，又名金筍、地精，具有補(bǔ)腎壯陽、填精補(bǔ)髓、養(yǎng)血潤燥和悅色延年等功效，在抗老防衰類方劑中僅次于人參占第2位［1－2］，具有極好的藥用價(jià)值，素有“沙漠人參”之稱［3］?，F(xiàn)代研究表明，其所含化學(xué)成分主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類和木脂素類［4－5］。松果菊苷（圖1）是苯乙醇苷類化合物，是肉蓯蓉中的主要化學(xué)成分，也是該藥材質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)性成分，該成分具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)以及調(diào)節(jié)免疫等多種功能［6－7］。市場上銷售的松果菊苷對照品差異很大，而且沒有權(quán)威的定值核準(zhǔn)，使用起來準(zhǔn)確性不高。為了保證松果菊苷檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，解決肉蓯蓉產(chǎn)品分析及質(zhì)控所面臨的難題，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了符合國標(biāo)要求的松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制并獲得國家標(biāo)準(zhǔn)樣品的批號。

圖1　松果菊苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical　structure　of　Echinacoside

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器

中壓制備色譜儀（美國ISCO公司）；EMC-360C高速逆流色譜儀（北京艾美林科技有限公司）；Waterse2695高效液相色譜（美國Waters公司）；Agilent6520Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Aglient公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Vertex70紅外光譜儀（德國Bruker公司）；INOVA600mHz核磁共振波譜儀（美國Varian公司）。

1.2原料與試劑

肉蓯蓉（山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院）；聚酰胺，100～200目（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為色譜純，乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮等均為分析純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

1.3樣品制備

1.3.1松果菊苷粗提物的提取

藥材2.5kg粉碎，用70%乙醇回流提取3次，每次2h。將提取液進(jìn)行合并，減壓濃縮至一定體積，置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)至無明顯醇味。先用石油醚去除脂溶性成分，然后用正丁醇進(jìn)行萃取，得正丁醇部分浸膏。

1.3.2松果菊苷的富集

浸膏加水稀釋，?用聚酰胺柱色譜分離，水、乙醇為流動(dòng)相洗脫，收集25%乙醇洗脫液，蒸干得到初步粗提物53.1g；取20g樣品通過中壓制備色譜以C18為填料進(jìn)行二次富集，甲醇-0.5%醋酸水溶液（30：70，V/V）為流動(dòng)相，流速為20mL/min，收集含松果菊苷色譜分離峰，凍干得富集后的提取物8.5g，備用。

1.3.3高速逆流色譜分離

按照經(jīng)過篩選的溶劑系統(tǒng)將乙酸乙酯-正丁醇-水（5：0.5：5，V/V）混合，分層后靜置0.5h后將上下兩相分開，等體積的上下相將260mg樣品充分溶解；將溶劑系統(tǒng)的固定相（上相）用泵以l5mL/min流速泵入；開啟速度控制器，順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)；800r/min且旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定后以lmL/min的流速泵入流動(dòng)相（下相），待流動(dòng)相開始流出逆流色譜且檢測器讀數(shù)穩(wěn)定后進(jìn)樣，根據(jù)紫外吸收進(jìn)行樣品收集，合并相同組分，除去有機(jī)溶劑，凍干，得到144mg高純度單體。

1.4純度分析方法

等度液相分析：色譜柱C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇：水（0.5%甲酸）（30：70，V/V）。流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：30min；檢測波長：326nm。

梯度液相分析：色譜柱C18（250mm×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.5%甲酸水。梯度洗脫：0～20min，30%A；20～35min，30%A～100%A。流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：326nm。

薄層鑒別條件：乙酸乙酯：甲醇：甲酸（7：1：2，V/V）和乙酸乙酯：丙酮：甲酸（4：1：1，V/V），熒光和硫酸乙醇顯色劑兩種方法分別檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物純度。

質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓4.0kV，普氮：10L/min，溫度：300℃，掃描范圍為m/z＝100～1000。

1.5結(jié)構(gòu)鑒定

通過檢測分子量、最大吸收波長和紅外光譜的吸收情況，結(jié)合核磁共振手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.6均勻性檢驗(yàn)

參考GB/T15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則要求［8］，隨機(jī)順序抽樣進(jìn)行檢測。從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取10瓶樣品，按1-3-5-7-9-2-4-6-8-10、2-4-6-8-10-1-3-5-7-9、10-9-8-7-6-5-4-3-2-1共3個(gè)順序進(jìn)行隨機(jī)抽樣，每瓶稱取3份質(zhì)量分別為0.2mg的松果菊苷，用甲醇溶解并過微孔濾膜，采用等度液相條件分析，方差分析法判斷均勻性。

1.7穩(wěn)定性檢驗(yàn)

以甲醇和乙腈為溶劑，檢測目標(biāo)化合物在這兩種溶劑中的穩(wěn)定狀況。樣品置于2～8℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行保存，在兩年內(nèi)每6個(gè)月進(jìn)行一次取樣測定，以高效液相色譜法測定5次的平均值為準(zhǔn)，用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析［8］，觀察其穩(wěn)定性。

1.8定值

采用8個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方法［8］，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室3瓶，高效液相色譜法平行測定2次，采用峰面積歸一化法計(jì)算。

2　結(jié)果與討論

2.1純度分析

對獲得的松果菊苷樣品進(jìn)行等度和梯度兩種液相檢測方式分析，采用二極管陣列檢測器對其進(jìn)行全波長3D模式掃描，從譜圖上看未見明顯的雜質(zhì)，可以看出目標(biāo)物具有很高的純度。在326nm下進(jìn)行檢測，扣除溶劑峰后進(jìn)行面積歸一化定量分別為99.10%和99.12%。從薄層色譜圖可以看出，乙酸乙酯：甲醇：甲酸（7：1：2，V/V）和乙酸乙酯：丙酮：甲酸（4：1：1，V/V）展開體系Rf值分別為0.62和0.46，符合化合物薄層測試的范圍要求，熒光和硫酸乙醇顯示樣品純凈。多種方式的聯(lián)合檢驗(yàn)可判斷出目標(biāo)物純度高，雜質(zhì)含量較少。

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)單體化合物鑒定的常規(guī)手段，研制過程采用UV、IR、MS和NMR相結(jié)合的方法對松果菊苷樣品進(jìn)行鑒定，數(shù)據(jù)如下：

表1　松果菊苷的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑DMSO）Table　1　1H-NMR　data　of　Echinacoside（DMSO）

表2　松果菊苷的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑DMSO）Table　2　13C-NMR　data　of　Echinacoside（DMSO）

續(xù)表2

以上結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］進(jìn)行比較，確定該物質(zhì)為松果菊苷。

2.2均勻性檢驗(yàn)

獲得的松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性通過F檢驗(yàn)，分析其和正態(tài)分布的符合狀況并進(jìn)行評判，結(jié)果見表3～5。

表3　均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)（%）Table　3measuring　data　of　homogeneity　test（%）

表4　每瓶的平均值、方差和測量次數(shù)Table　4mean　value，variance　andmeasurement　times　of　each　bottle　sample

表5　均勻性研究的方差分析Table　5　Variance　analysis　of　homogeneity　test

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可由MSwithin計(jì)算

均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb＝sbb＝0.01。

計(jì)算結(jié)果組間、組內(nèi)分別為υ1＝9、υ2＝20，查F臨界值表可知F0.05（9，20）＝2.94，由于F＝MSamong/MSwithin＝2.21＜F0.05（9，20），所以本樣品是均勻的。

2.3穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性是用來描述標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值隨時(shí)間變化的情況，標(biāo)準(zhǔn)樣品在規(guī)定的條件下儲(chǔ)存，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，其描述的性能數(shù)值應(yīng)保持在規(guī)定的限量范圍內(nèi)。

表6　穩(wěn)定性檢驗(yàn)測量數(shù)據(jù)Table　6measuring　data　of　stability　test

斜率可以用下式計(jì)算

截距由下式計(jì)算

直線上的點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由下式計(jì)算

取其平方根s＝0.03，與斜率相關(guān)的不確定度用下式計(jì)算

自由度為n－2和P＝0.95（95%置信水平）的分布t因子t0.95，n－2＝3.182。

由于

｜b1｜＜t0.95，n－2·s（b1）＝3.182×0.002＝0.0064。

即︱b1︱＜0.0064，斜率的變化不顯著，即松菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品在兩年內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性誤差在允許范圍內(nèi)。

松果菊苷樣品兩年有效期內(nèi)穩(wěn)定性的不確定度為：u＝sb·t＝0.002×24＝0.048。

擴(kuò)展不確定度ults＝2u＝0.10。

2.4定值

定值是指采用技術(shù)上有效的方法，確定樣品的一個(gè)或多個(gè)特征值的程序。采用高效液相色譜峰面積歸一化法計(jì)算出松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度，定值結(jié)果見表7。

表7　松果菊苷定值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表Table　7　Statistical　analysis　of　Echinacoside　certification　results

3　結(jié)論

根據(jù)GB/T15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則及天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制規(guī)范，本實(shí)驗(yàn)室開展了松果菊苷國家實(shí)物標(biāo)樣的研制，并對獲得的目標(biāo)樣品按照要求進(jìn)行了檢測，產(chǎn)品特性符合天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的規(guī)范要求。研制的松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)樣品可以解決目前肉蓯蓉藥材及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測的準(zhǔn)確性難以保證的問題，同時(shí)為檢測結(jié)果提供量值保證。

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［8］GB/T15000.3-2008，標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法［S］.

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PreparationofthecertifiedreferencematerialofEchinacoside

WANGTing-ting1，ZHAOmin1，WANGDai-jie2，ZHENGYuan-yuan3，RENHan-shu3，GENGYan-ling2*

（1.ShandongAgricultureandEngineeringUniversity，Jinan251100，China；2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.GuangraoCountyTraditionalChinesemedicineHospital，Dongying370523，China）

Abstract：WepresentedpreparationtechniqueofthecertifiedreferencematerialforEchinacoside.Weemployedcolumnchromatographyandhigh-speedcountercurrentchromatographytoseparateandprepareEchinacoside，andmS，UV，IRandNMRtoelucidateitschemicalstructure.Wealsocheckeditshomogeneityandstability.Itwasthencooperativelycertifiedthrougheightdomesticqualifiedlaboratories.Resultsshowthatithascertifiedvalueof99.15%，expandeduncertaintyof0.66%（correspondingtoconfidencecoefficientof95%）.Thisdemonstratesthatitconformswithtechnicalrequirementsonacertifiedreferencematerial，soitcanbeappliedtoEchinacosidedetectionandanalysisandtestandqualitycontrolofrelativeproducts.

Keywords：Echinacoside；certifiedreferencematerial；homogeneity；stability；certification

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026（2016）01-0014-07

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.003

收稿日期：2015-07-22

基金項(xiàng)目：2013國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310243）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GZX219003）

作者簡介：王婷婷（1986－），女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。Email：383766725＠qq.com

*通訊作者，耿巖玲（1973－），女，副研究員，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取分離及標(biāo)準(zhǔn)樣品制備。Email：gengyanling＠126.com