楊惠娟，王 景，黃化剛，史宏志

生態(tài)條件對(duì)植物的影響是巨大的，同一品種在不同生態(tài)條件下會(huì)有不同的表型和生理反應(yīng)。煙草是一種生態(tài)適應(yīng)性較廣泛的作物，在北緯60°與南緯40°間都有種植，且生長(zhǎng)具有地域特點(diǎn)。煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量受生態(tài)影響較大，相同的品種在不同的生態(tài)環(huán)境下的生長(zhǎng)狀況各異，因此，根據(jù)當(dāng)?shù)靥攸c(diǎn)選育的煙草品種能夠更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件，具有較好的煙葉品質(zhì)［1－2］。貴州畢節(jié)屬北亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，夏無(wú)酷暑，冬無(wú)嚴(yán)寒，季風(fēng)氣候比較明顯，降雨量較為充沛、河南寶豐屬暖溫帶，為半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，以春旱多風(fēng)、夏熱多雨、秋溫氣爽、冬寒少雪為特征［3－4］。2個(gè)地區(qū)都是主要的煙葉產(chǎn)區(qū)，都能夠生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的煙葉，但其內(nèi)在品質(zhì)有很大差別，風(fēng)格截然不同。氣候?qū)χ参锷L(zhǎng)的影響是通過(guò)影響植物的基因表達(dá)繼而影響內(nèi)在代謝水平，最終表現(xiàn)出對(duì)于不同氣候的不同生長(zhǎng)特性。蛋白質(zhì)能體現(xiàn)生命有機(jī)體的生理代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，蛋白質(zhì)組是一個(gè)生命有機(jī)體所有蛋白質(zhì)序列和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的總和，生命的特征是通過(guò)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)之間的相互作用體現(xiàn)出來(lái)的。蛋白質(zhì)組學(xué)是以基因組編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，在生物個(gè)體不同的發(fā)育時(shí)期及不同的組織、器官等水平研究蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、修飾等，在蛋白質(zhì)的水平上探索蛋白質(zhì)的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制。其理論和方法已滲透到植物遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、植物發(fā)育生物學(xué)等諸多學(xué)科研究領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)相關(guān)的生物科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［5－6］。不同條件下的蛋白質(zhì)組表達(dá)是有差異的，這造成了不同條件下各個(gè)生理活動(dòng)的千差萬(wàn)別。那么，在蛋白質(zhì)組水平探究植物對(duì)氣候的響應(yīng)是研究基因環(huán)境互作機(jī)制的現(xiàn)代化手段之一。畢納1號(hào)是畢節(jié)煙區(qū)自育的品性優(yōu)良烤煙品種，尤其適應(yīng)畢節(jié)地區(qū)的氣候特征。因此，為了研究烤煙對(duì)不同氣候響應(yīng)的分子機(jī)制以及貴州、河南兩地的氣候條件下烤煙的代謝差異的分子基礎(chǔ)，本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段對(duì)同一烤煙品種在兩地氣候條件下的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異進(jìn)行了研究，篩選出響應(yīng)氣候變化的顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并進(jìn)行相關(guān)分析，旨在為闡明植物對(duì)氣候的響應(yīng)途徑及分子變化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 品種及試驗(yàn)設(shè)置

煙草品種為畢納1號(hào)，試驗(yàn)地設(shè)置在貴州畢節(jié)與河南寶豐。試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，整個(gè)煙株生長(zhǎng)期以營(yíng)養(yǎng)液澆灌培養(yǎng)，每3～5 d給予1次新鮮營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液配方為:10 mmol·L－1KNO3;2 mmol·L－1(NH4)2SO4;1 mmol·L－1KH2PO4;1.5 mmol·L－1K2SO4;2 mmol·L－1CaCl2;2.5 ×10－1mmol·L－1MgSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1KCl;1.25 ×10－2mmol·L－1H3BO3;1 ×10－3mmol·L－1MnSO4;1 × 10－3mmol·L－1ZnSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1CuSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1(NH4)6Mo7O24;1 ×10－1mmol·L－1Fe-EDTA。待煙葉進(jìn)入旺長(zhǎng)期，選取中部葉長(zhǎng)為60 cm左右的葉片，混合取樣，液氮凍存。

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

將樣品用液氮研磨至粉末，TCA/丙酮溶液(1∶9)沉淀過(guò)夜，離心 10 000 r·min－1，45 min，去除上清液，加入丙酮溶液，離心10 000 r·min－1，45 min，4℃去除上清液，重復(fù)2次?？諝飧稍?。按10∶1加入蛋白裂解液，裂解液成分包括8 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，4%CHAPS，2%IPG 緩沖液(pH 3 ～10)和 30 mmol·L－1二硫蘇糖醇(DTT)。冰浴超聲破碎(80 W，超聲10 s，間歇15 s，共 10 次)，離心 10 000 r·min－1，30 min，4℃。上清液用0.22 μm濾管過(guò)濾，并使用 Bio-Rad protein assay reagent定量，－80℃低溫保存。

1.3 雙向電泳及圖譜分析

雙向電泳等電聚焦步驟按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)(Amersham Biosciences)說(shuō)明書進(jìn)行。將100 μg的蛋白質(zhì)樣品溶于500 μL的上樣緩沖液上樣于24 cm的電解質(zhì)膠條中(pH 3～10，Non-Liner，Amersham Biosciences)，等電聚焦的程序設(shè)置為:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h。結(jié)束后將IEF膠條放入平衡緩沖液(6 mol·L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0.05 mol·L－1Tris pH 8.8，1%DTT)中孵育15 min，再將膠條轉(zhuǎn)入另一平衡緩沖液中(6 mol·L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0.05 mol·L－1Tris pH 8.8，2.5%碘乙酰胺)中，孵育15 min后。平衡結(jié)束將膠條轉(zhuǎn)移至15%聚丙烯酰胺SDS分離膠上，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，于15℃進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(Ettan DALT six electrophoresis unit，Amersham Biosciences)。電泳結(jié)束以銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行快速銀染色，采用高清晰度圖像掃描儀(PowerLook 2100 xl－USB，UMAX)掃描凝膠，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜用 ImageMaster 2D Platinum 6.5(GE Healthcare)軟件進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)表達(dá)比值Ratio(打頂后/打頂前)大于1.50或小于－1.50的蛋白質(zhì)點(diǎn)作為差異點(diǎn)。

1.4 膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽

將膠粒切碎后轉(zhuǎn)入EP管中，加入200～400 μL 100 mmol·L－1NH4HCO3/30%ACN 脫色液(銀染:加入30 ～50 μL 30 mmol·L－1K3Fe(CN)6∶100 mmol·L－1Na2S2O3=1∶1 脫色液)，清洗脫色至透明，吸棄上清液，加入 100 mmol·L－1NH4HCO3，室溫孵育15 min。吸棄上清液凍干，之后加入5 μL 2.5 ～10 mg·L－1測(cè)序級(jí) Trypsin(Promega)溶液(酶與被分析蛋白質(zhì)質(zhì)量比一般為1∶20～1∶100)，37℃反應(yīng)過(guò)夜，20 h左右;吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，原管加入 100 μL 60%ACN 和 0.1%TFA，超聲15 min，合并酶解液凍干;若有較多鹽分，則用Ziptip(millipore)進(jìn)行脫鹽。

1.5 質(zhì)譜分析

凍干后的酶解樣品，取2 μL 20%乙腈復(fù)溶。取1 μL溶解樣品，直接點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取0.5 μL過(guò)飽和 CHCA基質(zhì)溶液(溶劑為50%ACN0.1%TFA)點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥。樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽并用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer)進(jìn)行測(cè)試分析，激光源為355 nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級(jí)質(zhì)譜(MS)掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)累計(jì)疊加2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。

1.6 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

使用4800 MALDI-TOF/TOF蛋白質(zhì)組學(xué)分析器 分 析 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City， CA，USA)，運(yùn)用 GPS ExplorerTM software Version 3.6(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA) 在MASCOT 搜索引擎(Version 2.2;Matrix Science，London，UK)中進(jìn)行蛋白質(zhì)和肽段鑒定。查詢參數(shù)如下:NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，煙草屬(2013，11，27)，胰蛋白酶消化，MS(一級(jí)質(zhì)譜)和MS/MS(二級(jí)質(zhì)譜)最大容許誤差范圍為100×10－6，肽片段相對(duì)分子質(zhì)量最大容許誤差范圍為±0.4。選取質(zhì)譜查詢中蛋白質(zhì)及離子置信區(qū)間均大于99%為鑒定信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 寶豐與畢節(jié)氣候條件下烤煙葉片蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜

通過(guò)對(duì)兩地烤煙葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離，取得蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜如圖1所示。經(jīng)軟件分析共得明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)12個(gè)，編號(hào)如圖1中阿拉伯?dāng)?shù)字所示。編號(hào)為 561，551，795，791，1 320，1 334，1 377與1 184的8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在畢節(jié)氣候下的樣品中高表達(dá)(寶豐/畢節(jié)比值小于－1.50)，編號(hào)為880，570，1 421與1 551的4個(gè)蛋白質(zhì)在河南氣候下的葉片中高表達(dá)(寶豐/畢節(jié)比值大于1.50)。

圖1 寶豐與畢節(jié)兩地氣候條件下生長(zhǎng)的煙草葉片蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜Fig.1 Comparison of protein expression profiles between tobacco leaves grown under different climate conditions in Baofeng and Bijie

2.2 寶豐與畢節(jié)氣候條件下烤煙葉片差異蛋白質(zhì)的鑒定

對(duì)所得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜和信息學(xué)分析，除去冗余蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，功能信息如表1所示。其中795與791，561與551經(jīng)鑒定分別為同一蛋白質(zhì)，且各項(xiàng)鑒定得分均較高，可能為同一蛋白質(zhì)的不同電荷形式。3個(gè)在畢節(jié)樣品中高表達(dá)的蛋白質(zhì)為甘油醛三磷酸脫氫酶(561)、O－乙酰絲氨酸硫解酶(791)和光合系統(tǒng)Ⅱ23 kD放氧復(fù)合蛋白質(zhì)(1 184)。3個(gè)在寶豐樣品中高表達(dá)的樣品為質(zhì)體脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)(880)、乙醇脫氫酶(570)和液泡ATP酶G亞基(1 551)。

表1 寶豐與畢節(jié)種植畢納1號(hào)煙草鑒定所得的葉片差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 1 Identification and annotation of the differentially expressed proteins in tobacco leaves of Bina1 grown in Baofeng and Bijie

3 結(jié)論與討論

以畢納1號(hào)為材料，選取氣候差異明顯的貴州畢節(jié)和河南寶豐進(jìn)行試驗(yàn)，且整個(gè)生長(zhǎng)季以營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，消除了烤煙生長(zhǎng)的土壤差異因素，可以準(zhǔn)確地反映出同一烤煙品種在截然不同的兩種氣候條件下生長(zhǎng)的葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。

通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)譜表達(dá)分析，鑒定出差異蛋白質(zhì)12個(gè)，經(jīng)信息學(xué)分析，明確有生物信息學(xué)信息的蛋白質(zhì)為6個(gè)。對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析表明，植物在不同的氣候條件下有不同的生理反應(yīng)，但僅個(gè)別的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變化即對(duì)氣候做出響應(yīng)，而絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)并不會(huì)有明顯的表達(dá)差異。這也說(shuō)明植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程是某些關(guān)鍵的因子在起作用，而不是整個(gè)生理過(guò)程發(fā)生巨大的變化。本試驗(yàn)鑒定所得的3個(gè)在畢節(jié)樣品中高表達(dá)的蛋白質(zhì)為甘油醛三磷酸脫氫酶、O－乙酰絲氨酸硫解酶和光合系統(tǒng)Ⅱ23 kD放氧復(fù)合蛋白質(zhì)，尤其是甘油醛三磷酸脫氫酶與O－乙酰絲氨酸硫解酶在畢節(jié)葉片中表達(dá)量分別是寶豐樣品中的2.64與2.63倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于差異蛋白質(zhì)篩選的1.5倍的標(biāo)準(zhǔn)。另外，3個(gè)在寶豐樣品中高表達(dá)的蛋白質(zhì)為質(zhì)體脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)、乙醇脫氫酶和液泡ATP酶G亞基，表達(dá)量差異也都在2倍上下，表明這些蛋白質(zhì)的表達(dá)具有顯著的差異性。

從功能上分析，甘油醛三磷酸脫氫酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，ATP的生成即在該酶的控制下進(jìn)行，控制著能量合成的多少;O－乙酰絲氨酸硫解酶催化半胱氨酸合成的最后一步，與半胱氨酸的含量密切相關(guān);光合系統(tǒng)Ⅱ23 kD放氧復(fù)合蛋白質(zhì)是光合系統(tǒng)Ⅱ外周蛋白質(zhì)中的1個(gè)，對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ放氧活力的維持起重要作用［7－9］。這3個(gè)蛋白質(zhì)在貴州葉片樣品中高表達(dá)，代表其參與的相應(yīng)的代謝活動(dòng)旺盛，提示在貴州氣候下生長(zhǎng)的煙草葉片糖酵解代謝生產(chǎn)能量高，半胱氨酸合成旺盛以及光合系統(tǒng)Ⅱ的放氧活性較高。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同的氣候條件對(duì)煙草葉片蛋白質(zhì)表達(dá)影響最大的就是煙葉糖代謝途徑、呼吸代謝、光合途徑等相關(guān)的酶類［10－11］，這與本研究有相同之處。

與之相比，在寶豐煙葉樣品中，質(zhì)體脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)、乙醇脫氫酶和液泡ATP酶G亞基3個(gè)蛋白表達(dá)量都高于畢節(jié)樣品中的表達(dá)量，且3個(gè)蛋白質(zhì)均為脅迫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，質(zhì)體相關(guān)蛋白質(zhì)也稱作原纖維蛋白質(zhì)，脅迫條件下在茄科植物葉片中會(huì)大量積累。液泡ATP酶主要在鹽漬、干旱條件下受到誘導(dǎo)且起重要作用，而乙醇脫氫酶更是在各種非生物脅迫條件下如鹽、澇、干旱、低溫下被誘導(dǎo)表達(dá)，主要參與脅迫條件下乙醇酵解途徑，通過(guò)本身的高表達(dá)從而維持乙醇酵解途徑的高效進(jìn)行，以增強(qiáng)植物的抗脅迫能力［12－14］。

有研究表明，植物在溫度超過(guò)適宜生長(zhǎng)溫度10～15℃時(shí)，即產(chǎn)生熱脅迫反應(yīng)［15］，煙草是溫度適應(yīng)性較強(qiáng)的一種作物，具有較強(qiáng)的地域適宜性，因而種植范圍也較廣泛，在不同的生態(tài)環(huán)境中生長(zhǎng)的煙草必然具有其內(nèi)在的適應(yīng)機(jī)制。本研究結(jié)果表明，煙草在畢節(jié)和寶豐的氣候、生態(tài)差別較大的環(huán)境生長(zhǎng)下葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)差異較大，煙草生長(zhǎng)季寶豐光照充足、雨熱同步的氣候特點(diǎn)對(duì)煙草的生長(zhǎng)造成了一定的環(huán)境脅迫，從而誘導(dǎo)多個(gè)脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)大量表達(dá)。而畢節(jié)煙草生長(zhǎng)季光照適中、溫濕均衡的氣候特點(diǎn)則使得煙草的生長(zhǎng)傾向于合成代謝的增強(qiáng)，如能量合成、氨基酸合成以及光合作用的進(jìn)行。研究結(jié)果也說(shuō)明，不同的氣候條件會(huì)改變植物體內(nèi)起主導(dǎo)作用的代謝途徑。比如畢節(jié)的氣候有利于植株的能量及物質(zhì)的合成代謝，而寶豐的氣候則有利于植株的抗性生理代謝。

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