唐井玉，李傳峰，宮曉華，李琦,3，丁明洋,3，陳宗艷，王桂軍，劉光清

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.安徽農業(yè)大學動物科技學院，合肥230036；3.甘肅農業(yè)大學，蘭州730070）

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犬細小病毒SH14株VP2基因原核表達及免疫原性分析

唐井玉1,2，李傳峰1，宮曉華1,2，李琦1,3，丁明洋1,3，陳宗艷1，王桂軍2，劉光清1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.安徽農業(yè)大學動物科技學院，合肥230036；3.甘肅農業(yè)大學，蘭州730070）

摘 要：根據犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV） SH14株基因序列設計引物，采用PCR方法擴增CPV VP2基因，經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，將其克隆至pGEX-4T-1載體，構建重組表達載體pGEX-4T-VP2，經酶切鑒定和測序驗證正確后轉化大腸桿菌BL21中進行誘導表達，應用SDS-PAGE法檢測蛋白的表達。然后，使用純化的重組VP2蛋白制備其兔源多克隆抗體，分別應用蛋白免疫印跡、間接免疫熒光檢測該抗體的免疫原性。結果表明，pGEX-4T-VP2能在大腸桿菌中以包涵體形式高效表達，所制備的兔抗CPV-VP2抗體能與重組蛋白和病毒蛋白發(fā)生特異性反應。本研究為研發(fā)CPV亞單位疫苗、檢測技術及致病機理研究等奠定了物質基礎。

關鍵詞：犬細小病毒；VP2基因；原核表達；免疫原性

犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV）屬于細小病毒科，細小病毒屬，該病毒屬還包括貓泛白細胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）、水貂腸炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）、豬細小病毒（Poecine parvovirus，PPV）、鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）等，它們之間的相似性高達90%[1]。CPV是感染犬的重要病原之一，各種犬均能被感染，主要危害幼犬，特別是2月齡至6月齡幼犬。主要表現為急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高[2]。該病毒于1978年在美國首次發(fā)現，隨后在加拿大、法國、日本、澳大利亞均有報道[3]。我國于1982年最早報道了類似CPV所致的犬出血性腸炎[4]。CPV傳染性強，發(fā)病率和病死率高，給我國養(yǎng)犬業(yè)帶來了嚴重的威脅。

CPV為單股、負鏈線性DNA病毒，無囊膜，基因組全長5.3 kb，主要包含兩個結構蛋白VP1和VP2，兩個非結構蛋白NS1和NS2，分別由開放閱讀框ORF1和ORF2編碼[5,6]。VP2是CPV的免疫原性蛋白，編碼CPV的主要抗原決定簇[7]，其N端及其蛋白轉角結構區(qū)loop1和loop3是重要的B細胞抗原表位區(qū)，可誘導產生中和抗體[6,8]。VP2基因全長1755 bp，編碼584個氨基酸，VP2上幾個關鍵堿基和氨基酸的變化就會改變抗原特性和宿主范圍[9]。隨著VP2蛋白的研究逐步深入，對CPV感染機制和控制病毒的傳播起到重要的作用。

本研究采用原核表達系統(tǒng)表達CPV VP2蛋白，純化后重組蛋白具有良好反應原性，可為CPV單克隆抗體的制備奠定基礎，制備的兔抗VP2抗體具有良好的特異性，為后續(xù)試驗中CPV的檢測及致病機制研究奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料 原核表達載體pGEX-4T-1、CPV SH14株由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所保存；大腸桿菌菌株BL21和Trans5α菌株購自北京全式金生物技術有限公司；限制性核酸內切酶BamHΙ、XhoΙ、LA Taq premix 為TAKARA公司產品；DNA膠回收試劑盒和質粒小劑量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；FITC標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗兔IgG均為康為世紀公司產品；DAB染色試劑盒為博士德公司產品。蛋白定量試劑盒為碧云天公司產品。其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2引物設計與目的基因擴增 根據SH14株基因序列，利用Primer 5.0軟件設計一對特異性引物。上游引物：5'-ACTGGATCCATGAGTGATGGAGCAGT TCAAC-3'（下劃線為Bam HⅠ酶切位點）；下游引物：5'-CCGCTCGAGGTATAATTTTCTAGGTGCTA GTTGA-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點）。PCR產物預計大小約為1770bp。引物由Invitrogen公司合成。以CPV SH14株DNA為模板，PCR擴增目的基因，PCR擴增體系50 μL：LA Taq premix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/mL）2 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.3重組原核表達質粒pGEX-4T-VP2的構建 將PCR產物用膠回收試劑盒純化目的片段。純化后的PCR產物經Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切后進行膠回收，再與經Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切后的pGEX-4T-1載體片段經T4連接酶16℃過夜連接，連接產物轉化至Trans 5α感受態(tài)細胞中，重組質粒經PCR和雙酶切鑒定正確后送至上海華津生物科技有限公司測序，將測序正確的重組質粒命名為pGEX-4T-VP2。

1.4重組原核表達質粒pGEX-4T-VP2的表達 將構建好的重組原核表達質粒pGEX-4T-VP2轉化至BL21感受態(tài)細胞中，挑取單克隆接種于含有100mg/mL氨芐青霉素（Amp+）的5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min過夜震蕩培養(yǎng)，取過夜的菌液按1:100比例接種于新鮮10mL LB培養(yǎng)基，37℃ 220r/min震蕩培養(yǎng)2～3h，待菌液濃度達OD600=1.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37℃誘導4 h后取1 mL菌液離心收集菌體，加入10μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液、40 μL ddH2O懸浮菌體，100℃金屬浴10 min后離心取上清進行SDS-PAGE。

1.5表達產物的純化與定量 收集菌體后加入超聲裂解緩沖液重新懸浮菌體沉淀，加入TE（PH=8.0）新鮮配制的溶菌酶，使其終濃度為1 mg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)30 min。置-20℃反復凍融3次后，超聲裂解（工作1 s間歇3 s）10 min，將破碎后菌液反復凍融3次，10 800×g離心20 min，棄上清。用5 mL包涵體洗液Ⅰ（2 mol/L尿素、0.1%triton100、50mmolNaCl、0.2 mmol EDTA、PBS）將沉淀吹勻洗滌包涵體，5000×g離心20 min，棄上清，重復2次。用5 mL包涵體洗液Ⅱ（2 mol/L尿素、0.1%triton、PBS）洗2次，離心棄上清。用8 mol/L尿素4℃過夜溶解沉淀，10 800×g離心10 min，吸取上清加入透析袋中，分別用不同濃度尿素（6、4、2、1、0 mol/L）透析液梯度透析，每4 h換液一次。透析后液體5000×g離心10 min，上清存于-80℃。并用蛋白定量試劑盒測定其濃度。

1.6兔抗CPV-多克隆抗體的制備 將純化好的VP2蛋白免疫新西蘭大白兔。每次免疫1mg蛋白，首免蛋白和弗氏完全佐劑1:1混合后免疫，兩免和三免蛋白與弗氏不完全佐劑1:1混合后免疫，四免直接免疫純蛋白，每次免疫間隔2 w。四免后1 w心臟采血致死，分離血清。

1.7間接免疫熒光試驗（indirect immunofl uorescece，IFA） 將接種CPV48 h后的CRFK細胞用4%多聚甲醛固定，4℃過夜封閉，用制備的VP2蛋白多克隆抗體為一抗，室溫孵育2 h后，加入FITC標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。同時設未感染CPV的CRFK細胞為陰性對照。

1.8Western blot 將純化后的表達產物進行SDSPAGE電泳后，采用半干法轉印至NC膜，10V，30 min，取出轉印膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入1:200VP2多克隆抗體血清，室溫孵育2 h，加入1:10000稀釋的羊抗兔-HRP二抗，室溫孵育1 h后DAB顯色。

2　結果

2.1VP2基因擴增和重組質粒pGEX-4T-VP2 按照上述方法進行VP2鑒定基因擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見1770bp目的條帶（圖1a）。

該基因片段與pGEX-4T-1載體的重組質粒pGEX-4T-VP2用Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1b所示，雙酶切后出現2條特異性條帶，分別為1770 bp左右和4900 bp左右，pGEX-4T-1空載體則為單一條帶。表明目的基因已插入相應的克隆位點，測序結果進一步證實載體構建成功。

圖1　VP2基因擴增結果及重組質粒pGEX-4T-VP2雙酶切結果Fig. 1 Amplifi cation of CDV VP2 gene and restriction analysis of recombinant plasmid pGEX-4T-VP2M: DNA分子質量標準2k plusⅡ; 1: VP2基因; 2: 陰性對照; 3: pGEX-4T-1雙酶切; 4: pGEX-4T-VP2重組質粒雙酶M: DNA Marker 2k plusⅡ; 1: VP2 gene; 2: Negative control; 3: Restriction enzymes digestion of pGEX-4T-1; 4: Restriction enzymes digestion of pGEX-4T-VP2

2.2重組原核表達質粒pGEX-4T-VP2的表達和純化重組表達載體轉化至BL21，經IPTG誘導4 h時進行SDS-PAGE分析，在90 kDa處有明顯的誘導表達條帶，其相對分子質量與預期一致?？蛰d體轉化菌經誘導后在26 kDa處可表達GST標簽蛋白（圖2a）。

圖2　VP2重組蛋白的SDS-PAGE分析及GST-VP2重組蛋白純化Fig. 2 SDA-PAGE analysis on VP2 recombinant protein and purifi ed of GST- VP2 recombinant proteinM: 蛋白質標準分子量; 1: 未誘導的空質粒重組菌; 2: 誘導的空質粒菌體; 3: 未誘導的重組菌; 4: 誘導的重組菌; 5: 純化后的VP2重組蛋白M: Prestained protein marker; 1: pGEX-4T-1plasmid non-induced by IPTG; 2: pGEX-4T-1 plasmid induced by IPTG; 3: pGEX-4T-VP2 non-induced by IPTG; 4: pGEX-4T-VP2 induced by IPTG; 5: Purifi ed VP2 recombinant protein

對重組蛋白進行純化，純化后得到一條90 kDa的條帶，與預期結果相符（圖2b）。用碧云天公司蛋白定量試劑盒定量分析得到GST-VP2融合蛋白濃度為1.5 mg/mL。 2.4 間接免疫熒光試驗（IFA） CRFK細胞接種CPV 48 h后，用IFA檢測抗原的表達情況。結果顯示，在熒光顯微鏡下可觀察出現特異性熒光（圖3a），陰性對照組無熒光（圖3b），說明所制備的多克隆抗體具有較好的免疫原性。

圖3　間接免疫熒光試驗檢測CPV感染CRFK細胞的結果Fig. 3 Detection result s of CRFK cell with IFAa: 接種CPV的CRFK細胞; b: 未接種CPV的CRFK細胞a: CRFK cell of post infection; b: Normal CRFK cell

2.5重組蛋白的免疫原性檢測 以制備的多抗為一抗，對純化后的重組VP2蛋白進行Western blot 檢測，結果如圖4所示，在目的蛋白大小處出現條帶，表明本試驗中表達的重組VP2蛋白具有良好的免疫原性。

圖4　VP2多抗Western blot鑒定結果Fig. 4 Western blot result of VP2 polyclonal antibodyM: 預染的蛋白標準分子量; 1: VP2蛋白M: Prestained protein Marker; 1: VP2 recombinant protein

3　討論

目前，犬細小病毒防治手段主要為疫苗免疫，用于預防犬細小病毒的疫苗主要有異源滅活苗、異源弱毒苗、同源滅活苗和同源弱毒苗4大類，使得CPV引起的犬的發(fā)病得到了緩和。但CPV近年來變異較快，VP2蛋白第300位氨基酸殘基出現突變頻率最高并且該位點可以導致CPV抗原性發(fā)生改變[10]，而且由于CPV滅活苗和弱毒苗存在各種不足，以及免疫犬仍發(fā)病的情況時常發(fā)生，CPV仍是引起犬死亡的主要病源之一。

CPV從出現到現在30多年的時間里，不斷變化，至今已發(fā)現CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)和CPV-2c等基因型[11]，由于基因型眾多，目前對CPV各毒株之間的地理分布、流行特征等方面尚不清楚。因此我國學者對此進行了大量的研究。Lope T JA等[12]在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達了CPV VP2蛋白。10μg的表達蛋白可使犬獲得良好的免疫效果；Langeveld等[13]合成的位于VP2氨基酸端21個氨基酸內有部分重疊兩段多肽，分別免疫犬，均能產生免疫保護作用；楊德威等[14]將CPV PIREsneo/ VP2基因DNA疫苗免疫犬，可激發(fā)免疫力而沒有致病性；楊玲[15]用大腸埃希氏菌系統(tǒng)成功表達了CPV VP2基因，其表達產物能誘導機體產生中和抗體。因此VP2蛋白對研究CPV疫苗具有重要意義。目前CPV基因工程疫苗研究以VP2蛋白為主，該蛋白能在一定程度上抵抗CPV的攻擊。

目前有不同的載體在原核、真核系統(tǒng)中可以有效進行蛋白表達，本研究采用大腸桿菌為宿主的原核表達系統(tǒng)，具有繁殖快、成本低等優(yōu)點[16]。由于大腸桿菌表達菌株BL21轉化效率相對較低，本試驗先把目的基因與載體連接產物克隆至Trans5α克隆菌株中，篩選出重組質粒后再轉化至表達菌株，最后成功表達VP2蛋白。對表達產物可溶性分析，表達的VP2蛋白以包涵體形式存在于菌體裂解后的沉淀中。GST可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高VP2蛋白表達量作用[17]，而且GST標簽方便純化和切除。

本試驗表達的蛋白表達量高、具有良好的免疫活性，有望為CPV診斷試劑的研制及亞單位疫苗的研發(fā)及ELISA方法的建立提供標準抗原；制備的多克隆抗體具有良好的特異性，且抗體水平較高，為后續(xù)CPV的研究奠定了基礎。

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·研究論文·

PROKARYOTIC EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF VP2 OF CANINE PARVOVIRUS SH14 STRAIN

TANG Jing-yu1,2, LI Chuan-feng1, GONG Xiao-hua1,2, LI Qi1,3, DING Ming-yang1,3, CHEN Zong-yan1, WANG Gui-jun2, LIU Guang-qing1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai, 200241 China; 2. College of Animal Science and Technology, Anhui Agriculture University, Hefei 230036, China; 3. Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China)

Key words:Canine parvovirus; VP2 gene; prokaryotic expression; immunogenicity

Abstract:According to the genome sequence of CPV SH14 strain, a pair of specifi c primers were designed for amplifying VP2 gene in PCR. The resulting PCR product was digested with BamH Ι and Xho Ι and cloned into pGEX-4T-1 vector to obtain the recombinant plasmid pGEX-4T-VP2. Then, pGEX-4T-VP2 was transformed into E.coli BL21 cells with IPTG induction. The expressed products were identifi ed in SDS-PAGE. Polyclonal antibodies against CPV VP2 were prepared with the purifi ed recombinant VP2 by vaccinating rabbits. The rabbit antibodies were used in Western blot and indirect immunofluorescence to detect their reactivity with the expressed VP2. The results showed that the recombinant VP2 expressed in E.coli BL21 cells reacted positively with rabbit polyclonal antibodies. The availability of the recombinant VP2 has laid the solid foundation for development of subunit vaccine, diagnostic methods and pathogenic mechanism research for CPV.

中圖分類號：S852.659.2

文獻標志碼：A

文章編號：1674-6422（2016）01-0038-06

收稿日期：2015-12-01

基金項目：國家自然科學基金（31270194、31300141）；農業(yè)公益性行業(yè)科研專項課題（201303046）

作者簡介：唐井玉，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

通信作者：王桂軍，E-mail：wgj@ahau.edu.cn；劉光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn