宮曉倩，阮寶陽(yáng),2，劉曉敏，張 鵬,2，汪 琪，汪秀會(huì)，周艷君，李澤君，童 武，鄭 浩，童光志，于 海

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000）

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豬流感病毒新型核糖體移碼蛋白PA-X特有序列的原核表達(dá)、純化及鑒定

宮曉倩1，阮寶陽(yáng)1,2，劉曉敏1，張 鵬1,2，汪 琪1，汪秀會(huì)1，周艷君1，李澤君1，童 武1，鄭 浩1，童光志1，于 海1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000）

摘 要：核糖體移碼蛋白PA-X是流感病毒的一種新型蛋白，為了研究該蛋白對(duì)于豬流感病毒的生物學(xué)特性的影響，我們進(jìn)行了PA-X特有序列的原核表達(dá)、蛋白純化及其鑒定。通過(guò)RT-PCR和重疊PCR方法擴(kuò)增PA-X 特有序列的基因，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體，并進(jìn)行菌液PCR和菌液測(cè)序鑒定，鑒定正確后克隆轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，進(jìn)行蛋白表達(dá)及可溶性分析，同時(shí)用鎳柱親和層析法對(duì)其進(jìn)行純化。通過(guò)菌液PCR序列鑒定，PA-X特有序列的原核表達(dá)載體序列正確，編碼框正確。轉(zhuǎn)化BL21后目的蛋白表達(dá)成功，且大多數(shù)為可溶性蛋白。Western blot 結(jié)果表明制備的多克隆抗體具有良好的免疫反應(yīng)性。

關(guān)鍵詞：豬流感病毒；PA-X特有序列；原核表達(dá)；蛋白純化；Western blot

豬流感病毒為正粘病毒科A型流感病毒屬單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，分為8個(gè)節(jié)段。根據(jù)核苷酸長(zhǎng)短，分別將它們命名為8個(gè)基因片段：節(jié)段1 （PB2基因），節(jié)段2（PB1基因），節(jié)段3（PA基因），節(jié)段4（HA基因），節(jié)段5（NP基因），節(jié)段6（NA基因），節(jié)段7（M1基因），節(jié)段8（NS1基因）[1]。同正鏈RNA病毒和DNA病毒相比，負(fù)鏈RNA病毒的主要特點(diǎn)是基因組RNA不具有感染性，不能直接進(jìn)行感染性轉(zhuǎn)錄，而必須將自身攜帶的依賴于RNA的RNA聚合酶導(dǎo)入到細(xì)胞中，才指導(dǎo)第一輪mRNA合成，而且裸露的基因組RNA本身也不能作為模板，只有在與核蛋白（nuclear protein，NP）結(jié)合成復(fù)合物（RNA核蛋白復(fù)合物，RNP）形式時(shí)，才能作為模板起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[2]。PA基因編碼PA蛋白，它與PB2、PB1、NP蛋白以及病毒RNA一起構(gòu)成核糖核蛋白體復(fù)合物（viral ribonucleoprotein complexes，vRNPs），參與病毒的組裝[3]。它的N末端還具有核酸內(nèi)切酶的功能，能夠定位于被感染細(xì)胞的細(xì)胞核，將其前體RNA上的加帽的RNA片段切下來(lái)作為病毒轉(zhuǎn)錄的引物[4-6]。它的C末端可以與PB1蛋白的N末端結(jié)合[7]。

PA-X蛋白是利用PA蛋白的起始密碼子來(lái)啟動(dòng)翻譯，合成出PA蛋白的N末端，然后再通過(guò)+1核糖體閱讀框架移動(dòng)識(shí)別新的開(kāi)放閱讀框X-ORF而生成的一種新型蛋白[8]。PA-X蛋白不是流感病毒的必須部分，但一些研究證明它對(duì)病毒的致病力有著重要的影響[8-10]。為此，本實(shí)驗(yàn)室以1株古典H1N1亞型豬流感病毒[11]為材料，在原核表達(dá)體系中表達(dá)了X-ORF對(duì)應(yīng)的61個(gè)氨基酸殘基的特有序列，以用來(lái)檢測(cè)PA-X蛋白的表達(dá)，為接下來(lái)的致病機(jī)理相關(guān)研究打下重要的基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和病毒 pcold-TF 載體保存于本實(shí)驗(yàn)室；E.coli BL21（DE3）購(gòu)自全式金公司；DH5α購(gòu)自天根；古典H1N1亞型豬流感病毒（A/Swine/ Guangdong/1/2011（H1N1））保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑 RNeasy Mini Kit（250） 購(gòu)自QIAGEN；SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR購(gòu)自invitrogen by technologies；pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)自Agilent Technologies；限制性內(nèi)切酶 Sac I，Pst I購(gòu)自TAKARA公司；DNA Marker購(gòu)自捷瑞公司；Gel Extraction Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；T4 DNA ligase購(gòu)自Biolab公司；IPTG購(gòu)自Merk公司；超濾離心濃縮管購(gòu)自Amicon公司。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì) H1N1亞型豬流感病毒的PA-X蛋白發(fā)生了20個(gè)氨基酸的截短。為了表達(dá)61個(gè)氨基酸的肽段，首先用overlapping PCR的方法使H1N1亞型豬流感病毒的41位氨基酸處的終止密碼子缺失，設(shè)計(jì)引物如下：5'-CCTATGTGGATGGATTCGAA CCAAATGGCTACATTGAG-3'和5'-CTCAATGTA GCCATTTGGTTCGAATCCATCCACATAGG-3'。然后以獲得的突變基因?yàn)槟０澹胦verlapping的方法構(gòu)建X-ORF的基因片段，設(shè)計(jì)引物如下：5'-GGACTGACGAAGGAATCCCAAAG-3'和5'-CTTTGGGATTCCTTCGTCAGTCC-3'，通過(guò)設(shè)計(jì)以上引物，將發(fā)生移碼突變的UUUC基因序列突變?yōu)閁UC，使合成的基因片段只按照X-ORF的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。61肽段對(duì)應(yīng)基因序列的上游引物為X-ORF的上游引物，引入Sac I酶切位點(diǎn)：5'-CGAGCTCGTCAGTCCGAAAGAGGC-3'；下游引物為X-ORF的下游引物，并且引入Pst I酶切位點(diǎn)：5'-AACTGCAGTTACTTCTCTAGACAT-3'。以上引物由上海英駿有限公司合成。

1.2.2基因擴(kuò)增 提取H1N1亞型豬流感病毒的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)，用overlapping PCR的方法擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件均按照pfu的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，并且進(jìn)行膠回收純化。

1.2.3表達(dá)基因的克隆 PCR產(chǎn)物純化后，用Pst I和Sac I進(jìn)行雙酶切，再將pcold-TF載體也分別用Pst I和Sac I進(jìn)行雙酶切。然后在T4 DNA ligase的作用下將目的基因片段與載體連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性樣品送去上海英駿有限公司測(cè)序，序列正確的樣品菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取。

1.2.4陽(yáng)性重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將上面得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）溶源菌中，挑取單個(gè)菌落于氨芐抗性LB培養(yǎng)基中搖菌16 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定出陽(yáng)性結(jié)果后，取20 uL陽(yáng)性菌液與4 mL新的氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基以1:200的體積比例在37℃進(jìn)行活化，每個(gè)樣品做8個(gè)重復(fù)。當(dāng)OD600=0.8時(shí)，加入IPTG進(jìn)行蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)。為了摸索誘導(dǎo)劑的最佳濃度，分別加入終濃度為0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG；為了摸索最佳誘導(dǎo)時(shí)間，15℃搖菌18、24 h，分別收獲菌體。12 000×g高速離心3 min，棄掉上清，再用500 uL PBS重懸菌體，在冰上進(jìn)行超聲波破碎。待菌液變清澈后，12 000×g，4℃，離心20 min，將上清與沉淀分離，并用100 uL PBS將沉淀重懸。將上清與沉淀同時(shí)進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)。同時(shí)，也對(duì)pcold-TF空載體也進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，所有誘導(dǎo)表達(dá)條件與上面描述完全一致。

1.2.5蛋白的純化 通過(guò)鎳柱親和層析方法對(duì)濃度最高的產(chǎn)物進(jìn)行純化。首先配制1×Ni-NTA 結(jié)合緩沖液：50 mmol/L NaH2P04，pH 8.0，300mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑（用于裂解和結(jié)合步驟）；1×Ni-NTA 漂洗緩沖液：50 mmol/L NaH2P04，pH 8.0，300mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑（用于洗脫雜蛋白）；1×Ni-NTA 洗脫緩沖液：50 mmol/ LNaH2P04，pH 8.0，300mmol/LNaCl，250 mmol/L咪唑（用于洗脫目的蛋白）。然后按照說(shuō)明書(shū)的步驟將上清中的蛋白進(jìn)行純化，將洗脫組分分為4部分收集，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析各保存組分，然后按照上面摸索好的誘導(dǎo)表達(dá)條件和純化條件將蛋白進(jìn)行大量表達(dá)和純化。

1.2.6小鼠多抗的制備及Western blot檢測(cè) 將H1N1亞型豬流感病毒接種6 w的Balb/C小鼠，2 w后進(jìn)行第二次攻毒，第二次攻毒d 8采血，并通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清的抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到一定水平時(shí)，以之為一抗，通過(guò)Western blot檢測(cè)上面純化的目的蛋白。

2　結(jié)果

2.1PA-X特有序列對(duì)應(yīng)的基因片段的擴(kuò)增 將以缺失41位氨基酸處的終止密碼子的PA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR得到的重疊產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，然后以之為模板，在X-ORF上下游引物的作用下進(jìn)行overlapping PCR，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，結(jié)果得到了PA-X特有序列對(duì)應(yīng)的183bp基因片段（圖1），并進(jìn)行膠回收純化。

圖1　重疊PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretic profi le of product of overlapping PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～5: PA-X特有序列的PCR產(chǎn)物M: DNA Marker(DL2000); 1-5: PCR products of PA-X-specifi c gene sequence

2.2陽(yáng)性重組載體的菌液鑒定結(jié)果 以菌液中的重組質(zhì)粒為模板，在X-ORF上下游引物的作用下進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果得到了4個(gè)陽(yáng)性克隆（圖2）。取陽(yáng)性克隆樣品進(jìn)行質(zhì)粒的提取，然后將質(zhì)粒測(cè)序，序列結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。

2.3原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析 在不同濃度的IPTG以及不同的誘導(dǎo)時(shí)間條件下對(duì)陽(yáng)性原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行超聲波破碎，分離得到的上清和沉淀分別進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明重組目的蛋白大部分以可溶性的上清形式存在，少量以包涵體的形式存在。IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度大約為0.8mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為24 h時(shí)，目的蛋白可以得到最大程度的表達(dá)（圖3）。表達(dá)的目的蛋白約為7 kDa，標(biāo)簽蛋白大小約為52 kDa，結(jié)果與預(yù)期一致。

圖2　陽(yáng)性重組載體的菌液PCR鑒定電泳圖Fig. 2 Electrophoretic profi le of bacterium solution with recombinant plasmid vectorM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～4:含有PA-X特有序列的重組載體的菌液鑒定M: DNA Marker (DL2000); 1-4: Identifi cation of prokaryotic expression vectors of PA-X-specifi c sequence in E.coli

圖3　誘導(dǎo)24 h的重組蛋白PA-X在上清中的表達(dá)SDSPAGE分析Fig. 3 Expression analysis of PA-X specifi c sequence induced for 24 h in the supernatant of E.coli by SDS-PAGEM: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1～4: IPTG濃度梯度(0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)的重組載體的上清; 5～8: IPTG濃度梯度(0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)的空載體的上清M: Prestained Protein Marker; 1-4: The supernatant of pcold TFPA-X specifi c sequence induced by IPTG at concentration of 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mmol/L; 5-8: The supernatant of pcold TF induced by IPTG at concentration of 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L

圖4　重組蛋白PA-X純化后的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the purifi ed recombinent protein PA-XM: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 純化前的PA-X 重組蛋白; 2: 純化前的pcold TF; 3: 純化后的PA-X 重組蛋白; 4: 純化后的pcold TFM: Prestained Protein Marker; 1: The unpurifi ed PA-X recombinent protein; 2: The unpurifi ed pcold TF; 3: The purifi ed PA-X recombinent protein; 4: The purifi ed pcold TF

2.4重組蛋白的純化鑒定 表達(dá)出的上清中的可溶性蛋白通過(guò)Ni柱純化，結(jié)果顯示洗脫緩沖液第二次洗脫出的目的蛋白純度最高而且濃度最大，之后我們按照摸索好的誘導(dǎo)表達(dá)條件和純化條件將蛋白進(jìn)行大量表達(dá)和純化（圖4）。

2.5重組蛋白的免疫原性鑒定 通過(guò)血凝試驗(yàn)檢測(cè)，二免后d8小鼠血清的抗體效價(jià)達(dá)到28，然后我們用純化并濃縮的PA-X特有序列蛋白和TF空載體表達(dá)的蛋白跑SDS-PAGE膠，再用制得的小鼠血清為一抗，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PA-X重組蛋白和陽(yáng)性血清生成了陽(yáng)性條帶（圖5）。這說(shuō)明表達(dá)的蛋白確實(shí)含有PA-X，反過(guò)來(lái)也證明了接種H1N1亞型豬流感病毒的小鼠產(chǎn)生的抗PA-X的多抗具有免疫反應(yīng)性。

圖5　Western blot檢測(cè)重組蛋白PA-XFig. 5 Western bot analysis of recombinent PA-XM: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: PA-X重組蛋白以陽(yáng)性血清為一抗的Western blot結(jié)果; 2: PA-X重組蛋白以陰性血清為一抗的Western blot結(jié)果; 3: TF空載體以陽(yáng)性血清為一抗的Western blot結(jié)果M: Prestained Protein Marker; 1: Western blot result (positive serum as the primary antibody) of PA-X recombinent protein; 2: Western blot result (negative serum as the primary antibody) of PA-X recombinent protein; 3: Western blot result (positive serum as the primary antibody) of pcold TF protein

3　討論

PA-X蛋白是由Jagger等[8]在2012年發(fā)現(xiàn)的，他們發(fā)現(xiàn)在PA基因中含有一個(gè)保守的序列UCCUUUCGUC，當(dāng)核糖體閱讀框架移動(dòng)到UUU這一密碼子位置時(shí)，會(huì)發(fā)生停頓，由于密碼子的兼并性，UUU和UUC對(duì)應(yīng)著同一個(gè)反密碼子AAG，這很容易造成核糖體往后移碼一個(gè)堿基（+1 ribosomal frameshifting），從而形成一個(gè)新的開(kāi)放閱讀框（X-ORF），編碼一種新的蛋白，命名為PA-X蛋白。PA-X蛋白分子量約為29 kDa， N末端含有與PA蛋白相同的191個(gè)氨基酸殘基，因此也具有核酸內(nèi)切酶的功能，而且與PA蛋白相比，功能可能會(huì)更強(qiáng)。PA-X的C末端則與PA蛋白不同，由X-ORF編碼的61個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為7 kDa。

Jagger 等[8]首次發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白的存在，并且鑒定了PA-X能使1918年的H1N1亞型西班牙大流感病毒的毒力降低。Jiao Hu等[10]的研究成果證明PA-X蛋白可以通過(guò)抑制高致病性禽流感H5N1的復(fù)制，同時(shí)降低宿主的炎性反應(yīng)程度來(lái)降低它的致病力。Khaperskyy等[12]發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白可以抑制宿主的應(yīng)激顆粒（SGs）的產(chǎn)生。所有關(guān)于PA-X的研究綜合表明，PA-X蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的炎性反應(yīng)程度來(lái)間接降低病毒的致病力，當(dāng)PA-X的表達(dá)受到抑制時(shí)，可以促進(jìn)宿主的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，提高病毒的致病力[7]。

大多數(shù)情況下，X-ORF編碼的肽段含有61個(gè)氨基酸殘基，但是2009年甲型H1N1流感病毒、古典H1N1豬流感病毒及H1N2亞型豬流感病毒均表達(dá)41個(gè)氨基酸殘基的短肽，這是由于這些病毒在大多數(shù)流感病毒均有的X-ORF的61位氨基酸處的終止密碼子之前，還有一個(gè)終止密碼子，這一終止密碼子位于第41個(gè)氨基酸處。關(guān)于61個(gè)氨基酸的X蛋白的功能已經(jīng)有相關(guān)報(bào)導(dǎo)[8-10]，但是61肽段的X蛋白和41肽段的X蛋白在功能上有什么不同，目前為止還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)大量表達(dá)并純化了PA-X蛋白特有的序列，為接下來(lái)對(duì)于H1N1亞型豬流感病毒的PA-X蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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·研究論文·

PROKARYOTIC EXPRESSION, PURIFICATION AND IDENTIFICATION OF PA-X-SPECIFIC SEQUENCE OF SWINE INFLUENZA VIRUS

GONG Xiao-qian1, RUAN Bao-yang1,2, LIU Xiao-min1, ZHANG Peng1,2, WANG Qi1, WANG Xiu-hui1, ZHOU Yan-jun1, LI Ze-jun1, TONG Wu1, ZHENG Hao1, TONG Guang-zhi1, YU Hai1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271000, China)

Key words:Swine infl uenza virus; PA-X specifi c sequence; prokaryotic expression; purifi ed protein; Western blot

Abstract:The novel infl uenza A virus protein PA-X is a ribosomal frame-shifting product that modulates the host response and viral virulence. In the present study, PA-X protein was prokaryotically expressed, purified and characterized in order to investigate its biological functions. The PA-X coding gene was amplifi ed in RT-PCR and overlapping PCR. The prokaryotic expression vectors were constructed with the gene recombination technique and verifi ed using bacterium solution PCR and sequencing. The positive clones were transformed into E.coli BL21 (DE3) and the expressed protein was analyzed for its solubility. The PA-X products were purifi ed using nickel column chromatography. The sequences of the plasmids and open reading frames were demonstrated to be completely correct. After transformation, these plasmids expressed the expected proteins with soluble nature. Subsequently, the PA-X protein was purifi ed and used in Western blot to react with the mouse antiserum against the H1N1 swine infl uenza virus. The positive reaction between the PA-X protein and mouse antiserum was observed.

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-6422（2016）01-0032-06

收稿日期：2015-07-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家青年自然科學(xué)基金（31201916）；上海市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（12ZR1453500）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2015JB07）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程科研團(tuán)隊(duì)“動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)”項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：宮曉倩，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

通信作者：童光志，Email：gztong@shvri.ac.cn；于海，Email：haiyu@shvri.ac.cn