汪招雄，歐陽(yáng)金旭，楊玉瑩，楊豐利，江 濤，陳雪嬌

（1. 湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434023；2. 湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州434020）

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規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感疫苗免疫效果調(diào)查

汪招雄1，歐陽(yáng)金旭2，楊玉瑩1，楊豐利1，江 濤1，陳雪嬌1

（1. 湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434023；2. 湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州434020）

摘 要：為了解湖北省規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感疫苗的免疫效果，本研究在2014年1月至12月從湖北省13個(gè)地區(qū)選擇不同規(guī)模化蛋雞場(chǎng)，隨機(jī)采集蛋雞血樣2189份，用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）試驗(yàn)測(cè)定了H9N2亞型禽流感抗體滴度。對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析顯示，1月份到5月份樣本HI抗體滴度平均值呈上升趨勢(shì)，1月份檢測(cè)的樣本抗體滴度最低，為9.26log2， 5月份檢測(cè)的樣本抗體滴度最高，為12.34log2。13個(gè)不同地區(qū)樣本抗體滴度存在一定的差異，抗體滴度最低地區(qū)的平均值為5.76log2，滴度最高地區(qū)為11.58log2。對(duì)不同日齡蛋雞樣本檢測(cè)結(jié)果分析顯示，隨著日齡增長(zhǎng)，樣本平均抗體滴度值呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，蛋雞日齡≤120 d的樣本抗體滴度平均值最低，為10.21log2，300日齡以上的蛋雞樣本抗體滴度平均值最高，為11.31log2。檢測(cè)結(jié)果表明，湖北省規(guī)模化蛋雞場(chǎng)H9N2亞型禽流感的平均抗體滴度值水平總體良好，合格率和優(yōu)秀率較高，但不同地區(qū)、不同日齡和不同月份蛋雞H9N2亞型禽流感抗體存在差異。

關(guān)鍵詞：禽流感；H9N2亞型；蛋雞場(chǎng)；免疫效果

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的傳染性疾病，該病毒屬于正黏病毒科。A型流感病毒的血凝素（HA）與神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原容易變異，已知HA有18個(gè)亞型（Hl～H18系列），NA有11個(gè)亞型（N1～N11系列）[1,2]。H5N1亞型為高致病性禽流感病毒，引起疫情暴發(fā)而已經(jīng)受到人們的重視，而H9N2亞型為低致病性禽流感病毒，但是因?yàn)樗鼈鞑V泛，而且同樣可引起人和動(dòng)物致病，甚至引起疫病的暴發(fā)和流行，其危害不容忽視[3,4]。

H9N2亞型禽流感病毒從1994年開始被發(fā)現(xiàn)時(shí)，就已經(jīng)在中國(guó)大陸的家禽中流行。該型病毒感染性強(qiáng)、傳染范圍廣，本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定具有變異性，不僅能給養(yǎng)禽業(yè)造成損失，也對(duì)人類和低等哺乳類動(dòng)物直接構(gòu)成威脅，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。H9N2亞型禽流感一年四季均可發(fā)生，但通常以冬季和春季較為嚴(yán)重。氣候多變、突變，養(yǎng)殖密度過(guò)大，飼養(yǎng)管理不當(dāng)，有害氣體過(guò)多損害上呼吸道粘膜，都是本病發(fā)生的誘因。該型病毒主要引起蛋雞呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降和蛋品質(zhì)量下降[4,5]。

疫苗作為控制禽流感大流行的一種主要手段，受到各個(gè)國(guó)家的重視，幾乎所有規(guī)模化蛋雞場(chǎng)都進(jìn)行了禽流感疫苗的預(yù)防接種。目前我國(guó)使用的疫苗毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株、Sy株、LG1株、L株、YBF003株、F株、S2株和NJ02株等毒株。但由于氣候、管理和免疫程序、雞群的品種、接種劑量及疫苗質(zhì)量差異等原因，導(dǎo)致各雞群禽流感抗體水平參差不齊[5,6]。本研究在不同時(shí)間對(duì)湖北省不同地區(qū)規(guī)?；半u場(chǎng)隨機(jī)抽樣，并對(duì)H9N2亞型禽流感抗體進(jìn)行了檢測(cè)。本研究的完成不僅可以了解湖北省不同地區(qū)規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感免疫抗體水平，還可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)制定合理的免疫程序，分析可能存在的原因，并提出相關(guān)防控措施建議，對(duì)防控H9N2禽流感的發(fā)生和流行具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料 H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽(yáng)性血清；0.85%生理鹽水、紅細(xì)胞保存液(PBS 液)、3.8%檸檬酸鈉抗凝劑。

1.2方法

1.2.1血液采集及血清制備 對(duì)湖北省不同地區(qū)（安陸、公安、荊門、潛江、石首、松滋、天門、浠水、仙桃、襄陽(yáng)、孝感、應(yīng)城、棗陽(yáng)）規(guī)模蛋雞場(chǎng)隨機(jī)采血，每只翅下靜脈采血2 mL，共采集血液樣本2189份。采集血樣靜置1 h，8000×g 離心 5 min，取上層血清待檢。

1.2.21%紅細(xì)胞懸液制備 用一次性注射器隨機(jī)采取健康非免疫公雞血液，放入加有抗凝劑的離心管中，抗凝劑與全血的比例約為1:2左右，迅速混勻。然后放入離心機(jī)中以 500×g 離心5 min，吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再次在離心管中加生理鹽水，慢慢混合均勻，500×g離心5 min，棄去上清液，按照上述方法反復(fù)操作4～5次，直到上清液澄清透明，最后一次離心后的紅細(xì)胞，棄去上清液，即為紅細(xì)胞泥。吸取 0.1 mL紅細(xì)胞泥，加入9.9 mL的生理鹽水，即為 1% 紅細(xì)胞懸液。

1.2.34單位抗原配制 取出凍干的濃縮抗原，加入2 mL生理鹽水稀釋融化后，測(cè)定抗原效價(jià)，能夠完全引起血凝的病毒最高稀釋度視作抗原的效價(jià)，此稀釋度為1個(gè) HA 單位抗原，以此稀釋度配制4個(gè) HA單位抗原。

1.2.4待檢樣品測(cè)定 根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)的方法及操作規(guī)范對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5結(jié)果判定 在紅細(xì)胞對(duì)照出現(xiàn)完全沉淀、病毒對(duì)照出現(xiàn)完全凝集的情況下，將反應(yīng)板作45度傾斜，從反應(yīng)板背側(cè)觀察。以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當(dāng)被檢血清對(duì)其HI效價(jià)≥6log2時(shí)，判為抗體滴度合格；HI效價(jià)≥9log2時(shí)，判為抗體滴度優(yōu)秀。

2　結(jié)果

2.1不同月份蛋雞場(chǎng)樣本H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)分析 按照不同月份，對(duì)2014年1月至2014年12月2189份蛋雞樣本H9N2亞型禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。2014年12個(gè)月樣本H9N2亞型禽流感抗體滴度平均值較高，均超過(guò)9.01og2，2189份蛋雞樣本H9N2亞型禽流感HI抗體滴度平均值為10.771og2。其中5月份 H9N2亞型禽流感平均抗體滴度值最高，達(dá)到 12.341og2，1月份平均抗體滴度值最低為 9.261og2，并且1月份到5月份呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。其他月份平均抗體滴度介于兩者之間（見表1）。

表1 規(guī)?；半u場(chǎng)不同月份H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)Table 1 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different month

對(duì)2014年12個(gè)月所有樣本H9N2亞型禽流感抗體滴度進(jìn)行了分類，所有月份血樣中禽流感病毒H9N2亞型抗體抗體滴度合格率（HI≥6）均較高，最低的是1月份，為 97.4%，然后是4月份的為99.2%，3月的為99.7%，其他各月平均抗體滴度均為100%；優(yōu)秀率（HI≥9）最低的是 1 月份，為 78.7%，而5、8、9月份的優(yōu)秀率很好，達(dá)到100%（見表2）。

2.2不同地區(qū)蛋雞場(chǎng)樣本H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)分析 對(duì) 13個(gè)不同地區(qū)樣本H9N2禽流感抗體抗體滴度檢測(cè)結(jié)果開展了分析。湖北省不同地區(qū)樣本中，H9N2亞型禽流感抗體滴度平均值最低的來(lái)源于安陸，抗體效價(jià)平均僅為 5.761og2；抗體滴度最高的是來(lái)源于棗陽(yáng)的蛋雞樣本，H9N2禽流感抗體效價(jià)平均為 11.581og2，其他各個(gè)地區(qū)蛋雞血樣的抗體效價(jià)平均值間于這二者之間。除了安陸、潛江和浠水蛋雞樣本外，其他各個(gè)地區(qū)的 H9N2 禽流感抗體效價(jià)平均滴度值均在 9.00log2 以上（見表3）。

各個(gè)地區(qū)采集來(lái)的血液樣本中，來(lái)源于安陸血樣中 H9N2 禽流感抗體合格率（HI≥6）最低，為52.0%，潛江的為75.0%，公安的為93.2%，仙桃的為99.8%，其他的血樣抗體滴度合格率均為100%。安陸的血樣H9N2抗體滴度優(yōu)秀率（HI≥9）最低，僅為24.0%，優(yōu)秀率最高的是來(lái)源于荊門檢測(cè)樣本，高達(dá)98.4%（見表4）。

2.3不同日齡蛋雞場(chǎng)樣本H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)分析 對(duì)不同日齡蛋雞樣本 H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)開展了分析。不同日齡蛋雞血液樣本H9N2亞型禽流感抗體滴度平均值都大于10，抗體滴度較高，日齡不高于120 d的蛋雞樣本 H9N2 禽流感抗平均滴度值最低，為10.47log2，隨著日齡的不斷上長(zhǎng)，樣本的 H9N2 禽流感抗平均滴度值不斷上升，當(dāng)?shù)半u日齡超過(guò)300 d時(shí)，抗體滴度達(dá)到11.31（見表5）。

表2 規(guī)?；半u場(chǎng)不同月份 H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 2 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different month

表3 規(guī)?；半u場(chǎng)不同地區(qū) H9N2 亞型禽流感抗體效價(jià)Table 3 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different area

表4 規(guī)?；半u場(chǎng)不同地區(qū) H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 4 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different area

表5 規(guī)模化蛋雞場(chǎng)不同日齡蛋雞 H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)Table 5 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different layer farms

分析不同日齡蛋雞樣本合格率和優(yōu)秀率可以發(fā)現(xiàn)，不同階段蛋雞的樣本 H9N2 禽流感抗體合格率均在 85.0%以上，隨著日齡的增加，合格率越高。而在蛋雞日齡不高于 120 d時(shí)，H9N2禽流感抗體優(yōu)秀率為 78.5%，日齡超過(guò)300 d H9N2禽流感抗體優(yōu)秀率達(dá)到97.4%（見表6）。

3　討論

歷時(shí)一年對(duì)2014年湖北省13個(gè)蛋雞養(yǎng)殖密集區(qū)（縣、市）規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感病毒滅活疫苗免疫抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同區(qū)域、不同日齡蛋雞和不同月份，H9N2亞型禽流感HI抗體滴度平均值、合格率和優(yōu)秀率均較高。2013年湖北省規(guī)?；半u場(chǎng)H9N2亞型禽流感HI抗體滴度平均值9.191og2，2014年抗體滴度進(jìn)一步上升，達(dá)到了10.771og2，顯示了H9N2亞型禽流感疫苗的免疫的良好效果，該抗體滴度可以保護(hù)蛋雞群免受同型病毒的感染。取得如此良好的免疫效果，主要與養(yǎng)殖企業(yè)加強(qiáng)了防疫意識(shí)有直接的關(guān)系，特別是2013年我國(guó)爆發(fā)了高致病性禽流感，給蛋禽業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖企業(yè)充分認(rèn)識(shí)到防疫的作用，加強(qiáng)了對(duì)優(yōu)質(zhì)疫苗的選擇，制定了合理的免疫程序，認(rèn)真執(zhí)行了防疫措施[5]。

表6 不同日齡蛋雞 H9N2 亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 6 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different layer farms

但是檢測(cè)結(jié)果還顯示，相對(duì)于其月份，1月份樣本H9N2亞型禽流感HI抗體滴度平均值偏低，這可能與冬季來(lái)臨，氣溫降低，雞舍通風(fēng)不暢，雞群免疫力減低等因素有一定的關(guān)系。一方面天氣寒冷會(huì)引起雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，影響疫苗免疫效果，另一方面寒冷季節(jié)會(huì)造成部分養(yǎng)殖企業(yè)減低疫苗密度、延長(zhǎng)H9N2疫苗免疫時(shí)間。冬季為禽流感多發(fā)季，雞群會(huì)面臨更大威脅，因此養(yǎng)殖企業(yè)要在冬季做好保溫措施的同時(shí)，盡量降低蛋雞群機(jī)體的免疫應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)格執(zhí)行科學(xué)的免疫程序，保證對(duì)雞群H9N2亞型禽流感疫苗合理的免疫密度[5,6]。

在不同地區(qū)，蛋雞在接種H9N2亞型禽流感疫苗后，抗體滴度平均值、合格率和優(yōu)秀率存在一定的差異，部分地區(qū)免疫效果還有一定的提升空間。導(dǎo)致各地免疫效果存在差異現(xiàn)象的原因與各地的免疫程序和選擇的疫苗有直接的關(guān)系。由于各個(gè)地方蛋雞場(chǎng)養(yǎng)殖模式不一樣，養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境存在一定的差異，免疫程序、免疫途徑、免疫劑量和所免疫的疫苗也存在差異，因此，抗體滴度較低地區(qū)可以參考其他蛋雞養(yǎng)殖比較好的地區(qū)的管理經(jīng)驗(yàn)和免疫程序（產(chǎn)蛋前免疫3次，產(chǎn)蛋后每間隔120 d加強(qiáng)免疫1次），同時(shí)結(jié)合最近幾年病原流行的變化調(diào)整免疫程序，及時(shí)進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，提高這些地區(qū)雞群H9N2亞型禽流感抗體水平。

對(duì)不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感抗體進(jìn)行分析顯示，在我們劃分的四個(gè)階段（青年雞、初步進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期、產(chǎn)蛋高峰期和產(chǎn)蛋下降期），H9N2亞型禽流感抗體水平滴度都較高，均超過(guò)了101og2，顯示和不同階段蛋雞群H9滅活疫苗良好的免疫效果。但是在蛋雞日齡不高于120 d和200 d兩個(gè)階段，部分雞群抗體滴度值小于4log2，存在抗體滴度離散度大，整齊度不好的特點(diǎn)，這提示部分雞場(chǎng)雞群產(chǎn)生抗體的能力存在差異，是雞只免疫抑制的原因、疫苗吸收不良的原因還是包含其他原因，值得進(jìn)一步去研究。

免疫接種只是預(yù)防H9N2亞型禽流感的最有效方法之一。目前我國(guó)使用的H9N2疫苗毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株等十幾個(gè)毒株，疫苗的種類有單價(jià)滅活疫苗，二聯(lián)滅活疫苗和三聯(lián)滅活疫苗，如此多的選擇增加了養(yǎng)殖企業(yè)防疫的困惑和難度。雖然蛋雞場(chǎng)開展了較好的免疫工作，但是在臨床上經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)H9感染蛋雞的案例[7-10]，因此盡早開展H9禽流感分子流行病調(diào)查，調(diào)整疫苗的毒株，正確指導(dǎo)養(yǎng)殖企業(yè)開展科學(xué)的防疫顯得尤為重要。

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·研究論文·

FIELD EFFICANY OF H9 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VACCINE IN LAYING HENS IN HUBEI

WANG Zhao-xiong1, OUYANG Jin-xu2, YANG Yu-ying1, YANG Feng-li1, JIANG Tao1, CHEN Xue-jiao1

(1. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. Animal Husbandry Bureau of Jingzhou city, Jingzhou 434100, China)

Key words:Avian infl uenza; H9N2 subtype; layer farm; immune effect

Abstract:In order to investigate the immune effect of H9N2 subtype avian influenza vaccine on large-scale layer farms in Hubei province, 2189 blood samples were randomly collected from January to December 2014 from poultry farms in 13 regions. The antibody titers of H9N2 subtype Avian infl uenza virus were determined in hemagglutination inhibition test (HI). The results showed a rising trend of the average HI antibody titers from January to May. The antibody titers were the lowest (9.26log2) in January and the highest (12.34log2) in May. In addition, there were some differences between 13 different regions with the lowest antibody titer at 5.76log2 and the highest titer at 11.58log2. The results also showed that the average antibody titers increased gradually with the aging. The average antibody titer was the lowest at 10.21log2 when chicken were less than 120 days old while the average antibody titer was the highest at 11.31log2 when the hens were more than 300 days old. The investigation concluded that the antibody level of H9N2 subtype avian infl uenza vaccine was good in general good and the qualifi ed or excellent immune protection was relatively high on layer farms in Hubei province. However,some differences in the antibody titers of H9N2 subtype avian infl uenza vaccine were observed in different regions, ages and months of the year.

中圖分類號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-6422（2016）01-0015-07

收稿日期：2015-11-17

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)江大學(xué)校基金

作者簡(jiǎn)介：汪招雄，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物病毒致病機(jī)制研究

通信作者：汪招雄，E-mail：luke751751@163.com