饒金鵬++邱楓+錢小紅+蔡益婷

摘要：目的 探討激光透明帶穿孔和激光透明帶削薄對玻璃化冷凍復(fù)蘇后小鼠卵子受精率的影響。方法 將玻璃化冷凍復(fù)蘇后的KM小鼠卵子分為4組，前3組為經(jīng)透明質(zhì)酸消化處理后脫去顆粒細(xì)胞的卵子，其中第1組對透明帶進(jìn)行激光穿孔處理，第2組對透明帶進(jìn)行激光削薄處理，第3組未做激光處理，而第4組為未經(jīng)透明質(zhì)酸消化帶有顆粒細(xì)胞的卵子，同樣未做激光處理。此后，在同一時間點使4組卵子與雄鼠精子進(jìn)行體外受精，次日觀察受精結(jié)果，比較各組受精率。結(jié)果 4組凍融卵子的受精率分別為52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47）和17.0%（8/47）。激光透明帶穿孔組的卵子受精率要顯著高于其余3組，P<0.05。而激光透明帶削薄組的受精率與未作激光處理的兩組相比沒有顯著差異，P>0.05。結(jié)論 激光透明帶削薄雖然對卵子造成的損傷較小，但不能有效提高受精率，而激光透明帶穿孔能克服凍融造成的透明帶硬化及糖蛋白結(jié)構(gòu)改變等問題，顯著提高凍融卵子復(fù)蘇后的受精率。

關(guān)鍵詞：激光；透明帶穿孔；透明帶削??；凍融小鼠卵子；受精率

The Effects of Laser Zona Drilling and Laser Zona Pellucida Thinning on the Fertilization Rates of Mouse Vitrified-thawed Oocytes

RAO Jin-peng，QIU Feng，QIAN Xiao-hong，CAI Yi-ting

（Reproductive Medicine Center， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310052，Zhejiang，China）

Abstract：Objective To evaluate the effects of laser zona drilling and laser zona pellucida thinning on the fertilization rates of mouse vitrified-thawed oocytes. Methods The Kunming mouse vitrified-thawed oocytes were divided into four groups： the first three groups were occytes without cumulus （DO）， but the forth group were oocytes with cumulus （COC）. Among the three DO groups， the first one were treated by laser zona drilling and the second one were treated by laser zona pellucida thinning， however， the third DO group and the COC group were not treated by laser shooting. All the oocytes with or without cumulus were fertilized in vitro at the same time， and the fertilization rate were compared on the next day. Results The fertilization rates of four groups were 52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47） and 17.0%（8/47） respectively. The laser zona drilling group's rates were significantly higher than the other three groups' （P<0.05）. However， there is no significant different among the laser zona pellucida thinning group and no laser treating groups（P>0.05）.Conclusion The methods of laser zona drilling could improve the fertilization rates of mouse vitrified-thawed oocytes. However， the laser zona pellucida thinning method seems could reduce the damage caused by laser， but could not overcome the problems of zona pellucida hardening and glycoprotein hurting during vitrification， and could not improve fertilization rates.

Key words：Laser； Zona drilling； Zona pellucida thinning； Mouse vitrified-thawed oocytes；Fertilization rates

激光破膜輔助孵化（Laser assisted hatching）因具有精確，快速，便捷，安全的特點，近年來已經(jīng)在輔助生殖技術(shù)（Assisted reproductive technology，ART）中廣泛應(yīng)用，對因胚胎冷凍造成的透明帶變硬、反復(fù)著床失敗患者的作用已經(jīng)得到了普遍認(rèn)可[1-3]。而人類卵子玻璃化冷凍技術(shù)因在生育力保存上具有重大的意義而成為近年來研究的熱點。但有研究表明卵母細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，不理想的體外條件會導(dǎo)致透明帶變硬，而玻璃化凍融過程中溫度的急劇變化則使得透明帶硬化的現(xiàn)象進(jìn)一步加劇，且凍融造成透明帶糖蛋白損傷，使頂體反應(yīng)進(jìn)行困難，最終致使精子無法穿透透明帶而受精失敗[4]。本研究將激光破膜法運用到凍融小鼠卵子上，探討激光透明帶穿孔和激光透明帶削薄兩種方法對凍融卵子復(fù)蘇后受精率的影響，為輔助生殖技術(shù)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6 w齡雌性昆明系小白鼠（體重25～30 g），10w齡以上成熟雄性昆明系小白鼠（體重30～35 g），購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心（動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2藥物與試劑 尿促性腺激素（HMG）與絨毛膜促性腺激素（HCG）均購自麗珠制藥廠，透明質(zhì)酸酶（hyaluronidas）及配子處理液G-GAMETE 和G-IVF購自Vitrolife 公司，卵子玻璃化凍融試劑盒購自O(shè)rigio公司，石蠟油購自SAGE 公司。

1.1.3耗材與設(shè)備 四孔皿購自NUNC公司，60 mm 培養(yǎng)皿及巴斯德管購自FALCON 公司， 裝載工具CRYOTOP購自KITAZATO公司。激光破膜儀為德國CTAX，超凈工作臺為丹麥IVFTECH，解剖顯微鏡為日本OLYMPUS，培養(yǎng)箱為美國THEMRO，液氮罐為美國MVE。

1.2方法

1.2.1凍融前小鼠卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG，48 h 后再注射10 IU的HCG，15 h后將小鼠頸椎脫臼處死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子處理液中刺破輸卵管膨大部，擠出成簇卵冠丘復(fù)合物（cumulus-oocyte complexes，COCs）。置于37℃培養(yǎng)箱2 h后，留1/4數(shù)量的COCs待用，剩余3/4的COCs放入含透明質(zhì)酸酶（hyaluronidas）的四孔皿內(nèi)1 min，再移入剩余3孔的GAMETE中反復(fù)吹打至顆粒細(xì)胞剝離干凈，選取形態(tài)良好MII期卵母細(xì)胞于G-IVF培養(yǎng)液37℃、6%CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min待用。

1.2.2卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇 冷凍：采用EmbryoVitri System-Cooling 試劑盒（Origio公司），冷凍液分為BS（base solution，mHTF+12mg/mL HSA）、ES（equilibration solution，7.5%（v/v）DMSO+7.5%（v/v）EG）和VS（vitrification solution，15%（v/v）DMSO+15%（v/v）EG+0.58M 蔗糖）。冷凍前將BS，ES和VS置于室溫環(huán)境下平衡30min以上，分別將卵子轉(zhuǎn)入BS（1 min），ES （4～10 min）和VS（40 s）。然后將卵子以最小液滴體積2-3 個/滴轉(zhuǎn)移至KITAZATO載體片上，迅速置入液氮中，封上套管，標(biāo)記保存。解凍：采用EmbryoVitri System-Warming 試劑盒（Origio公司），解凍液分為WS1（warming solution 1，1M蔗糖）、WS2（warming solution 2，0.5M蔗糖）、WS3（warming solution3，0.25M 蔗糖）、WS4（warming solution1，mHTF+12mg/ml HSA）。使用前，WS1 在37℃平衡30min，其他解凍液室溫平衡半小時以上。將KITAZATO載體從液氮中取出，迅速將前端載體片浸入WS1 中，輕輕搖晃時卵子脫落到WS1 中1min 后，將卵子轉(zhuǎn)移至WS2 、WS3和WS4各3 min， 再轉(zhuǎn)移至覆蓋石蠟油的G-IVF微滴培養(yǎng)液（Vitrolife）中，并放入37℃、6%CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3激光透明帶穿孔或削薄 穿孔： 使用德國CTAX激光破膜儀，將含卵子的微滴皿移至載物臺上，先于低倍鏡下找到待處理的卵子，再將物鏡切換至專用激光物鏡上，點擊激光解鎖鍵，調(diào)節(jié)激光發(fā)射能量為2～3 ms，將激光瞄準(zhǔn)十字標(biāo)定位到透明帶待穿孔區(qū)域，依次點擊激光發(fā)射鍵6～8次，直至透明帶某一區(qū)域完全穿透，激光射擊的位點應(yīng)盡量遠(yuǎn)離極體，且保證僅作用在透明帶上，不誤傷卵子實體。削?。?在激光定位到透明帶待削薄區(qū)域后，同樣將能量調(diào)節(jié)至2～3 ms，用激光將1/6周長的透明帶削薄，而削薄透明帶的厚度控制在50%～80%，且使得激光不完全穿透透明帶。

1.2.4體外受精培養(yǎng) 冷凍復(fù)蘇后的卵子（經(jīng)激光處理和未經(jīng)激光處理）都需在體外進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h， 與此同時，處死雄鼠，剪取輸精管及附睪尾取出精子，放入裝有G-IVF的EP管中使其上游獲能1 h。選取形態(tài)正常的卵母細(xì)胞（大小正常，折光度好，且沒有明顯的胞漿溢出與皺縮）進(jìn)行體外受精，調(diào)節(jié)加入精子的濃度，使得每個卵子周圍有2～3萬條精子，然后移至37℃、6%CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

1.2.5結(jié)果統(tǒng)計 受精后16～24 h在倒置顯微鏡下觀察受精和卵裂情況，受精率=2細(xì)胞及發(fā)育較快的3～4細(xì)胞的數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2 檢驗，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

4組凍融卵子中，激光透明帶穿孔組的復(fù)蘇后受精率顯著高于其余3組（P<0.05），而激光透明帶削薄組的受精率與未作激光處理的兩組相比沒有顯著差異（P>0.05），見表1。

3 討論

卵子在凍融過程中，溫度的急劇變化、細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的改變、結(jié)晶和重結(jié)晶的發(fā)生以及高濃度滲透性和非滲透性保護(hù)劑的毒性作用均會對卵母細(xì)胞造成損傷，影響其后續(xù)的受精和發(fā)育過程[5]。而冷凍過程中，超低溫環(huán)境還會引起透明帶糖蛋白基質(zhì)的改變，導(dǎo)致透明帶變硬，這些都將影響精子頂體反應(yīng)的進(jìn)行及隨后的受精結(jié)局[6]。

本研究中，分別凍融了一批經(jīng)透明質(zhì)酸處理后脫去顆粒細(xì)胞的小鼠卵子以及帶有顆粒細(xì)胞的卵子，而復(fù)蘇后的受精率分別只有21.3%和17.0%，要遠(yuǎn)低于常規(guī)體外受精獲得的受精率60%～80%，這一結(jié)果也驗證了凍融確實對卵子產(chǎn)生損傷，造成受精困難。而當(dāng)我們用激光破膜法對卵子透明帶進(jìn)行激光穿孔處理后，其凍融后的受精率獲得了顯著的提高（P<0.05），這與劉麗均等[7]的結(jié)果類似。但當(dāng)我們用激光削薄處理透明帶時，卻發(fā)現(xiàn)卵子受精率并沒有得到顯著提高。

孫玲等[8]使用激光透明帶穿孔和激光透明帶削薄技術(shù)對受精后第3 d的胚胎進(jìn)行輔助孵化操作，發(fā)現(xiàn)穿孔組的妊娠率45.8%（44/96）和著床率25.2%（68/270）均要高于削薄組的40.7%（37/91）和24.8%（58/234），這似乎也提示激光穿孔的效果要優(yōu)于激光削薄。但黃綺云[9]通過對凍融胚胎進(jìn)行激光透明帶穿孔和激光透明帶薄化卻得出了截然相反的結(jié)果，在其實驗中，穿孔組的種植率及妊娠率均要低于薄化組。他認(rèn)為當(dāng)用激光將整個透明帶穿透，熱效應(yīng)對卵裂球產(chǎn)生了極大傷害，而激光削薄處理與之相比則可以最大程度上避免這一損傷，獲得更好的胚胎孵出結(jié)局。但是在激光輔助孵化中，透明帶的削薄只是克服了孵化前的簡單機(jī)械性阻力，減低孵化過程中所消耗的能量閾值，而精卵結(jié)合的受精過程卻是一個非常復(fù)雜的生物分子化學(xué)反應(yīng)過程，要克服的不只是物理上的阻力[10]。

劉麗均等[7]通過免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)小鼠卵子凍融后透明帶糖蛋白-2結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷，而糖蛋白-2上存在著精卵結(jié)合的作用位點，它的受損使得精子無法結(jié)合到透明帶上，也無法誘發(fā)其后的頂體反應(yīng)，而頂體反應(yīng)是精子穿過透明帶的先決條件[10]。因此，激光透明帶削薄處理雖然克服了部分透明帶凍融變硬造成的機(jī)械阻力，但其不能修復(fù)凍融對糖蛋白造成的損傷，激光處理甚至進(jìn)一步破壞了糖蛋白結(jié)構(gòu)，最終使得精子無法識別透明帶上的結(jié)合位點，而一旦精子不能與透明帶結(jié)合，精子也就不能穿過最后一層透明帶[10]。這也解釋了本研究中用激光削薄處理透明帶并未取得理想結(jié)果的原因。

綜上所述，在應(yīng)對卵子因凍融導(dǎo)致的受精困難的問題時，不建議采用激光透明帶削薄的方法，而應(yīng)控制好激光激發(fā)的強(qiáng)度和位置，完全將透明帶某一區(qū)域穿透，如此才能有效提高凍融卵子受精率。

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編輯/金昊天