劉　爭，張恩慧，程永安，許忠民，王改改

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌　712100)

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影響甘藍(lán)小孢子DH植株生長的幾個(gè)因素

劉爭，張恩慧，程永安，許忠民，王改改

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要旨在篩選甘藍(lán)小孢子DH植株健壯生長的最適培養(yǎng)基和光照強(qiáng)度。為縮短小孢子DH植株培養(yǎng)時(shí)間并為獲得健壯植株創(chuàng)造條件，從而加快甘藍(lán)DH系育種進(jìn)程。以甘藍(lán)‘秦甘50’為材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)至誘導(dǎo)分化出不定芽，轉(zhuǎn)接到NAA質(zhì)量濃度不同的2種培養(yǎng)基上(1/2MS+0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA和MS+0.1 mg/L NAA)，不同光照強(qiáng)度[40、60、80、100 μmol/(m2·s)]及添加不同質(zhì)量濃度NH4NO3(0、0.4、0.8、1.2 g/L)培養(yǎng)，研究DH植株的生長勢，獲得甘藍(lán)小孢子DH植株最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，在NAA質(zhì)量濃度不同的培養(yǎng)基中，1/2MS +0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中小孢子DH植株生長速度最顯著，生根快、植株長勢強(qiáng)；在80 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度下培養(yǎng)小孢子DH植株凈生長高度顯著，10.3 d再生出根系,根質(zhì)量較好，葉片大而厚；MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.4 g/L的NH4NO3，小孢子DH植株生長健壯，35 d內(nèi)植株凈生長高度最大為56.25 mm。以上結(jié)果說明，甘藍(lán)小孢子DH植株快速健壯生長的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖；在80 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度下或MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.4 g/L的NH4NO3均能夠促進(jìn)甘藍(lán)小孢子DH植株根莖葉生長旺盛。

關(guān)鍵詞甘藍(lán)；DH植株；小孢子再生；培養(yǎng)基；光照強(qiáng)度；NH4NO3

結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)為十字花科蕓薹屬蔬菜，原產(chǎn)于地中海沿岸，是世界各國特別是歐美國家喜食的重要蔬菜作物，現(xiàn)在世界各地廣泛栽培[1]。甘藍(lán)具有顯著的雜種優(yōu)勢，雜種一代是由性狀純合的2個(gè)親本雜交而成。純合親本的獲得除多代自交外，游離小孢子培養(yǎng)也是創(chuàng)制純合自交系的快速途徑[2-3]。甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)(Isolated microspore culture)是指從甘藍(lán)的花蕾中直接分離獲得游離態(tài)、新鮮、發(fā)育時(shí)期合適的小孢子群體，通過培養(yǎng)使其脫分化，經(jīng)由胚狀體或愈傷組織誘導(dǎo)，再生獲得單倍體(Haploid)植株，而后經(jīng)過自發(fā)或誘發(fā)的染色體加倍成為正?？捎?、高度純合的雙單倍體(Double Haploid，簡稱DH)植株的過程，這種雙單倍體植株的自交后代則是DH系。DH系遺傳基因純合、性狀穩(wěn)定，可以直接作為親本材料應(yīng)用于雜種一代品種的選配[4-6]。近年來，甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系已初步建立，研究取得一定進(jìn)展[7-11]，但這項(xiàng)技術(shù)在甘藍(lán)上的應(yīng)用還不夠理想，主要表現(xiàn)在小孢子誘導(dǎo)的胚狀體成苗率低、質(zhì)量差、耗時(shí)長，苗體生長發(fā)育速度緩慢等問題，直接影響小孢子DH植株健壯生長，導(dǎo)致當(dāng)年培養(yǎng)的DH株田間移栽過晚，或越冬前DH株的營養(yǎng)體過小，最終導(dǎo)致小孢子DH植株春化不徹底，翌年DH株不能正常抽薹開花，延長利用DH系育種的年限。因而，探究甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中影響小孢子DH植株健壯生長的栽培因素就顯得尤為重要，尋找最適的胚狀體再生植株培養(yǎng)基和適宜植株生長的光照強(qiáng)度，旨在為縮短小孢子再生植株培養(yǎng)時(shí)間和獲得健壯植株苗創(chuàng)造條件，從而加快甘藍(lán)DH系育種進(jìn)程。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

甘藍(lán)‘秦甘50’供試材料由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院甘藍(lán)育種室提供。甘藍(lán)‘秦甘50’為雜種一代，2013-07-25露地播種育苗，6～7片真葉定植，2013-11-28假植窖藏越冬，2014-03-08定植紗網(wǎng)棚，正常管理；當(dāng)植株抽薹時(shí)，選取合適花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，出胚后將發(fā)育正常、生長健壯的子葉型胚狀體轉(zhuǎn)接到B5+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L + Suc 30 g/L + Agar 9 g/L培養(yǎng)基上，在溫度為23～25 ℃，光照強(qiáng)度為25～30 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間14 h/d的條件下培養(yǎng)，直至分化出不定芽。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基與NAA質(zhì)量濃度對(duì)小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉(zhuǎn)接到含0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖的1/2MS(有機(jī)物質(zhì)質(zhì)量濃度不變，其余物質(zhì)質(zhì)量濃度減半)培養(yǎng)基和0.1 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基，在25 ℃、光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間為14 h/d條件下培養(yǎng)，比較含有不同質(zhì)量濃度NAA的1/2MS和MS培養(yǎng)基對(duì)小孢子DH植株生長勢的影響。

1.2.2光照強(qiáng)度對(duì)小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉(zhuǎn)接到MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L 瓊脂+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，在25 ℃、光照時(shí)間為14 h/d、光照強(qiáng)度分別為40、60、80、100 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)，比較不同光照強(qiáng)度對(duì)小孢子DH植株生長勢的影響。

1.2.3MS培養(yǎng)基添加NH4NO3對(duì)小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉(zhuǎn)接到質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.2 g/L NH4NO3的MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L 瓊脂+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，在25 ℃、光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2·s)、光照時(shí)間為14 h/d條件下培養(yǎng)，比較NH4NO3對(duì)小孢子DH植株生長勢的影響。

以上處理中，口徑3 cm的指形培養(yǎng)試管中轉(zhuǎn)接1個(gè)不定芽，每個(gè)處理轉(zhuǎn)接15個(gè)不定芽，重復(fù)3次；處理后定期觀察統(tǒng)計(jì)植株高度、葉片和根系的生長發(fā)育，田間移栽時(shí)測植株質(zhì)量。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS7.05 Duncan’s新復(fù)極差法分析，Excel作圖。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基與NAA質(zhì)量濃度對(duì)小孢子DH植株生長勢的影響

從表1和圖1看出，MS培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分和NAA質(zhì)量濃度對(duì)小孢子DH植株生長具有較大的影響， A2和A3處理有利于小孢子DH植株健壯生長，其胚狀體不定芽轉(zhuǎn)接培養(yǎng)小孢子再生植株后，間隔7 d植株凈生長高度[12]值統(tǒng)計(jì)分析，A2和A3的小孢子DH植株凈生長高度始終高于其他處理，35 d時(shí)觀察小孢子DH植株長勢，A2和A3植株生長健壯，葉片鮮綠、面積大，根系數(shù)量多、粗壯，移栽時(shí)苗質(zhì)量分別達(dá)2.56、2.20 g(圖2)，與其他處理比較，小孢子DH植株生長勢存在顯著性差異，差異值主要表現(xiàn)在不定芽轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的28 d內(nèi)。A4和A5處理小孢子DH植株生長勢次之，A1處理小孢子DH植株生長勢最弱。處理A2、A3和A4在28 d內(nèi)植株高度持續(xù)增長，但28 ～35 d的植株高度變化不大，而處理A1和A5在35 d內(nèi)植株高度持續(xù)增長。由此得出，1/2MS+0.1 mg/L或0.2 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養(yǎng)基適宜甘藍(lán)小孢子DH植株健壯生長。

表1　不同培養(yǎng)基與NAA質(zhì)量濃度下小孢子DH植株生長結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。下同。

Note：Different lowercase in each column indicate significant difference atP<0.05 and different uppercase letters indicate extremely significant difference atP<0.01, the data expressed in “Average±Standard Deviation”.The same below.

圖1　不同培養(yǎng)基與NAA質(zhì)量濃度下植株的生長高度

2.2光照強(qiáng)度對(duì)小孢子DH植株生長勢的影響

A.1/2MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中植株形態(tài)Plant morphology in 1/2MS+0.1 mg/L NAA culture medium；B. 1/2MS+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基植株形態(tài)Plant morphology in 1/2MS+0.2 mg/L NAA culture medium

圖21/2MS+0.1 mg/L和0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)35d后甘藍(lán)小孢子再生植株形態(tài)

從表2和圖3看出，適宜的光照強(qiáng)度能夠促進(jìn)小孢子DH植株健壯生長，不同光照強(qiáng)度處理中，80 μmol/(m2·s)的小孢子DH植株生長旺盛，葉片大而厚，間隔7 d植株凈生長高度與其他處理存在顯著性差異，其植株凈生長高度最大，60 μmol/(m2·s)下的次之，40和100 μmol/(m2·s)下的較小。小孢子DH植株初生根時(shí)間隨著光照強(qiáng)度的增加而減短，植株根系健壯程度在一定光照強(qiáng)度范圍內(nèi)隨著光照強(qiáng)度的增加而增強(qiáng)；在80 μmol/(m2·s)下植株根系生長最健壯，表現(xiàn)根多且粗(圖4-C)；60 μmol/(m2·s)下植株根系生長健壯程度次之(圖4-B)，表現(xiàn)根多較細(xì)；40 μmol/(m2·s)和100 μmol/(m2·s)下植株根系數(shù)量較少且粗細(xì)不一致(圖4-A、D)。光照4個(gè)處理在35 d內(nèi)小孢子DH植株高度值持續(xù)增加。由此得出，將甘藍(lán)胚狀體不定芽轉(zhuǎn)接后，放置在80 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度下培養(yǎng)有利于小孢子DH植株快速健壯生長。

Fig.2　Plant morphology in 1/2MS+ 0.1 mg/L and 0.2 mg/L NAA medium cultured for 35 d

圖3　不同光照強(qiáng)度下植株的生長高度

2.3MS培養(yǎng)基添加附加物NH4NO3對(duì)小孢子DH植株長勢的影響

從表3和圖5可看出，MS培養(yǎng)基中添加適量的NH4NO3能夠促進(jìn)小孢子DH植株快速、健壯生長，在添加不同質(zhì)量濃度NH4NO3處理中，轉(zhuǎn)接后7、14 d各處理間植株凈生長高度差異不顯著，14 d后N1 處理的小孢子DH植株凈生長高度間隔7 d分別增加37.40、47.93和56.25 mm，與其他處理存在顯著性差異；由小孢子DH植株長勢相比較， N1處理的植株生長健壯，葉片大、葉柄長，初生根系時(shí)間為7.5 d，根系粗壯，移栽苗質(zhì)量達(dá)到2.80 g；N2處理和 N0處理植株生A．光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s) The illumination is 40 μmol/(m2·s)； B．光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)The illumination is 60 μmol/(m2·s)； C．光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s)The illumination is 80 μmol/(m2·s)； D.光照強(qiáng)度100 μmol/(m2·s) The illumination is 100 μmol/(m2·s)

圖4　不同光照強(qiáng)度下培養(yǎng)35 d 后植株形態(tài)

圖5　MS培養(yǎng)基中添加NH4NO3甘藍(lán)小孢子DH植株生長的結(jié)果

長勢次之，表現(xiàn)出莖葉或根系單一生長健壯； N3處理生長勢最差。由此得出，利用MS培養(yǎng)基再生甘藍(lán)小孢子植株時(shí)添加0.4 g/L NH4NO3能夠促進(jìn)植株快速健壯生長。

3討 論

植物地上部分生長與地下部分生長具有相關(guān)性，地下部分生長促進(jìn)地上部分生長，地上部分發(fā)育有利于地下部分發(fā)育；大量有機(jī)物質(zhì)和礦物質(zhì)供給才能保障植株地上部分莖葉和地下部分根系快速健壯生長，但不同種類植物的生長對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的種類和需求量是有選擇的，尤其在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的成分對(duì)再生植株生長影響較大。本研究結(jié)果表明，有機(jī)物含量不變、其余物質(zhì)含量減半的1/2MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基在28 d苗齡段內(nèi)更顯著的促進(jìn)甘藍(lán)小孢子DH植株快速健壯生長，表明，甘藍(lán)小孢子組織培養(yǎng)苗生長對(duì)有機(jī)物質(zhì)需要量相對(duì)較大，而對(duì)礦物質(zhì)需求量相對(duì)較少；但苗齡超過28 d的繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)因1/2MS培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)含量過少而生長減緩，需要及時(shí)繼代或煉苗移栽。植物激素α-萘乙酸(NAA)具有促進(jìn)根系再生的功能，但在培養(yǎng)基中額外添加過多NAA反而不利或抑制根系生長，對(duì)根系再生能力較強(qiáng)的甘藍(lán)而言，其生長過程中能分泌出一定量刺激生根的內(nèi)源激素，因而在組培時(shí)未添加NAA時(shí)外植體也可緩慢生根。本研究結(jié)果也驗(yàn)證這一結(jié)論，結(jié)果表明，在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.1和0.2 mg/L NAA能夠促進(jìn)甘藍(lán)小孢子植株健壯生長，但超過0.2 mg/L NAA易導(dǎo)致小孢子DH植株根系長勢弱，植株生長緩慢。

光照強(qiáng)度是影響組培苗光合作用和生長的外在因素，適度提高光照強(qiáng)度可使甘藍(lán)小孢子DH植株更好地生長發(fā)育。尹明華等[13]研究認(rèn)為，高光照強(qiáng)度對(duì)紅芽芋試管苗的生長發(fā)育影響較大，高光照度4 500 lx處理的試管苗新生芽數(shù)、新生根數(shù)、新生根長和株高均顯著高于低光照度處理。王政等[14]研究得出，光照強(qiáng)度變幅為45～81 μmol/(m2·s)時(shí)，隨著光照強(qiáng)度增加對(duì)彩色馬蹄蓮試管苗的生長有明顯的促進(jìn)作用。本研究中光照強(qiáng)度為80 μmol/(m2·s)時(shí)，小孢子DH植株凈生長高度較其他光照強(qiáng)度處理顯著提高，小孢子DH植株的生根速度較快，根的質(zhì)量較好，植株生長發(fā)育良好；過低的光照強(qiáng)度使小孢子DH植株得不到足夠的光照，或過高的光照強(qiáng)度可能抑制光合作用，兩者均引起光合產(chǎn)物降低。本試驗(yàn)中光照強(qiáng)度為40或100 μmol/(m2·s)時(shí)，可能因光照強(qiáng)度較弱或過強(qiáng)均不利于小孢子DH植株光合作用，從而導(dǎo)致植株長勢較弱。

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Received 2015-10-08Returned2015-11-19

Foundation itemThe National Key Technology Support Program(No.2012BAD02B01); Technical System Project of National Bulk Vegetable Industry(No.CARS-25); Science and Technology Innovation Project of Shaanxi Province(No.2012NKC02-05).

First authorLIU Zheng, male, master student.Research area: cabbage breeding and biotechnology.E-mail:liuzhenglxy@163.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Influence of Several Factors on Growth of DH Plants Regenerated from Microspores in Cabbage

LIU Zheng, ZHANG Enhui, CHENG Yong’an, XU Zhongmin and WANG Gaigai

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

AbstractAims to screen the most appropriate medium and illumination for DH plants regenerated from microspore in cabbage and to shorten culture time of obtaining robust plants, which will accelerate the breeding process of cabbage double haploid. Microspores of ‘Qin-gan 50’ cabbage was cultured until emergence of adventitious buds which then transferred to two kinds of mediums (1/2MS+0,0.1,0.2,0.3 mg/L NAA and MS+0.1 mg/L NAA), adding different amount of NH4NO3(0,0.4,0.8,1.2 g/L) in MS medium and cultured at different illumination [40,60,80,100 μmol/(m2·s)] . Then the growth vigor of the DH plants were studied and the most appropriate medium and culture conditions could be gotten. The DH plants grown in 1/2MS +0.1 mg/L NAA medium had the fastest growth rate and strong growth vigor, rooting fast;cultured in the illumination of 80 μmol/(m2·s),the DH plants had the most remarkable growth speed, better roots and leaves, which rooted in 10.3 days;the DH plants in MS medium with added 0.4 g/L NH4NO3 had the maximum value 56.25 mm of net growth height in 35 days. In conclusion, the appropriate medium for the DH plants regenerated from microspore in cabbage is 1/2MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L Agar+30 g/L Sugar;cultured in the illumination of 80 μmol/(m2·s) or transferred into the MS medium with added 0.4 g/L NH4NO3, the DH plants grown well with robust roots, stems and leaves.

Key wordsCabbage; DH plants; Regeneration from microspores; Medium; Illumination; NH4NO3

收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-11-19

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD02B01)；國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25)；陜西省科技創(chuàng)新(2012NKC02-05)。

通信作者：張恩慧，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楦仕{(lán)育種與生物技術(shù)。E-mail：ganlan606@126.com

中圖分類號(hào)S635.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)04-0605-07

Corresponding authorZHANG Enhui,male,professor,master supervisor.Research area:cabbage breeding and biotechnology.E-mail:ganlan606@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1118.034.html

第一作者：劉爭，男，碩士研究生，研究方向?yàn)楦仕{(lán)育種與生物技術(shù)。E-mail：liuzhenglxy@163.com