沈露露，胡春梅，許玉超， 王　巖，徐瑋瑋

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京　210095)

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水分脅迫對(duì)紫色不結(jié)球白菜花色苷合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響

沈露露，胡春梅，許玉超， 王巖，徐瑋瑋

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京210095)

摘要用250 g·L-1的聚乙二醇(PEG 6000)溶液模擬水分脅迫處理‘紫冠1號(hào)’紫色不結(jié)球白菜，運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用和熒光定量PCR方法，分析水分脅迫下其葉片中花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、成分的變化以及花色苷合成基因BcPAL、BcCHS、BcCHI、BcF 3H、BcDFR、BcANS和BcUFGT的表達(dá)特性。結(jié)果顯示：①水分脅迫誘導(dǎo)不結(jié)球白菜積累花色苷；②共檢測(cè)到11種主要的花色苷組分，分為矢車菊素類花色苷和飛燕草素類花色苷2大類，水分脅迫對(duì)不同花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響作用不同；③水分脅迫條件下，BcPAL、BcCHS和BcDFR基因的表達(dá)先升后降，BcF 3H和BcUFGT基因在水分脅迫下被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，BcANS和BcCHI基因的表達(dá)量在脅迫初期有所下降，隨后又逐漸升高。

關(guān)鍵詞不結(jié)球白菜；水分脅迫；花色苷；基因表達(dá)

植物的生長發(fā)育離不開水，水分脅迫是植物生長過程中最常見的逆境之一。中國是一個(gè)干旱半干旱土地面積很大的國家[1]，且隨著全球暖干化的加劇，研究植物對(duì)干旱環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制和適應(yīng)策略尤為重要，如何提高作物的抗旱能力是現(xiàn)代植物生產(chǎn)中急需解決的問題[2]。

聚乙二醇(PEG,Polyethyleneglycol)是一種惰性的非離子長鏈多聚體，高度親水，溶于水后能產(chǎn)生一定強(qiáng)度的滲透壓，因此常被用作植物的滲透脅迫劑。Gergeley等[3]用不同濃度的PEG溶液處理蘋果植株，通過對(duì)蘋果植株相關(guān)指標(biāo)的觀察和測(cè)定，認(rèn)為PEG誘導(dǎo)水分脅迫與對(duì)土壤控水的效果類似，且110g的PEG4000營養(yǎng)液的效果相當(dāng)于土壤田間持水量75%的水分狀況。Kaufmann等[4]對(duì)PEG反復(fù)研究后得出結(jié)論：PEG6000誘導(dǎo)水分脅迫所得的效果與將土壤逐步干旱是一樣的。

不結(jié)球白菜(Brassica campestrisssp. chinensisMakino)原產(chǎn)中國，栽培歷史悠久，營養(yǎng)豐富，深受中國人民喜愛[5]。紫色不結(jié)球白菜是近年育成的蔬菜新品種，其葉片正面呈紫色或紫紅色，背面綠色，葉柄翠綠。紫色不結(jié)球白菜葉片富含花色苷?；ㄉ帐且环N水溶性的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化[6]、降血脂[7]和血糖[8]以及抗癌[9-10]等功效。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷的合成和積累易受環(huán)境因素的影響[11]。曹晶等[12]在夏秋季節(jié)干旱處理紅葉石楠扦插苗時(shí)發(fā)現(xiàn)其葉片花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加；王虹[13]研究發(fā)現(xiàn)適度干旱條件下紅葉桃花花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加；趙權(quán)等[14]在研究干旱脅迫對(duì)山葡萄花色苷合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)干旱處理可以提高總花色苷和二甲花翠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前，對(duì)紫色不結(jié)球白菜花色苷合成的影響因子的研究尚處于起步階段，因此，本試驗(yàn)以紫色不結(jié)球白菜‘紫冠1號(hào)’為材料，用聚乙二醇(PEG)模擬水分脅迫條件，研究其對(duì)葉片花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、成分以及相關(guān)基因的表達(dá)量變化的影響，以期為紫色不結(jié)球白菜的優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)處理與設(shè)計(jì)

‘紫冠1號(hào)’紫色不結(jié)球白菜是國家蔬菜工程技術(shù)研究中心(京研)育成的不結(jié)球白菜新品種，葉片正面紫色有光澤，背面綠色，株型直立，生長勢(shì)強(qiáng)。

將種子表面用φ=70%的乙醇浸泡清洗5min，然后用千分之一的HgCl消毒15min，無菌蒸餾水沖洗3次，每次沖洗2min。處理過的種子放在人工培養(yǎng)箱中催芽。待50%種子露白時(shí)進(jìn)行穴盤播種，基質(zhì)的配方為V(草炭)∶V(蛭石)=3∶1。人工培養(yǎng)箱的條件為光照度30 000lx，溫度24 ℃，相對(duì)濕度85 %，光暗周期為18h/ 6h。待幼苗長至6～8片葉時(shí)進(jìn)行相關(guān)處理。試驗(yàn)分為2組：第1組為人為模擬水分脅迫(PEG)，用250g·L-1的PEG6000溶液灌根，為試驗(yàn)組；第2組澆灌等量蒸餾水，為對(duì)照組(CK)，其他按常規(guī)管理。每12h取1次樣(取樣部位為成熟的功能葉)，取至第48h。所取樣品皆放在-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法

花色苷的提取采用φ=1%HCl-CH3OH溶劑萃取法提取[15]，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)530nm下的光密度值。

1.3花色苷成分的分析

取處理后第48h的材料葉片提取花色苷，參照徐學(xué)玲等[16]高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-MS)方法分析花色苷成分。

1.4引物設(shè)計(jì)、RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)目的基因，搜索大白菜數(shù)據(jù)庫并與已經(jīng)測(cè)序得到的不結(jié)球白菜基因組序列比對(duì)設(shè)計(jì)特異引物。參照天根公司生產(chǎn)的TIANGENRNAsimpleTotalRNAKit使用說明書進(jìn)行總RNA的提取與檢測(cè)；按照TaKaRa公司生產(chǎn)的M-MLVRTasecDNASynthesisKit使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5熒光定量PCR分析

熒光定量PCR反應(yīng)體系參照SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)(TaKaRa)試劑盒操作說明書配制。PCR程序設(shè)定如下：95 ℃預(yù)變性20 s； 95 ℃變性30 s，60 ℃退火22 s，后兩步循環(huán)40次。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用△△CT法對(duì)熒光定量PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.6數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 和EXCEL 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1水分脅迫條件下不結(jié)球白菜花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

水分脅迫對(duì)不結(jié)球白菜葉片花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有很大影響(圖1)。水分脅迫條件下不結(jié)球白菜花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先降低后升高的趨勢(shì)。第0～12 h，花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較處理后和CK均顯著下降，隨后，試驗(yàn)組的花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高,至處理結(jié)束時(shí)試驗(yàn)組的花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于對(duì)照。

處理與CK做差異顯著性分析，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

Comparisons between PEG treatment and control(CK) were marked as * mean significant difference atP<0.05 level and ** mean significant difference atP<0.01,respectively.

圖1水分脅迫對(duì)不結(jié)球白菜花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Fig.1Effect of water stress on mass

fraction of anthocyanins

2.2不結(jié)球白菜花色苷成分及水分脅迫下各花色苷成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

紫色不結(jié)球白菜的花色苷是多種不同成分的花色苷的混合物(表2)。結(jié)合質(zhì)譜碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)各色譜峰進(jìn)行推測(cè)，可以得出‘紫冠1號(hào)’紫色不結(jié)球白菜的花色苷成分主要是酰基化的矢車菊素花色苷，共鑒定出9種，此外還有2種飛燕草素花色苷。

水分脅迫處理48 h后各花色苷成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較對(duì)照有變化。其中，飛燕草-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-咖啡酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷和矢車菊-3-P-香豆酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷在水分脅迫條件下較CK有所降低；矢車菊-3-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-4-羥基-E-肉桂酰-6-D-葡萄糖苷的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有增加；飛燕草-3,5-雙葡萄糖苷、矢車菊-3-槐糖苷-5-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊-3-雙香豆酰槐糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊-3-阿魏酰-6-丙二酰-槐糖苷-葡萄糖苷、矢車菊-3-p-香豆酰-芥子酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷和矢車菊-3-芥子酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則全部增加了2倍以上。在表2列出的11種花色苷中，矢車菊-3-芥子酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加最多，是CK的12.19倍。

表2　水分脅迫對(duì)不結(jié)球白菜部分花色苷成分的影響

2.3水分脅迫下不結(jié)球白菜花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的變化

隨著時(shí)間的推移和水分脅迫程度的加劇，BcPAL、BcCHS、BcCHI、BcF3H、BcDFR、BcANS和BcUFGT的表達(dá)量有不同程度的變化(圖2)。與CK相比，BcPAL的表達(dá)量先升后降。第12h時(shí)BcPAL的表達(dá)量較第0h稍有增加；隨后，第24h和第36h時(shí)BcPAL的表達(dá)量明顯增加，分別是CK的1.999倍和2.007倍；第48h時(shí)BcPAL的表達(dá)量又降低為CK的0.900 9。BcCHI的表達(dá)量在第12h時(shí)較處理前稍有下降，之后保持在一個(gè)較高的表達(dá)水平。BcCHS的表達(dá)量變化趨勢(shì)和BcPAL的類似，均在處理后的前36h呈逐漸增加的趨勢(shì)，而在處理結(jié)束(第48h)時(shí)，表達(dá)水平又恢復(fù)到一個(gè)較低的水平(為對(duì)照的0.629 4 倍)。BcF 3H的表達(dá)量在整個(gè)處理期間持續(xù)升高，至處理結(jié)束時(shí)其表達(dá)量是CK的3.353 2 倍。BcDFR的表達(dá)量變化趨勢(shì)大致與BcPAL的類似，不同的是處理結(jié)束時(shí)BcDFR的表達(dá)量仍顯著高于CK。BcANS的表達(dá)量變化趨勢(shì)與BcCHI的類似，也是先降低后升高，不同的是BcANS的表達(dá)量變化趨勢(shì)更明顯，至處理結(jié)束時(shí)BcANS的表達(dá)量是對(duì)照的4.943 9倍，極顯著高于CK。BcUFGT的表達(dá)量也呈逐漸升高的趨勢(shì)，處理第0～24h變化不明顯，第36～48h，BcUFGT的表達(dá)量顯著增加，第48h時(shí)BcUFGT的表達(dá)量是CK的2.829 5倍，較CK有顯著增加。

對(duì)照組相應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)量為1。

3討論

Bahler等[17]研究發(fā)現(xiàn)富含花色苷的紫葉胡椒比同一品系的綠葉胡椒更耐水分脅迫。Tang等[18]在分析花色苷強(qiáng)化植物的耐旱性生理機(jī)制時(shí)認(rèn)為花色苷提高植物細(xì)胞在干旱脅迫下的抗氧化能力可能是花色苷強(qiáng)化植物耐旱性的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)水分脅迫下紫色不結(jié)球白菜葉片可積累花色苷，并且最高可達(dá)到處理前的1.35倍。但在水分脅迫初期，即處理后第12 h時(shí)，花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較處理前有所下降，這是因?yàn)榛ㄉ辗浅２环€(wěn)定，當(dāng)植物面臨水分脅迫時(shí)，花色苷大量分解，因而在水分脅迫初期，花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯的降低。而后隨著水分脅迫時(shí)間的延長，植物體內(nèi)各種應(yīng)對(duì)逆境脅迫的生理生化反應(yīng)被相繼激活，花色苷作為一種次生代謝產(chǎn)物，也被大量合成以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抵御逆境脅迫對(duì)植物的侵害。由此可見，水分脅迫可誘導(dǎo)紫色不結(jié)球白菜葉片積累花色苷。

根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果可知紫色不結(jié)球白菜葉片中的花色苷種類非常豐富，主要花色苷的種類多達(dá)11種，且主要為?；氖杠嚲疹惢ㄉ眨硗膺€有少量的飛燕草類花色苷，這與徐學(xué)玲等[16]的研究結(jié)果類似，說明不同品種的紫色不結(jié)球白菜花色苷的主要成分大致類似，僅在各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上有所差別。目前，關(guān)于水分脅迫對(duì)花色苷成分的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示水分脅迫對(duì)紫色不結(jié)球白菜葉片花色苷中的矢車菊素花色苷和飛燕草素花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有很大影響，其中，矢車菊-3-芥子酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加最多，而矢車菊-3-咖啡酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少最多，其余9種花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增減不一。

苯丙氨酸是黃酮類物質(zhì)生物合成的直接前體，查爾酮合成酶催化花色素苷生物合成的第一步反應(yīng)。由苯丙氨酸到花青素合成需經(jīng)歷3個(gè)階段：①苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的調(diào)控下合成香豆酰CoA；②由香豆酰CoA到二氫黃酮醇，該反應(yīng)是花青素代謝的關(guān)鍵反應(yīng)，主要由CHS、CHI、F3H等基因參與調(diào)控；③各種花青素的合成，參與該階段調(diào)控的基因主要有DFR、ANS、UFGT等。

目前，關(guān)于脅迫對(duì)花色苷生物合成相關(guān)基因表達(dá)影響的研究不在少數(shù)。Nagabhushana等[19]研究發(fā)現(xiàn)水稻的OsDFR和OsANS基因在水分脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。Liu等[20]在研究F 3H基因的時(shí)候發(fā)現(xiàn)RsF 3H基因在脅迫下表達(dá)量明顯升高。Ma等[21]研究干旱脅迫對(duì)小麥類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，TaCHS和TaCHI基因在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，且TaCHS和TaCHI基因在干旱脅迫下的變化趨勢(shì)一致，均先升后降。但關(guān)于不結(jié)球白菜花色苷基因在水分脅迫下的表達(dá)情況的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時(shí)間的延長和脅迫程度的加劇，BcPAL、BcCHS和BcDFR基因的表達(dá)呈先升后降的趨勢(shì)，其中BcPAL和BcCHS基因的表達(dá)量于脅迫處理后第24h達(dá)最高，而BcDFR基因的表達(dá)量在脅迫后第36h達(dá)最高，這是因?yàn)锽cPAL和BcCHS基因處在整個(gè)花色素合成途徑的上游，而BcDFR基因在這個(gè)途徑的下游，故BcDFR基因的表達(dá)比BcPAL和BcCHS基因延后達(dá)到峰值。另外，這3個(gè)基因分別負(fù)責(zé)花色苷生物合成途徑中第1階段、第2階段和第3階段的關(guān)鍵反應(yīng)，說明三者協(xié)同作用，共同調(diào)控花色苷的生物合成。BcF 3H和BcUFGT基因在水分脅迫下被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，這可能與二者在花色苷生物合成途徑中占據(jù)重要位置有關(guān)。F 3H酶催化合成的物質(zhì)香橙素是各種花色苷的共同底物；而UFGT酶負(fù)責(zé)將合成的花色素分子糖基化，轉(zhuǎn)化成較穩(wěn)定的花色苷儲(chǔ)存起來。BcANS和BcCHI基因在水分脅迫初期的表達(dá)量有所下降，隨后其表達(dá)量又逐漸升高，這與水分脅迫下花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)一致。但二者相比，BcANS基因的變化幅度更大，BcCHI基因的變化相對(duì)較平穩(wěn)。

以上研究結(jié)果表明短期的水分脅迫處理有利于紫色不結(jié)球白菜花色苷的積累，但是水分脅迫對(duì)花色苷的成分組成卻有影響，這些影響表現(xiàn)在對(duì)各花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)上，尤其是矢車菊素類花色苷。至于水分脅迫對(duì)這些花色苷的成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響會(huì)不會(huì)影響花色苷的相關(guān)抗氧化性作用，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，BcANS基因和BcCHI基因在水分脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，且其表達(dá)量變化趨勢(shì)與水分脅迫下花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)一致，說明這2個(gè)基因在水分脅迫下誘導(dǎo)花色苷基因的表達(dá)上有重要作用。

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Received2015-06-21Returned2015-09-02

FirstauthorSHENLulu,female,masterstudent.Researcharea:vegetablegeneticsandbreeding.E-mail:13865982593@163.com

CorrespondingauthorHUChunmei,female,associateprofessor.Researcharea:vegetablegeneticsandbreeding.E-mail:jjjhcm@njau.edu.cn

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsibleeditor:PANXueyan)

Anthocyanins Biosynthesis and Gene Expression Changes of Non-heading Chinese Cabbage under Water Stress

SHEN Lulu, HU Chunmei, XU Yuchao, WANG Yan and XU Weiwei

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Ministry of Agriculture, Nanjing210095, China)

Abstract250 g·L-1PEG6000 solution( polyethylene glycol 6000, PEG ) were dipped in root of purple non-heading Chinese cabbage named ‘Ziguan No.1’ and liquid chromatography-mass spectrometry as well as fluorescence quantitative PCR method were used to analyze the effects of water stress on anthocyanins content, composition and the expression characteristics of anthocyanins biosynthesis related genes such as BcPAL, BcCHS, BcCHI, BcF 3H, BcDFR, BcANS and BcUFGT in non-heading Chinese cabbage leaves. The results showed that:①the anthocyanins content showed increasing under water stress; ②11 kinds of main components of anthocyanins were detected and they were divided into two categories, cyanidin and delphinidin, and the influence of water stress on contents of different anthocyanins were different;③the expression of BcPAL, BcCHS and BcDFR under water stress increased first and then decreased, while the expression of BcF 3H and BcUFGT were continuously induced by water stress,BcANS and BcCHI expression levels declined in the early stress and then gradually increased.

Key wordsNon-heading Chinese cabbage; Water stress; Anthocyanins; Gene expression

收稿日期：2015-06-21修回日期：2015-09-02

通信作者：胡春梅，女，副教授，主要從事蔬菜遺傳育種相關(guān)研究。E-mial: jjjhcm@njau.edu.cn

中圖分類號(hào)S634.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)04-0588-07

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1117.030.html

第一作者：沈露露，女，碩士研究生，從事蔬菜遺傳育種相關(guān)研究。E-mail: 13865982593@163.com