狄　江，劉劍鋒，徐新明，王　瓊，拉扎特·艾尼瓦爾，于麗娟

(1. 新疆畜牧科學院, 烏魯木齊　830000; 2.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院, 北京　100193)

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周歲細毛羊羊毛長度、產(chǎn)毛量與體質(zhì)量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

狄江1，劉劍鋒2，徐新明1，王瓊1，拉扎特·艾尼瓦爾1，于麗娟1

(1. 新疆畜牧科學院, 烏魯木齊830000; 2.中國農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院, 北京100193)

摘要為檢測影響周歲細毛羊羊毛長度、毛量及體質(zhì)量性狀的基因組區(qū)域，利用OvineSNP50 BeadChip對365只中國美利奴(新疆型)個體基因分型，并采用single-locus回歸方法進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。通過基因組水平的Permutations校正，檢測到2個與羊毛長度及3個與毛量顯著關(guān)聯(lián)的SNPs。這些SNPs分別鄰近5個已知基因(9.16 ～143.32 kb)。其中FIBIN、 HSD17B11及 PIAS1 3個基因參與羊毛生長、發(fā)育相關(guān)的生物學過程，且均包含于已知羊毛性狀相關(guān)QTL區(qū)域內(nèi)，為所檢測到的關(guān)聯(lián)結(jié)果提供進一步證據(jù)。對這些目標區(qū)域的進一步研究有助于揭示細毛羊羊毛長度、產(chǎn)量等性狀的遺傳機理。

關(guān)鍵詞全基因組關(guān)聯(lián)分析；羊毛；體質(zhì)量；細毛羊

通過育種手段不斷改善羊毛產(chǎn)量、羊毛長度、纖維直徑及體質(zhì)量性狀是提高細毛羊綜合品質(zhì)和養(yǎng)殖效益的重要途徑之一，詳細了解這些經(jīng)濟性狀的分子遺傳機理，有助于加快育種進展、提高育種效率。過去20余年里，QTL方法已被普遍應(yīng)用檢測經(jīng)濟性狀功能候選區(qū)域，然而截至目前在羊SheepQTLdb數(shù)據(jù)庫中僅僅包括789個 QTLs，其中34個QTLs與羊毛性狀連鎖(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)。而且，由于QTL較大的置信區(qū)間，難以鑒別影響這些經(jīng)濟性狀的特定基因。對于體質(zhì)量性狀，也僅發(fā)現(xiàn)MSTN(Myostatin)[1]、CLPG(Callipyge)[2]及MHC[3]等幾個候選基因與綿羊生長及肌肉性狀連鎖。

隨著分子技術(shù)快速發(fā)展，基于高通量SNP芯片技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)已成為探索經(jīng)濟性狀相關(guān)候選功能區(qū)域的新的工具。目前，關(guān)于羊GWAS研究報道與牛、豬、雞等畜種相比數(shù)量較少，且多數(shù)集中在疾病性狀。通過GWAS研究已發(fā)現(xiàn)與小眼畸形[4]、軟骨病[5]、副結(jié)核病[6]等羊病關(guān)聯(lián)的基因或染色體區(qū)域。已有關(guān)于肉用羊及地方品種羊體質(zhì)量及其相關(guān)性狀的GWAS研究，并發(fā)現(xiàn)一些顯著關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域[7]。另外，在ASIP基因中檢測到一個與被毛顏色變化關(guān)聯(lián)的SNP[8]。最近，在中國美利奴(軍墾型)中通過GWAS研究檢測到一些與羊毛纖維直徑、彎曲性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP[9]。然而，針對細毛羊羊毛產(chǎn)量、體質(zhì)量等重要經(jīng)濟性狀的GWAS研究還未見報道。因此，本試驗以中國美利奴周歲母羊(新疆型)為群體，通過利用Illumina OvineSNP50 BeadChip芯片，開展GWAS研究以檢測與周歲羊毛長度、原毛量及體質(zhì)量性狀關(guān)聯(lián)的潛在隨機遺傳變異，為進一步揭示細毛羊羊毛性狀、生長性狀的遺傳機理并提高育種效率的研究提供借鑒。

1材料與方法

1.1動物來源與性狀

試驗羊只來源于新疆鞏乃斯種羊場的中國美利奴(新疆型)核心育種群。該場羊群采取夏季放牧、冬季舍飼的飼養(yǎng)方式，全部羊群在基本一致的條件下飼養(yǎng)。本研究的365只周歲母羊(33只公羊后代)在剪毛后測定體質(zhì)量、原毛量，采集體側(cè)部毛樣，室內(nèi)測定羊毛長度和纖維直徑。同時，采集耳組織樣品于φ=75%乙醇保存待用。

1.2基因分型及質(zhì)量控制

采用常規(guī)苯酚/氯仿方法提取基因組DNA。利用包括54 241個SNP位點的Illumina OvineSNP50 BeadChip芯片在Infinium II multisample assay (Illumina)平臺上檢測全部DNA樣品基因型。通過iScan (Illumina) 掃描芯片結(jié)果，并利用GenomeStudio軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析，從而得到每個樣品的SNP分型數(shù)據(jù)。

將全部SNP分型結(jié)果進行質(zhì)控分析，去除不符合條件的SNP。去除條件為：雜交陽性率(call rate)<90%, 最小等位基因頻率(MAF) <3%，顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(HWE)(P<10-3,P為卡方顯著性檢驗P值)。另外，不在羊常染色體上的SNP也被排除在進一步的關(guān)聯(lián)分析之外。

1.3全基因組關(guān)聯(lián)分析及統(tǒng)計推斷

采用single-locus回歸方法通過PLINK軟件進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，模型如下：

y=μ+Xf+bm+Zs+e

采用permutation方法對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進行校正，通過permutation 10 000次獲得3個性狀的5%基因組水平顯著P值閾值。

1.4基因注釋

OvineSNP50 BeadChip中SNP位置主要基于羊早期基因組序列版本(Ovis_aries_v1.0)確定。首先利用SNP50 BeadChip基因組位置注釋文件重新定位SNP在最近的基因組序列版本Ovis_aries_v3.1上的位置(http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oarv3/Oarv3.150kSNP. position.gff3)；其次通過NCBI中的Ovisaries Annotation Release 100工具鑒定與顯著關(guān)聯(lián)SNP對應(yīng)或鄰近的羊基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects /mapview/map_search.cgi?taxid=9940&build =100.0，基于 Ovis_aries_v3.1 注釋)；最后，利用綿羊數(shù)量性狀位點數(shù)據(jù)庫中已知數(shù)量性狀位點對顯著關(guān)聯(lián)SNP進行比對、驗證(Sheep QTLdb，http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)。

2結(jié)果與分析

2.1表型及質(zhì)控后的SNP分布

全部分析性狀的統(tǒng)計結(jié)果描述見表1。分型結(jié)果經(jīng)質(zhì)控后，選擇44 798個SNP用于進一步的關(guān)聯(lián)分析。過濾后每條染色體上的SNP數(shù)量變化范圍為672個(OAR26)～5 150個(OAR1)，SNP間的距離變化范圍為49.97 kb(OAR8)～65.59 kb (OAR26)。質(zhì)控后的SNP在每條染色體上的分布見表2。

2.2全基因組關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)過對中國美利奴周歲母羊毛長、毛量及體質(zhì)量3個性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，采用permutation(10 000次)方法校正獲得3個性狀5%基因組水平顯著P值閾值分別為：毛長1.31×10-6、毛量1.01×10-6、體質(zhì)量8.76×10-7。采用校正后的P值作manhattan圖，見圖1。經(jīng)基因組水平的permutation校正，共檢測到5個SNP達到顯著水平。其中與羊毛長度顯著關(guān)聯(lián)的SNP有2個，與毛量顯著關(guān)聯(lián)的SNP有3個，沒有檢測到與剪毛后體質(zhì)量顯著關(guān)聯(lián)的SNP。這些顯著關(guān)聯(lián)的SNP分別位于5條不同的染色體，鄰近已知羊基因的距離為9.16～143.32 kb。表3詳細列示顯著SNPs名稱、位置及鄰近基因等。

2.3顯著SNP與已知數(shù)量性狀位點比較

通過比較綿羊數(shù)量性狀位點數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)位于6、7和15號染色體上的顯著關(guān)聯(lián)SNP分別與已知影響羊毛長度、纖維直徑的QTL區(qū)域吻合(表4)。其中15號染色體上的與羊毛長度顯著關(guān)聯(lián)的SNP也位于相同性狀的已知QTL區(qū)域內(nèi)，而6、7號染色體上與毛量顯著關(guān)聯(lián)的SNP則位于羊毛長度、纖維直徑性狀已知的QTL區(qū)域內(nèi)。

表1　周歲羊毛及體質(zhì)量性狀統(tǒng)計

表2　質(zhì)控后SNP在每條染色體的分布

A.羊毛長度Staple length； B.毛量Fleece mass ；縱坐標為關(guān)聯(lián)性檢驗的P的常用對數(shù)值Scale on y-axis is (P-value)common logarithm score of association analysis；藍色線為5%基因組水平顯著P值閾值線Blue line indicatesP-value threshold of genome-wise 5% significance level

圖1　羊毛性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖

表4　與本研究顯著關(guān)聯(lián)SNPs相對應(yīng)的已知QTLs

注：來源于 Sheep QTLdb. Available: http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index.

Note：Derived from Sheep QTLdb. Available:http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index.

3討 論

毛囊發(fā)育及羊毛生長是一個復雜的生物學過程。在小鼠及人類中的研究表明，Wnt、TGFβ/BMP、 Sonic hedgehog、 FGF及NF-κB等信號通路及其這些信號通路間相互作用對毛囊發(fā)生、發(fā)育及毛發(fā)生長都有重要作用[10-12]。其中Wnt通路主要調(diào)控毛囊形態(tài)發(fā)生，并通過EDA/EDAR/NF-κB通路繼續(xù)作用于毛發(fā)生長，Sonic hedgehog參與毛囊形態(tài)發(fā)生及隨后的毛囊和毛發(fā)分化，NF-κB對Wnt通路有調(diào)控作用，F(xiàn)gf通過Fgf7/Fgf10配體信號影響出生后形態(tài)發(fā)生期間毛發(fā)生長[10]。

本研究通過對周歲細毛羊羊毛性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在基因組水平經(jīng)Permutation檢驗，獲得與羊毛性狀顯著關(guān)聯(lián)的5個SNPs，其中毛長2個、毛量3個。這5個SNPs分布于5條不同染色體，鄰近5個已知的羊基因。與周歲羊羊毛長度顯著關(guān)聯(lián)的2個SNP中，OAR2_26198532.1鄰近 DIRAS2基因 (DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2)，SNPOAR15_61161801.1 鄰近FIBIN基因 (fin bud initiation factor homolog)。FIBIN是生長因子蛋白，在斑馬魚胸鰭芽及小鼠胚胎的前肢芽的觸發(fā)有重要作用[13]。FIBIN通過作用于其下游的wnt及FGF信號誘發(fā)胸鰭芽[14]，而這2個通路也影響羊毛生長。而且，在Sheep QTLdb中，OAR15 的47 404 449～80 923 592 bp區(qū)域內(nèi)存在一個與羊毛長度關(guān)聯(lián)的QTL，與FIBIN基因及其對應(yīng)的SNPs所在區(qū)域及吻合，進一步提示該區(qū)域及FIBIN基因有必要作為影響羊毛纖維長度性狀的重要候選者繼續(xù)深入研究。DIRAS2屬于small GTPaseRas家族，其成員在細胞形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生中有作用[15]，但DIRAS2的詳細功能還不清楚，是否影響毛發(fā)生長也未見報道。

與周歲毛量顯著關(guān)聯(lián)的3個SNPs中，OAR6_111912224.1鄰近 HSD17B11基因 (hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 11)，OAR7_15117952.1鄰近 PIAS1基因 (protein inhibitor of activated STAT 1)，OAR1_258037376.1鄰近TRNAG-UCC基因 (transfer RNA glycine (anticodon UCC))。 HSD17B11屬于17β-hydroxysteroid脫氫酶(HSD17Bs)，其能將3α-Diol(5α-androstan-3α,17β-diol)轉(zhuǎn)化為雄酮，因此，在雄激素代謝中有重要作用[16]。研究表明，雄激素對毛發(fā)生長有重要但不同的影響，即可刺激胡須、腋窩等部位的毛發(fā)生長，也可抑制前額毛發(fā)的生長[17]。其以毛囊中的真皮乳頭細胞作為靶細胞，通過胰島素樣生長因子I (IGF-I)促進毛發(fā)生長[18]，或通過刺激TGF-β1表達抑制毛發(fā)生長[19]。盡管 HSD17B11是否直接影響毛發(fā)生長還未見相關(guān)研究報道，但本試驗中檢測到其與產(chǎn)毛量間顯著的關(guān)聯(lián)說明其有可能通過影響性激素代謝調(diào)控羊毛生長。 PIAS1是信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子1 (STAT1，Signal transducer and activatoroftranscription 1)的抑制因子，其能促進小泛素相關(guān)修飾物(Small ubiquitin-related modifier, SUMO)分子對靶蛋白的SUMO化修飾。SUMO化修飾能影響蛋白質(zhì)間的相互作用，改變蛋白質(zhì)于細胞內(nèi)的位置，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[20]。研究表明 PIAS1和SUMO化修飾在其他一些組織及系統(tǒng)中參與Wnt[21]、BMP[22]、Hedgehog[23]及NF-κB[24]等信號途徑的調(diào)控，而這些通路也與毛發(fā)生長相關(guān)。

在Sheep QTLdb中，OAR6 的119 691～117 031 472 bp區(qū)域間存在一個與羊毛纖維直徑關(guān)聯(lián)的QTL，與OAR6_111912224所在區(qū)域吻合；OAR7 的2 456 803～100 079 507 bp區(qū)域間存在一個與羊毛長度關(guān)聯(lián)的QTL，與OAR7_15117952.1所在區(qū)域吻合。研究表明，美利奴羊群中原毛量與纖維直徑間(相關(guān)系數(shù)為0.36)、原毛量與羊毛長度間(相關(guān)系數(shù)為0.44)均存在較高程度的正遺傳相關(guān)[25]，這也進一步證明這2個基因與原毛量間可能的關(guān)聯(lián)。對于TRNAG-UCC基因，未見有關(guān)其功能的文獻報道。

從以上對幾個相鄰候選基因的功能描述看出，F(xiàn)IBIN、 HSD17B11、 PIAS1 3個基因在不同組織或物種中均參與與毛發(fā)發(fā)育和生長相關(guān)的信號通路，并且與其相關(guān)的SNP也位于已知的羊毛性狀QTL區(qū)域內(nèi)，進一步暗示這些基因可作為影響羊毛性狀的候選基因。本研究中沒有檢測到與周歲羊體質(zhì)量顯著關(guān)聯(lián)的SNP,同時也沒有檢測到與毛量、羊毛長度較高遺傳相關(guān)相對應(yīng)的基因多效性現(xiàn)象(未檢測到同時與這2個性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP)，其原因可能與標記密度較低(排除18%SNP)、樣本數(shù)量較少(365個個體)及每條染色體上SNP數(shù)量變化較大等因素有關(guān)。

4結(jié) 論

本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到5個基因組水平上與周歲細毛羊羊毛長度、原毛量顯著關(guān)聯(lián)的SNP，且注釋5個候選基因。這些候選基因中的3個有與毛發(fā)生長、發(fā)育相關(guān)的生物學功能，且均包含于已知羊毛性狀QTL區(qū)域內(nèi)。這些結(jié)論為本研究中的關(guān)聯(lián)結(jié)果提供進一步的證據(jù)。對這些目標區(qū)域的進一步研究有助于揭示細毛羊羊毛長度、產(chǎn)量等性狀的遺傳機理。

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Received 2015-02-16Returned2015-04-15

Foundation itemXinjiang High-Tech Research and Development Program (No.201211101)； the National Key Technology Support Program of China (No.2011BAD28B05).

First authorDI Jiang, male, professor.Research area:animal genetics and breeding.E-mail:dijiang69@163.com

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Genome-wide Association Studies for Wool and Body Mass Traits in Yearling Fine Wool Sheep

DI Jiang1, LIU Jianfeng2,XU Xinming1,WANG Qiong1,Lazate·Ainiwaer1and YU Lijuan1

(1. Xinjiang Academy of Animal Sciences, Urumqi830000, China;2.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing100193, China)

AbstractFor identifying genomic regions and genes that play roles in staple length, greasy fleece yield and body mass of yearlingfine wool sheep, the genome-wide association studies (GWAS) were performed based on single-locus regression method using genotypes from the OvineSNP50 Bead Chip for these traits. Data consisted of 365 animals from the Chinese merino sheep breed. After we adjusted for multiple testing based on permutations, 2 and 3 genome-wise significant SNPs were identified for staple length, greasy fleece yield respectively. These SNPs were located close to known genes (9.16-143.32 kb). The three genes of FIBIN, HSD17B11, PIAS1 were highlighted, considering their functions of involving in the different signaling pathway related to hair/wool development and growth. The observation of QTL reports for wool staple length and fiber diameter, covering areas surrounding the three genes (SNPs) herein identified provided more evidence for these associations. Future studies targeting these areas could provide further knowledge to discover the genetic architecture underlying staple length and greasy fleece mass traits in Chinese Merino sheep.

Key wordsGWAS; Wool; Body mass；Fine wool sheep

收稿日期：2015-02-06修回日期：2015-04-15

基金項目：新疆高技術(shù)研究項目(201211101)；國家科技支撐項目(2011BAD28B05)。

中圖分類號S813.3

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0496-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.006.html

第一作者：狄江，男，研究員，主要從事家畜遺傳育種領(lǐng)域研究。Email: dijiang69@163.com