謝　歡，周　穎， 楊文香，張　娜，劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院 植物病理系，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心, 河北保定　071001)

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TcLr24小麥NBS-LRR同源基因的克隆與分析

謝歡，周穎， 楊文香，張娜，劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院 植物病理系，河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心, 河北保定071001)

摘要目前已克隆的小麥抗葉銹病基因多數(shù)含有NBS類保守結(jié)構域，為克隆高抗葉銹病 Lr24基因及其抗病相關基因，根據(jù)NBS保守結(jié)構域設計引物，對小麥抗葉銹病近等基因系TcLr24 cDNA進行擴增，得到534 bp的抗病基因同源序列。對該序列進行同源性檢索并驗證，獲得1 408 bp的電子延伸序列。以此通過RACE 技術分別獲取2 797 bp 和3 466 bp的cDNA與gDNA全長產(chǎn)物，其翻譯的蛋白質(zhì)序列含有NBS保守區(qū)的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守結(jié)構，與大麥等單子葉植物NBS類蛋白序列同源性較高，生物信息學分析表明其為穩(wěn)定的親水性蛋白，分子質(zhì)量104.28 ku，理論等電點6.15。半定量RT-PCR表明該片段所在基因序列為組成型表達。

關鍵詞小麥；TcLr24；抗病基因同源序列；NBS

小麥(TriticumaestivumL.)葉銹病在世界各產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生，是小麥的主要病害之一，嚴重時可造成15%～40%甚至更大的產(chǎn)量損失[1]。合理利用抗病品種是該病害防治中最安全、經(jīng)濟和有效的方法?？共』蚝涂共∠嚓P基因的克隆對病原物與寄主互作研究及抗病品種的培育具有重要意義。

同源序列法是分離克隆基因最經(jīng)濟、快捷的途徑之一，其中NBS-LRR類抗病基因類似序列是單子葉植物抗病基因最大的一類，目前已經(jīng)從多種經(jīng)濟作物和糧食作物中分離獲得大量NBS類抗病基因同源序列，并且通過同源序列法結(jié)合圖位克隆法從小麥中克隆獲得的抗葉銹病基因 Lr1[2]、 Lr10[3]、 Lr21[4]均含有NBS-LRR結(jié)構。因此，NBS類抗病相關基因同源序列的分離對抗病基因的分離克隆具有重要意義。

小麥抗葉銹病基因 Lr24在生產(chǎn)上已表現(xiàn)出較好的抗葉銹性，具有很大的應用潛力。該基因目前獲得多個相關的分子標記[5]；利用RACE方法獲得編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、受體激酶、LRR-受體激酶的基因，并用基因沉默技術對3個激酶基因進行初步的功能分析。分離獲得 Lr24介導抗病性所必需的TaRAR基因[6]。此外，張立榮等[7]從TcLr24中獲得2 822 bp的cDNA全長RGA1Q，其編碼產(chǎn)物具有NBS、LRR等抗病基因保守結(jié)構域，在TcLr24基因組中呈單拷貝、組成型表達。這些研究對 Lr24基因的輔助選擇及抗病育種、基因分離及其相關功能研究具有指導意義和應用價值。但是，抗病基因及其相關基因多以基因簇存在，因此要分離克隆抗病基因還需大量工作。本研究根據(jù)NBS類抗病基因保守結(jié)構合成簡并性引物，利用PCR結(jié)合RACE技術，從葉銹菌誘導的小麥葉片cDNA中擴增抗病基因同源序列，以期為克隆抗病相關基因奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料選擇與處理

選用小麥抗葉銹病單基因系TcLr24盆栽，待幼苗長至1葉1心時分別接種對TcLr24表現(xiàn)低毒力的葉銹菌單孢菌系88-26-12-4(BGQQ)，另設不接菌對照，分別于處理0、6、12、24、48、72和96 h取試驗材料。

1.2主要方法

1.2.1NBS類抗病基因同源片段的分離將接菌處理TcLr24樣品不同時間點的RNA樣品等量混合成總RNA池，參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)說明書合成反應所需的cDNA第1鏈。以根據(jù)NBS類保守結(jié)構域GGVGKTT和GLPLAL合成的引物，對cDNA模板進行擴增。

1.2.2NBS類抗病基因同源序列的RACE擴增以TcLr24 cDNA擴增出的534 bp片段為靶序列電子延伸至1 408 bp，并以此分別設計3′端正向基因特異引物(5′-CTTGTTCAATCAGGGA- TGGCCTTGGATA-3′)和5′端反向基因特異性引物(5′-GCTCAAGAACAGTTCCCATGAAG-CATCG-3′)，按照RACE 試劑盒(Clontech)使用說明進行操作，分別對其進行3′RACE和5′RACE擴增，對PCR反應產(chǎn)物分別進行克隆及測序。

1.2.3RACE序列的拼接和驗證利用DNAMAN軟件將所獲得的5′和3′端的cDNA序列與已知靶序列進行拼接，并預測拼接序列的開放閱讀框，在開放閱讀框兩端設計全長驗證引物Y61QCYZ124和Y61QCYZ2920，以TcLr24的cDNA和gDNA為模板進行擴增。PCR產(chǎn)物進行回收測序，將獲得的cDNA序列進行生物信息學分析。

1.2.4半定量RT-PCR分析選取在小麥中組成型表達的基因Actin作為內(nèi)標，通過調(diào)整模板質(zhì)量濃度，使內(nèi)標基因的PCR擴增產(chǎn)物量一致，用于基因的表達分析。

2結(jié)果與分析

2.1同源序列的擴增及序列分析

用NBS類R基因簡并性引物，以TcLr24的cDNA為模板進行擴增，獲得1條500 bp左右的目的片段(圖1)，與預期片段大小相同。將目的條帶進行回收克隆，片段經(jīng)測序長534 bp，全序列與大麥NBS-LRR 抗病蛋白b1部分序列同源性92%。

根據(jù)與534 bp序列同源的大麥1 455 bp(118～1 454 bp為完整的ORF序列)序列設計引物，對TcLr24的cDNA進行擴增，經(jīng)測序拼接后序列長為1 408 bp，將該序列向3′端延長874 bp。該序列翻譯后通讀，含有NB-ARC保守結(jié)構。

以1 408 bp為靶序列，使用設計的3′端正向基因特異引物和5′端反向基因特異引物，應用Touchdown PCR進行擴增，經(jīng)檢測分別獲得1 528 bp 的3′端產(chǎn)物和1 129 bp的5′端產(chǎn)物。與靶序列拼接后獲得全長為3 087 bp的片段(命名為Y61)，編碼919個通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列。具有148 bp的5′非翻譯區(qū)，150 bp 的3′非翻譯區(qū)和29 bp的多聚腺苷酸尾。該序列翻譯的蛋白質(zhì)序列含有NBS保守區(qū)的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD保守結(jié)構和LRR保守結(jié)構。

M. DL2000

2.2全長cDNA和DNA的獲得

在拼接序列的開放閱讀框兩端設計全長驗證引物QC124和QC2920，并以TcLr24的gDNA、cDNA為模板進行PCR擴增，在gDNA和cDNA中均獲得1條3.0 kb左右(3 466 bp，2 797 bp)的擴增片段 (圖2)，分別克隆測序，并將序列提交到NCBI比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)，顯示該基因含1個長為669 bp的內(nèi)含子，2個長分別為655 bp和2 142 bp的外顯子。

M. DL2000

2.3生物信息學分析

2.3.1序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建將所獲得cDNA全長序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTx分析，結(jié)果顯示，其所編碼蛋白與大麥(H.vulgare)、山羊草(Aegilopstauschii)、谷子(Setariaitalica)、小麥(T.aestivum)、燕麥(Avenasativa)、玉米(Zeamays)等植物的NBS-LRR抗病蛋白的同源性較高(圖3)。進一步采用Mega4構建其與其他植物抗病相關蛋白的進化樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)種間距離Y61與山羊草(EMT01263.1)遺傳距離最近。

2.3.2Y61編碼蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構分析利用SMART軟件進行保守域預測，該序列包含1個NB-ARC結(jié)構域(N端191-450)和2個富含亮氨酸基序(LRR，562-595)，且含有2段簡單組分結(jié)構，每個LRR序列含有22～24個氨基酸。

使用 Neural Networks(NN)和Hide Markov Models( HMM)2種模型對Y61氨基酸序列進行信號肽切割位點的預測，結(jié)果表明，Y61蛋白為非分泌性蛋白，不存在信號肽的切割位點。利用TMHMM預測Y61蛋白全長氨基酸序列的跨膜結(jié)構域，發(fā)現(xiàn)該序列不存在跨膜信號。

圖3　Y61蛋白序列與NBS-LRR蛋白序列比較

圖4　Y61蛋白與其他植物NBS-LRR抗病蛋白序列聚類分析

利用ProtScale工具對Y61蛋白的疏水性進行分析，除在第800位氨基酸后有1個較大的親水區(qū)，表明該蛋白是親水性蛋白。ProtParam分析蛋白序列，其中亮氨酸(L)最多，有131個，占氨基酸總數(shù)的14.3%。該蛋白的分子質(zhì)量為104.28 ku，等電點6.15，平均疏水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.137。不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為40.01，表明該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。

利用ExPaSy中的SOPMA軟件預測Y61蛋白的二級結(jié)構，結(jié)果顯示，該蛋白含約61.48%的α-螺旋(α-helix，H)、2.29%的β-轉(zhuǎn)角(β-turn，T)、27.53%的無規(guī)則卷曲(random coil，C)和8.71%的延伸鏈(Extended strand，E)。

2.4同源序列的半定量RT-PCR

以Actin為內(nèi)標引物對TcLr24接菌處理0、6、12、24、48、72和96 h后的cDNA進行擴增，調(diào)整不同時間點cDNA的質(zhì)量濃度(圖5-A)。用該基因特異性引物對TcLr24不同時間點的cDNA進行擴增，表明不同時間點擴增量未見明顯差異(圖5-B)，說明該片段所在基因序列為組成型表達。

A.Actin內(nèi)標引物　Actin internal control primers；B. NBS特異引物　NBS specific primers

3討 論

NBS-LRR類R基因在已知的抗病基因中占很大一部分。NBS結(jié)構域由3個區(qū)域組成，其中，第1區(qū)域為磷酸結(jié)合環(huán)(P-Loop)，又稱激酶(Kinase)la， 主要與ATP或GTP的磷酸結(jié)合；第2區(qū)域為激酶(Kinase)2a；第3區(qū)域為激酶(Kinase)3a，與核糖或DNA的嘌呤結(jié)合有關。根據(jù)其結(jié)構分析，抗病基因在行使抗病功能時需要結(jié)合ATP或GTP。擬南芥RPM1基因的NBS區(qū)的點突變使其在轉(zhuǎn)基因植株中不能誘導過敏性反應[8]，而煙草N基因中20多個NBS區(qū)的氨基酸的代換，一些代換使N基因喪失部分抗性，而另一些則使抗病性完全喪失[9]。因此，抗病基因的NBS保守結(jié)構域可能與病原誘發(fā)子或激發(fā)子(elicitor)及抗病基因信號傳導的下游蛋白的相互作用的特異性有關[10]。LRR中單一氨基酸的變化都會導致抗病反應消失或減弱[11]。

本研究從TcLr24中獲得全長3 087 bp的NBS類小麥抗病基因同源序列，包含完整NBS結(jié)構域，且含有NBS-LRR類抗病基因的高度保守區(qū)，LRR區(qū)域與大麥LRR僅有1個氨基酸差異(第359位氨基酸)，可能在該位點存在堿基替換，但二者功能是否一致尚未知。此外，通過與粗山羊草、玉米、大麥、燕麥、谷子及前人從小麥中獲得的NBS-LRR類蛋白進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該研究獲得序列與粗山羊草和谷子的序列較近，而與其他幾個單子葉植物的抗病蛋白類似物同源性較低。任曉娣等[12]、張楠等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，即使從同一材料(TcLr19)分離得到的不同抗病基因類似物，其同源性高低也不完全相同；另外，不同抗葉銹病基因NBS-LRR結(jié)構的同源性也比較低[12]。因此，其與 Lr24抗病基因的關系還需進一步連鎖分析、功能鑒定等才能確定。該目的基因的獲得及其生物信息學分析，為進一步研究該基因功能提供理論參考。

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ZHANG N,WANG H Y,LIU D Q.Cloning and characterization of a NBS resistance gene homology cDNA sequence from wheat[J].JournalofPlantGeneticResources,2010,11(5):605-610,615 (in Chinese with English abstract).

Received 2015-07-01Returned2015-10-08

Foundation itemNational Program on Key Basic Research Project (973 Program) (No.2013CB127700); Doctoral Foundation of Ministry of Education of China (No.20101302120005); Science and Technology Research Projects of Hebei Educational Committee (No.Q2012010).

First authorXIE Huan, female, master student. Research area: molecular plant pathology. E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

LIU Daqun,male,professor,Ph.D.Research area:molecular plant pathology and bio-control of plant disease.E-mail:ldq@hebau.edu.cn

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation and Characterization of NBS-LRR Homologue from TcLr24

XIE Huan, ZHOU Ying, YANG Wenxiang, ZHANG Na and LIU Daqun

(Department of Plant Pathology, Agricultural University of Hebei, Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province, National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding Heibei071001,China)

AbstractConserved domain of NBS is mostly contained in the cloned wheat leaf rust resistance (Lr) genes. In order to clone high resistant gene Lr24 and its related genes, NBS like conserved primers were designed and 534 bp target fragment was isolated from cDNA of TcLr24,1 408 bp electronic extended sequence was acquired and verified. Then full-length products with 2 797 bp and 3 466 bp were isolated from cDNA and gDNA of TcLr24, respectively. It showed high homology to some NBS type resistance protein like Hordeum vulgare. Conserved domain of P-loop,Kinase 2a,Kinase 3a, and HD of NBS, and LRR domain were contained in this sequence. Bioinformatics analysis showed it was a hydrophilic protein with good stability, and with molecular weight 104.28 ku and theoretical isoelectric point 6.15. It implied the constitute expression model of this gene by semi-quantitative RT-PCR. The results provide basis for further study on cloning the leaf rust resistance genes in wheat.

Key wordsWheat; TcLr24; Resistance genes homologous sequences; NBS

收稿日期：2015-07-01修回日期：2015-10-08

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2013CB127700)；教育部高等學校博士點基金(20101302120005)；河北省高等學?？茖W技術研究計劃(Q2012010)。

通信作者：張娜，女，副教授，博士，研究方向為分子植物病理學。E-mail: zn0318@126.com

中圖分類號S435

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0518-05

Corresponding authorZHANG Na, female, associate professor, Ph.D.Research area:molecular plant pathology.E-mail:zn0318@126.com

網(wǎng)絡出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.012.html

第一作者：謝歡，女，碩士，研究方向為分子植物病理學。E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

劉大群，男，教授，博士，研究方向為植物病害生物防治和分子植物病理學。E-mail: ldq@hebau.edu.cn