李　頻

四川自貢市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(自貢　 643010)

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高效液相色譜法同時測定香青蘭中熊果酸和齊墩果酸含量

李頻

四川自貢市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(自貢 643010)

摘要目的：建立藥材香青蘭中熊果酸和齊墩果酸HPLC含量同時測定方法。方法：ZORBAX C18色譜柱(4.6mm×250mm，5um)，檢測波長：220nm，流速：0.6mL/min，柱溫：25℃，流動相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.04∶0.08)。結果：所測成分熊果酸進樣量在0.1017μg～2.5425μg(r=0.9994)范圍內與峰面積呈良好線性關系；齊墩果酸進樣量在0.3063μg～7.6575μg(r=0.9996)范圍內與峰面積呈良好線性關系。加樣回收率分別是98.07%(RSD=0.66%)和99.41%(RSD=1.02%)。結論：本文所采取的方法準確可靠，適用于香青蘭中熊果酸和齊墩果酸的含量的同時測定。

主題詞熊果酸/中藥分析化學 齊墩果酸/中藥分析化學色譜法, 高壓液相@香青蘭

香青蘭為唇形科植物香青蘭的干燥地上部分[1]，維吾爾名為巴德蘭吉布牙香青蘭[2](Dracocephslum moldavicae L.)，是維吾爾族、蒙古族習用藥材，屬于豆屬豆科菜一年生草本，莖葉帶有芳香味[3]。香青蘭有安神補腦、暖胃養(yǎng)肝、止喘鎮(zhèn)咳等作用，一般用于心臟性的腦病、高血壓引起的頭昏、氣管炎等，《后續(xù)醫(yī)典》中治療肝熱的七味清肝紅花散中就加有此味藥材，其對胃出血也有良好治療效果，在《蒙醫(yī)藥方匯編》記載中七味松石散就加有此藥治療胃出血。近些年有學者研究發(fā)現此藥中含有許多化合物如：黃酮類、氨基酸、木脂素類、萜類、黃酮醇類等[4-6]。

雖香青蘭在中藥治療中使用廣泛，近些年有不少學者對其有進一步研究，但目前對其含量測定方面報導特別是同時測定的報導并不多見。本文所研究的熊果酸和齊墩果酸屬于三萜類的化合物，此類物質對肝損傷有一定的保護作用，還具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤的活性。本文在參考許多前期文獻基礎上[7-9]，利用高效液相色譜，可以讓樣品進行簡單的處理，對香草蘭有效成分熊果酸和齊墩果酸進行同時測定，以期為香青蘭中含量測定及其日后的質量控制提供一定參考價值。

1檢測儀器與材料儀器：美國Walters高效液相色譜儀，包括Walters1520泵，Walters2485雙波長檢測器，Walters726自動進樣器、Empower色譜工作站。藥材：藥材采自內蒙古自治區(qū)小井溝、南天門、蠻漢山。由中藥材專家鑒定所得藥材均為唇形科青蘭屬植物香青蘭。

熊果酸和齊墩果酸的對照品(批號：200928-120742,200704-120709，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析級。

2色譜條件ZORBAX C18色譜柱(4.6mm×250mm，5um)，檢測波長：220nm；流速：0.6mL/min,；流動相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.04∶0.07)；柱溫: 25℃。進樣量10μL；可以看到此條件下，樣品峰的分離度良好。

圖1　香青蘭高效液相色譜圖

3溶液的配制3.1樣品配置方法將獲得的不同時期香青蘭粉碎，選用40目將粉末進行過篩并進行精密稱定1.000g(誤差不大于10%),于索氏提取器中，加入丙酮100mL，加熱回流約4h～5h，之后將丙酮轉移至蒸發(fā)皿中蒸干，用石油醚將殘渣浸潤2次～3次，每次10mL；2min～4min后，棄石油醚上層，用醇定容至5mL，震蕩搖勻，用濾紙過濾，即得到供試品溶液。

3.2對照品溶液的配制精密稱取對照品齊墩果酸10.17mg，加甲醇定容于10mL容量瓶中，之后精密吸出1mL于另10mL容量瓶，定容至刻度，待用(0.1017mg/mL)；精密稱取熊果酸對照品10.21mg，加醇定容至10mL，之后精密吸取3mL于另10mL容量瓶，定容至刻度，待用(0.3063 mg/mL)。

4方法學考察4.1線性關系考察按照上面所描述的色譜條件,分別取對照品的熊果酸、齊墩果酸溶液(1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL)進行測定制表，橫坐標為齊墩果酸溶液、熊果酸進樣量，將峰面積為縱坐標，對所得的數據進行分析,得出回歸方程分別為：熊果酸溶液，回歸方程為Y=341768X-207594(r=0.9994)，在0.1017μg～2.5425μg范圍內與峰面積呈良好線性關系；齊墩果酸溶液，回歸方程為Y=297814X-39645.70(r=0.9996)，在0.3063μg～7.6575μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

4.2穩(wěn)定性實驗取同一份供試品溶液，室溫放置，以時間間隔為1h，3h，5h，7h，9h，吸取樣品進行測定，測得熊果酸的峰面積分別2044631, 2047677, 2045586,2053796, 2046990，RSD計算為2.09%；測得齊墩果酸的峰面積為609237, 600863, 603947, 608810，608139，RSD為1.07%。結果顯示，該實驗測定方法穩(wěn)定性符合要求。

4.3精密度實驗精密吸取樣品溶液10μL，連續(xù)進樣5次，得到熊果酸的峰面積分別為2057440，2049109,2048422，2046631,2049103，RSD為0.79%；齊墩果酸的峰面積分別為603303，602562,602825，603279,603729，RSD結果為1.04%，表明此次制作精密度符合標準。

4.4重復性實驗對同批樣品進行精密稱取1.000g(誤差不大于10%)，將100mL丙酮加入索氏提取器中，進行4h～5h的加熱回流，將加熱回流后所得丙酮轉至蒸發(fā)皿中晾干，每次對殘渣用10mL石油醚進行浸潤并重復操作1～2次，每次浸潤時間為2min～4min，將石油醚上層溶液分離后用醇定容至5mL，震蕩搖勻，用濾紙過濾，得到供試品溶液后，進樣10μL進行測定。熊果酸的含量分別為1.285mg/g，1.259 mg/g，1.278 mg/g，1.288 mg/g，1.291mg/g，1.281 mg/g，RSD為0.89%；齊墩果酸的含量分別為0.465 mg/g，0.453 mg/g，0.452 mg/g，0.449 mg/g，0.461 mg/g，0.457 mg/g，RSD為1.32%。結果表明重復性檢驗方法準確度良好。

4.5回收率實驗對同批樣品進行精密稱取0.5000g(誤差不大于10%),共6份，再分別加入熊果酸和齊墩果酸對照品溶液0.8mL，1.0mL，1.2mL；取本品粉末精密稱定1.000g(誤差不大于10%), 將100mL丙酮加入索氏提取器中，進行4h～5h的加熱回流，將加熱回流后所得丙酮轉至蒸發(fā)皿中晾干，每次對殘渣用10mL石油醚進行浸潤并重復操作1～2次，每次浸潤時間為2min～4min，棄石油醚上層，用醇定容至5mL，震蕩搖勻，用濾紙過濾，得到供試品溶液，并且按照含量測定方法進行測定，得出熊果酸的平均回收率為97.12%，RSD為1.02%；齊墩果酸的平均回收率97.28%為，RSD為0.97%。結果表明準確度良好(見表1)。

表1　回收率測定結果

5樣品含量測定取本品粉末3批(2012-0801、2012-0802、2012-0803)，精密稱定1.000g(誤差不大于10%), 將100mL丙酮加入索氏提取器中，進行4h～5h的加熱回流，將加熱回流后所得丙酮轉至蒸發(fā)皿中晾干，每次對殘渣用10mL石油醚進行浸潤并重復操作1～2次，每次浸潤時間為2min～4min，將石油醚上層溶液分離后用醇定容至5mL，震蕩搖勻，用濾紙過濾，得到供試品溶液。用HPLC方法進行含量測定，結果見表2。

表2　香青蘭中齊墩果酸、熊果酸的含量比例

6討論6.1選擇藥品提取檢測成分齊墩果酸、熊果酸為非極性化學成分，其在乙醇、氯仿、丙酮等有機溶劑中有較好的溶解性，在水和石油醚中溶解性差。根據檢測成分的化學性質，我們對檢測成分的提取設計了以下幾種方式：①乙醇超聲提取，②乙醚索氏提取，③ 甲醇索氏提取，④三氯甲烷超聲提取，⑤丙酮超聲提取。結果顯示索氏提取的含量較其他方式檢測成分提取含量較高，且采用乙醚提取高于甲醇，故此采取了乙醚索氏提取,提取時間選擇為4h～6h，由于4h已基本提取完全，為了節(jié)約成本，最終選擇4h。

6.2流動相的選擇本實驗中所采取的流動相我們采用了，甲醇/水體系，甲醇/水/冰醋酸體系，以及甲醇/水/冰醋酸/三乙胺體系，最終確定為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.04∶0.08), 該體系下物質各成分分離度和峰形均較好。

6.3流速的選擇本實驗中采用的流速是0.6mL/min，預實驗時，嘗試了兩種流速：0.6mL/min和 1mL/min，結果發(fā)現采用0.6mL/min的流速可有效對物質進行分離，且對保留時間無明顯影響，因此本次實驗中選擇的流速為0.6mL/min。

6.4檢測波長的選擇波長小于200nm的時候，發(fā)現信噪比小，定量難度大；波長大于230nm的時候，發(fā)現響應值低，最終選擇波長為220nm,此時兩個檢測物質能很好分開，待測物質相應高，且雜質相應較低。

參考文獻

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(收稿2015-12-24；修回2016-01-12)

Simultaneous determination of ursolic acid and oleanic acid in dracocephalum moldavicum L by

HPLC Department of Pharmacy, Traditional Chinese Medicine Hospital of Zigong(Zigong 643010)

Li Pin

ABSTRACTObjective: To establish method to simultaneous determination the content of ursolic acid and oleanic acid in dracocephalum moldavicum L. Methods: HPLC was carry out on a ZORBAX C18 column (4.6×250 mm, 5um) with mobile phase methanol - water - acetic acid - triethylamine (85∶15∶0.04∶0.08), using flow rate of 0.6 mL/min, the column temperathre was set at 25℃, the detection wavelength was at 220 nm. Results: The linear range of Ursolic acid was 0.1017μg～2.5425μg(r=0.9994), the linear range of oleanic acid was 0.3063μg～7.6575μg(r=0.9996), within this range the linear relationship was good. The average recoveries were 97.12%(RSD=1.02%)and 97.28%(RSD=0.97%), respectively .Conclusion: This method is rapid，accurate and reliable; It could be used to simul taneous determine the content of ursolic acid and oleanolic acid in dracocephalum moldavicum L.

KEY WORDSUrsolic acid/analytical chemistry (TCD)Oleanolic acid/analytical chemistry (TCD)Chromatography, high pressure liquid@Xiangqing Lan

【中圖分類號】R283

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.045