劉占東,李　璐，全國芬，丁　武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100)

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肉桂精油殼聚糖納米粒在冷卻肉保藏中的應(yīng)用

劉占東,李璐，全國芬，丁武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100)

[摘要]【目的】 制備肉桂精油殼聚糖納米粒，以擴大肉桂精油(CEO)在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用范圍，克服其易揮發(fā)的缺陷?！痉椒ā?采用離子凝膠法制備肉桂精油殼聚糖納米粒。通過透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)對肉桂精油殼聚糖納米粒的形態(tài)進行表征，測定其包封率。分別配制質(zhì)量分數(shù)為3%和6%的肉桂精油殼聚糖納米粒保鮮劑(CEO質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%和1.0%)，用其處理冷卻豬肉，檢測其對肉樣色澤(L值、a*值、b*值)、TBARS值、pH和菌落總數(shù)的影響。【結(jié)果】 制備的肉桂精油殼聚糖納米粒顆粒大小均勻、形態(tài)飽滿、呈規(guī)則球形，凍干后形態(tài)仍較為均勻，包封率為(37.5±2.1)%。通過對冷卻肉色澤、TBARS值、pH及菌落總數(shù)的分析得知，包埋質(zhì)量分數(shù)1.0%肉桂精油的肉桂精油殼聚糖納米粒試驗組的冷卻肉在(4±0.5) ℃時儲藏期可達到6 d?！窘Y(jié)論】 制備的肉桂精油殼聚糖納米粒表征良好，可在一定程度上延長冷卻肉的貯藏期。

[關(guān)鍵詞]肉桂精油；殼聚糖；納米粒；冷卻肉

納米顆粒(Nanoparticles，NPs)是運用納米技術(shù)將物質(zhì)制作成粒徑大小在1～100 nm的粒子，其具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)等特性，表現(xiàn)出許多不同于傳統(tǒng)材料的新的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性[1]。將食品材料納米化，與宏觀狀態(tài)下食品性質(zhì)與功能相比，可以賦予食品許多優(yōu)良的性質(zhì)，包括質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、加工性能以及貨架期的穩(wěn)定性等[2]。因此納米技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物技術(shù)、食品工業(yè)等領(lǐng)域大放異彩[3]。

殼聚糖(Chitosan，CS)即聚(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是從甲殼素原料中提取出來的一種安全無毒的天然堿性多糖，作為目前自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一大量存在的陽離子聚合物，殼聚糖具有良好的生物相容性、抗菌性、可降解性和成膜性，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和化學(xué)工業(yè)[4]。殼聚糖是一種廣譜型抗菌劑，對幾十種真菌和細菌的生長都有明顯的抑制作用[5]。

肉桂精油(Cinnamon essential oil，CEO)由桂皮等提取而得，具有明顯的抗氧化和抑菌活性，可以作為天然食品防腐保鮮劑用于食品工業(yè)[6]。但由于精油的易揮發(fā)性，在應(yīng)用過程中容易受環(huán)境影響，導(dǎo)致精油有效成分流失。因此研制包埋的緩釋型精油保鮮劑對食品保鮮意義重大，目前將精油與具備抑菌潛能的緩釋基質(zhì)殼聚糖粒子或殼聚糖納米粒子結(jié)合逐漸成為微生物控制方面新的發(fā)展趨勢[7-8]。本試驗以殼聚糖納米粒為載體包埋肉桂精油，以包封率為指標(biāo)，研究了影響殼聚糖包埋肉桂精油形成納米粒的因素，并探究了最優(yōu)工藝下制備的肉桂精油殼聚糖納米粒(CEO-CS-NPs)的表征、緩釋性能及對冷卻肉的保鮮作用，以期為冷卻肉保鮮研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑肉桂精油(純度90%)，鄭州麥雪龍食品香料有限公司生產(chǎn)；殼聚糖(中等分子量，脫乙酰度≥90%)，上海阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)；新鮮豬肉，購自陜西楊凌好又多超市。試劑包括冰醋酸(HAc，分析純)、三聚磷酸鈉(TPP，分析純)、吐溫-80(AR，分析純)、無水乙醇、95%乙醇、二氯甲烷、蒸餾水和超純水。

1.1.2儀器與設(shè)備78-1型磁力加熱攪拌器，上海浦東物理化學(xué)儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10D真空冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；UV-1700紫外可見分光光度計，SHIMAPZU CORPORATION；pHS-3C精密pH計，上海日島科學(xué)儀器有限公司；HANGPINGJA2003天平(感量100～0.000 1 g)，上海天平儀器廠；HT7700透射電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司；S4800掃描電鏡，日本日立公司；WSC-S測色色差計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺，富康空氣凈化公司；智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福試驗儀器廠；滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；WG-43鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。1 L煮沸并冷卻的蒸餾水中加入胰蛋白胨5 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15 g，pH調(diào)至7.0，加NaCl 8.5 g，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2肉桂精油殼聚糖納米粒(CEO-CS-NPs)的制備與檢測

1.2.1制備參照 Calvo等[9]和Hosseini等[10]的方法并加以改進，利用離子凝膠結(jié)合O/W乳液的方法制備肉桂精油殼聚糖納米粒。稱取CS粉末，20 ℃下溶于體積分數(shù)1%的HAc溶液中，1 μm 微孔濾膜過濾，用5 mol/L NaOH 調(diào)pH為4，加入吐溫-80(親水親油指數(shù)(HLB)15.9)至其體積分數(shù)為1%，60 ℃加熱2 h，制得5.0 mg/mL的CS溶液。將交聯(lián)劑TPP溶于超純水，用0.45 μm微孔濾膜過濾，配成1.5 mg/mL的TPP溶液。稱取肉桂精油，溶于適量的二氯甲烷中，得油相，然后緩慢逐滴將其加入到水相CS溶液中，使肉桂精油質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL(以CS溶液體積計算)，20 ℃溫和攪拌(300 r/min)30 min，得O/W乳液。然后逐滴加入TPP溶液至CS與TPP溶液體積比為2∶1，滴加速度為2滴/秒，同前條件攪拌乳液30 min，所得乳白色懸液即為肉桂精油殼聚糖納米粒(CEO-CS-NPs)，離心(12 000 r/min)15 min，取下層，蒸餾水沖洗，-40 ℃真空冷凍干燥備用。用相同的制備方法，向CS 溶液中滴加TPP 溶液，但不加入肉桂精油，制得CS/TPP微粒(CS-NPs)，作為空白對照。

1.2.2包封率(Encapsulation effeciency，EE)檢測將制備的CEO-CS-NPs懸液用超濾器(超濾膜Mr 截留值為10 000)在12 000 r/min條件下離心30 min，取截留的CEO-CS-NPs顆粒，加入等體積的2 mol/L鹽酸溶液破碎納米粒，用體積分數(shù)95%乙醇溶解定容至10 mL容量瓶中。用紫外分光光度計在275 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準曲線確定肉桂精油的質(zhì)量濃度，計算包封率(EE)。以相同方法制備的破碎的CS-NPs為對照。

EE(%)=(m2/m1)×100%。

式中：m1為制備納米粒加入的總的肉桂精油的量，m2為包埋在納米粒中的肉桂精油的量。

1.2.3透射電鏡觀察取上述制備的CEO-CS-NPs溶液，用體積分數(shù)1%的醋酸溶液稀釋10倍后取1滴，用質(zhì)量分數(shù)2% 的磷鎢酸(PTA)復(fù)染后置于銅網(wǎng)上，自然干燥，最后用透射電鏡觀察粒子的形態(tài)、數(shù)量及大小。

1.2.4掃描電鏡觀察將CEO-CS-NPs和CS-NPs粉末分別均勻置于云母片上，固定后噴金。用掃描電鏡(電壓5 kV)觀察其形態(tài)和大小。

1.3CEO-CS-NPs對冷卻肉的保鮮效果

1.3.1肉樣的處理將購買的新鮮豬肉于4 ℃冰箱中儲藏24 h以充分排酸并使中心溫度降至4 ℃后分割成規(guī)則小塊，準確稱取肉樣數(shù)份，每份100 g，分別浸入100 mL保鮮劑中處理約30 s，取出瀝干，用聚乙烯保鮮膜包好置于聚苯烯托盤放于(4±0.5) ℃冰箱中儲藏待測。試驗設(shè)計見表1。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，本研究選用質(zhì)量分數(shù)0.2%和1.0%的CEO添加量進行試驗。

表 1　肉桂精油殼聚糖納米粒保鮮效果試驗設(shè)計

注：括號中的數(shù)據(jù)為CEO的質(zhì)量分數(shù)。

Note：Data in parentheses are the mass fractions of CEO.

1.3.2測定指標(biāo)與方法分別于儲藏2，4，6，8，10和12 d取樣測定肉樣的色澤、TBARS值，在儲藏1，3，5，7，9 d取樣測pH，在儲藏1，3，5，7，9和11 d取樣測菌落總數(shù)。

(1)色澤。用WSC-S測色色差計測定肉樣色澤，用白板對設(shè)備進行校準，測定指標(biāo)為L值、a*值和b*值。L值表示樣品的亮度，a*值表示肉樣的紅色度，b*值表示肉樣的黃度。每組肉樣隨機取2個點測定，每個點重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

(2) TBARS值。TBARS 值以每千克肉樣品中丙二醛的毫克數(shù)表示。取10 g待測肉樣研細，置于三角瓶中，加入50 mL體積分數(shù)7.5%的三氯乙酸溶液(含體積分數(shù)0.1%的EDTA)，振蕩搖勻30 min，用雙層濾紙過濾。取5 mL濾液，加入5 mL 0.02 mol/L 的2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴40 min，冷卻1 h后，1 600 r/min 離心5 min，取上清液，準確加入5 mL氯仿，搖勻，靜置分層后取上清液，分別在532和600 nm處測吸光值OD532、OD600，計算TBARS(單位：mg/kg)。

(3)pH。用PHS-3C型精密pH計測肉樣pH值。取待測肉樣10 g，剪碎后加入煮沸并冷卻的雙蒸水90 mL，振蕩20 min，雙層紗布過濾，用pH計測過濾液pH值，重復(fù)測3次，結(jié)果取均值。

(4) 菌落總數(shù)。菌落總數(shù)按GB4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準 食品微生物學(xué)檢測 菌落總數(shù)測定》[11]中的瓊脂平板計數(shù)法進行測定。

1.4統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel 2007和Minitab 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用ANOVA分析各處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1肉桂精油殼聚糖納米粒的表征

2.1.1包封率在殼聚糖質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、肉桂精油0.5 mg/mL、pH為4.0的條件下，制得的懸液呈乳白色，包封率為(37.5±2.1)%。

2.1.2透射電鏡(TEM)觀察通過透射電鏡對納米粒進行表征分析，結(jié)果顯示，CEO-CS-NPs呈球形，粒徑較為均勻，形態(tài)飽滿，大小約為180 nm(圖1-a)，空白納米粒CS-NPs同樣呈球形，形態(tài)規(guī)則(圖1-b)。

圖 1CEO-CS-NPs(a)和CS-NPs(b)的透射電鏡圖

Fig.1TEM micrograph of CEO-CS-NPs (a) and CS-NPs(b)2.1.3掃描電鏡(SEM)觀察圖2 結(jié)果顯示，CEO-CS-NPs和CS-NPs凍干后，仍呈球形顆粒，顆粒大小較為均勻。

圖 2　CEO-CS-NPs(a)和CS-NPs(b)的SEM圖

色澤能在一定程度上反映出肉的新鮮度和健康狀況，并與消費者的購買意愿直接關(guān)聯(lián)[12]。由表2可以看出，隨著儲藏期的延長，各處理L值減小，即冷卻肉亮度下降；在儲藏后期，對照組L值下降較大，顏色較淺，缺乏光亮。試驗第4，8，10和12天，處理ⅣL值顯著高于其他處理組(P<0.05)，較其他處理組光亮度好；第6天，處理ⅣL值低于處理Ⅲ，但仍顯著高于其他處理(P<0.05)。試驗期內(nèi)，Ⅲ、Ⅳ處理的L值分別顯著高于Ⅰ、Ⅱ處理(P<0.05)，分析原因為肉桂精油包埋后能減少精油的揮發(fā)損失，使其保鮮作用得以延長。

表 2　保鮮劑處理的冷卻肉在儲藏期內(nèi)色澤的變化

續(xù)表 2　Continued table 2

注：CK2代表對照組儲藏2 d 處理，其他處理代號依此類推；同一儲藏時間同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：CK2 represents control group stored for 2 days,other treatments are similar.Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) between storage times.

由表2可知，試驗第2，4，6，8和12天，各處理組a*值顯著高于對照組(P<0.05)，第10天除了處理Ⅰ外其他處理也均顯著高于對照組；試驗第6～12 天，含1.0%CEO的處理Ⅱ和Ⅳ的a*值顯著高于不含精油的處理Ⅴ和Ⅵ(P<0.05)，這可能是受肉桂精油本身顏色的影響。第12天，含1.0%CEO的處理Ⅳa*值為11.07，顯著高于其他處理(P<0.05)，說明在儲藏后期該處理可以良好地保持肉的紅度。

表2結(jié)果顯示，隨著儲藏期的延長，各處理b*值總趨勢為增加；6～12 d，對照組b*值顯著高于其他處理(P<0.05)；第12天，處理Ⅳb*值為9.87，顯著低于其他處理(P<0.05)，效果最好。

2.3CEO-CS-NPs對冷卻肉TBARS值的影響

TBARS值是評價脂質(zhì)氧化程度的一個指標(biāo)[13-14]。一般當(dāng)冷卻肉的TBARS值大于0.5 mg/kg時，會有氧化異味產(chǎn)生。由圖3可知，從儲藏的第6天開始，各處理TBARS值顯著低于對照組(P<0.05)，說明各保鮮劑處理均可在一定程度上控抑脂肪氧化；Ⅲ、Ⅳ處理的TBARS值分別顯著低于處理Ⅰ、Ⅱ，說明肉桂精油被殼聚糖包埋后，其抗氧化作用大于游離的精油，該結(jié)果與包埋酚類物質(zhì)用于面粉抗氧化的研究結(jié)果[15]具有一致性；隨著CEO含量的增加，TBARS值增幅減小，但由預(yù)試驗得知，如果繼續(xù)增加精油含量，會有明顯的精油味道，因此CEO對肉感官品質(zhì)的影響好壞還有待進一步研究，所以不建議繼續(xù)增大肉桂精油的含量；處理Ⅳ的TBARS值極顯著低于其他各處理(P<0.01)，說明在本試驗條件下，處理Ⅳ控制脂肪氧化的效果最佳。處理Ⅳ儲藏前6天的TBARS值始終不超過 0.5 mg/kg，而對照組在儲藏3 d后即超過0.5 mg/kg。

圖 3　CEO-CS-NPs對冷卻肉TBARS的影響

2.4CEO-CS-NPs對冷卻肉pH的影響

肉的新鮮程度與pH值的關(guān)系復(fù)雜，pH值在一定程度上能反應(yīng)出肉的新鮮度，通常新鮮肉pH為5.8～6.2，次鮮肉pH為6.3～6.6，變質(zhì)肉pH在6.7以上。由圖4可知，在儲藏的前7 d，處理Ⅲ和Ⅳ 的pH相對穩(wěn)定，變化幅度小，符合新鮮肉的pH標(biāo)準，而其他組pH變化幅度較大；從第7天開始，處理Ⅳ pH值顯著低于處理Ⅲ(P<0.05)，表現(xiàn)最佳，說明隨著CEO含量的增加，其對肉的保鮮效果增強。

2.5CEO-CS-NPs對冷卻肉菌落總數(shù)的影響

圖5顯示，各試驗組在貯藏前3 d的菌落總數(shù)上升緩慢，對照組與其他處理組之間差異不顯著(P>0.05)；3 d后，菌落總數(shù)增長速度明顯加快，其中對照組增長最快，但處理Ⅲ與處理Ⅳ的菌落總數(shù)增長相對較慢，顯著低于無CEO的處理Ⅴ和Ⅵ(P<0.05)；貯藏至9 d后，處理Ⅱ和Ⅳ的菌落總數(shù)分別顯著低于處理Ⅰ和Ⅲ(P<0.05)，說明隨著CEO含量的增加，其抑菌效果增強；儲藏7 d后，處理Ⅳ的菌落總數(shù)始終處于最低水平，抑菌效果最好。空白納米粒處理Ⅴ和Ⅵ的菌落總數(shù)增長較快的原因可能是，空白納米粒溶液處理有水分，使樣品表面保持濕潤狀態(tài)，而高濕條件有利于微生物的生長。

圖 4　CEO-CS-NPs對冷卻肉pH值的影響

圖 5　CEO-CS-NPs對冷卻肉菌落總數(shù)的影響

3討論與結(jié)論

本試驗中，肉桂精油經(jīng)過殼聚糖包埋后，有效地克服了其易揮發(fā)的缺點；同時，因其具有緩釋作用，有效地延長了肉桂精油的保鮮作用時間，這與包埋山梨酸用于香腸保鮮的結(jié)果[16]具有一致性。肉桂精油殼聚糖納米粒對冷卻肉的保鮮機制為：納米粒表面吸附的肉桂精油因其可以快速從體系中解析出來而先發(fā)揮作用；而納米粒內(nèi)部的肉桂精油因納米粒需吸脹、溶解、解吸后肉桂精油才能被釋放[17]，所以發(fā)揮保鮮作用的時間可以得到有效延長。本試驗中不同批次制備的納米粒存在一定差異，可見條件的控制還不夠完善，若要將其應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，還需要進一步的研究。肉桂精油殼聚糖納米粒作為一種新型的抑菌體系，可進一步研究其與其他保鮮處理(如氣調(diào)等)相結(jié)合使用后的效果，以更好地發(fā)揮其保鮮作用。

本試驗制備了肉桂精油殼聚糖納米粒(CEO-CS-NPs)，并研究了其對冷卻豬肉儲藏期間理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的影響。由試驗結(jié)果可知，制備的納米粒顆粒飽滿，大小均一，凍干后顆粒大小仍較為均勻，包封率為(37.5±2.1)%。包埋肉桂精油的CEO-CS-NPs能有效保護肉品色澤，抑制冷卻肉表面細菌的增長，其中以包埋質(zhì)量分數(shù)1.0%CEO的CEO-CS-NPs效果最好，具有改善肉貯藏品質(zhì)的作用。通過分析肉樣的L值、a*值、TBARS、pH及菌落總數(shù)等指標(biāo)得出，CEO-CS-NPs對冷卻肉保藏的有效性表現(xiàn)為：隨著包埋的CEO質(zhì)量分數(shù)增加到1.0%，其在色澤和菌落總數(shù)指標(biāo)上的表現(xiàn)優(yōu)于其他試驗組。包埋質(zhì)量分數(shù)0.2%CEO的CEO-CS-NPs的效果略弱于包埋質(zhì)量分數(shù)1.0%CEO的CEO-CS-NPs。綜合理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)(特別是TBARS值)得出，經(jīng)包埋質(zhì)量分數(shù)1.0%CEO的CEO-CS-NPs處理的冷卻豬肉，在(4±0.5) ℃條件下儲藏時保存時間可達到6 d，明顯優(yōu)于對照組3 d的儲藏期。

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Application of cinnamon essential oil loaded chitosan nanoparticles in chilled meat preservation

LIU Zhan-dong,LI Lu,QUAN Guo-fen,DING Wu

(CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study used cinnamon essential oil (CEO) loaded chitosan nanoparticles to expand its application in preservation of chilled meat by overcoming its volatility.【Method】 The CEO loaded chitosan nanoparticles were prepared using ionic gelation process.Then they were characterized by TEM and SEM and encapsulation efficiency was measure.Preservatives of CEO loaded chitosan nanoparticles with mass fractions of 3% and 6% (CEO mass fractions were 0.2% and 1.0%) were prepared.Chilled pork was then processed with preservatives,and color (L value,a* value,b* value),TBARS value,pH and total number of colonies were detected.【Result】 CEO loaded chitosan nanoparticles had a spherical and plump shape with uniform particle size after freeze-drying.The encapsulation efficiency (EE) was (37.5±2.1)%.Based on the analysis of color,TBARS,pH and total number of colonies of chilled meat,preservation of chilled meat by 1% CEO loaded chitosan nanoparticles reached 6 days at (4±0.5) ℃.【Conclusion】 The CEO loaded chitosan nanoparticles had good characterization and can extend the preservation of chilled meat.

Key words：cinnamon essential oil;chitosan;nanoparticles;chilled meat

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.026

[收稿日期]2014-09-26

[基金項目]陜西省自然科學(xué)基金項目(K33202096)

[作者簡介]劉占東(1990-)，男，吉林松原人，在讀碩士，主要從事畜產(chǎn)食品深加工與安全控制研究。E-mail:454061077@qq.comE-mail:dingwu10142000@hotmail.com

[通信作者]丁武(1971-)，男，陜西吳堡人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事畜產(chǎn)食品深加工與安全控制研究。

[中圖分類號]TS205.7

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)05-0193-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.052.html