王　淋，烏云塔娜，葉生晶

(1 中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3 國家林業(yè)局 中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，湖南 長(zhǎng)沙 410014 )

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杜仲幼果和葉片MVA途徑基因表達(dá)差異分析

王淋1,2，烏云塔娜1,2，葉生晶3

(1 中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3 國家林業(yè)局 中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，湖南 長(zhǎng)沙 410014 )

[摘要]【目的】 杜仲橡膠是一種多萜類物質(zhì)，而甲羥戊酸(MVA)途徑是合成萜類物質(zhì)的重要途徑之一。分析杜仲M(fèi)VA途徑相關(guān)基因表達(dá)的差異，預(yù)測(cè)杜仲橡膠合成的主要上游途徑。【方法】 在杜仲幼果和葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因功能注釋和表達(dá)分析，確定MVA途徑的系列基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)差異分析?！窘Y(jié)果】 杜仲橡膠合成的MVA途徑共涉及23條Unigene，分別為3條EuACOT、3條EuHMGS、8條EuHMGR、2條EuMK、1條EuPMK和6條EuMDP基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)數(shù)據(jù)對(duì)基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明杜仲M(fèi)VA途徑中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在幼果和葉片中的表達(dá)量具有顯著差異，其中僅EuMDP9在葉片中的表達(dá)量大于幼果，而其余基因在幼果的表達(dá)量大于葉片；EuHMGR15和EuHMGR17只在幼果中特異表達(dá)。【結(jié)論】 MVA途徑絕大部分基因在果實(shí)中大量表達(dá)，這與果實(shí)中杜仲橡膠含量遠(yuǎn)超過葉片的現(xiàn)象相吻合，推測(cè)杜仲果實(shí)MVA途徑為杜仲橡膠合成的主要途徑。

[關(guān)鍵詞]杜仲；幼果和葉片；甲羥酸途徑；基因表達(dá)差異

杜仲(EucommiaulmoidesOlives) 是中國特有的名貴滋補(bǔ)藥材，具有補(bǔ)肝腎、益筋骨、安胎等多種功效[1]；除此之外，杜仲葉片、果實(shí)、樹皮、根中均含有大量的天然膠狀物質(zhì)——杜仲橡膠 (EucommiaulmoidesRubber，EUR)。杜仲橡膠是溫帶地區(qū)重要的膠源，杜仲樹在溫帶地區(qū)適生面積較廣。杜仲橡膠與天然三葉橡膠的化學(xué)成分相同，但化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，天然橡膠為順式聚異戌二烯，而杜仲橡膠為反式聚異戌二烯，這種獨(dú)特的橡塑二重性質(zhì)決定了杜仲橡膠具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。杜仲果實(shí)和葉片中橡膠含量有明顯差異，一般而言，果實(shí)含膠率為10%～12%，葉片含膠率僅為1%～3%[4]。因此，進(jìn)行不同組織的基因表達(dá)與橡膠含量的相關(guān)性研究，比較分析橡膠合成相關(guān)基因的表達(dá)差異，闡明基因表達(dá)差異與橡膠含量的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系，可以揭示杜仲橡膠合成的基因調(diào)控機(jī)制。

杜仲橡膠屬于多萜類化合物質(zhì)，Chaykin等[5]和Lynen等[6]首次提出了萜類物質(zhì)合成的甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑，且該途徑主要位于細(xì)胞質(zhì)中，又被稱為細(xì)胞質(zhì)途徑。Takeshi等[7]利用同位素標(biāo)定法標(biāo)記萜類物質(zhì)合成MVA 途徑代謝的中間產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，在杜仲的含膠細(xì)胞中存在MVA代謝途徑，提出杜仲橡膠生物合成與MVA代謝途徑有關(guān)及杜仲橡膠是反式聚異戊二烯的觀點(diǎn)。到目前為止，杜仲中已分離鑒定的萜類物質(zhì)有16種以上，MVA途徑主要包括6步化學(xué)反應(yīng)：① 3分子的乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(Acetyl-CoAacethyl transferase，ACOT)的催化作用下生成乙酰乙酰輔酶A；② 乙酰乙酰輔酶A在3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxyl-3-methylglutaryl-CoAsynthase，HMGS)的催化作用下生成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA；③ 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)催化生成甲羥戊酸；④甲羥戊酸在MVA甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase，MK)的磷酸化作用下形成5-磷酸-甲羥戊酸；⑤ 5-磷酸-甲羥戊酸隨后在甲羥戊酸磷酸激酶(5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)的作用下生成甲羥戊酸焦磷酸；⑥甲羥戊酸焦磷酸在甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDC)的作用下脫羧生成異戊烯基焦磷酸IPP(IsopentenyI-PP)[8-11]。

近年來，轉(zhuǎn)錄組研究在RNA水平上可獲得高通量基因表達(dá)水平的相關(guān)信息，而且是解析基因表達(dá)差異、新基因發(fā)掘、基因結(jié)構(gòu)功能研究的有效方法之一[12-13]?；贗llumina/Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具有高度自動(dòng)化、讀取片段多、適合進(jìn)行各種大小片段的測(cè)序、能夠在單核苷酸水平檢測(cè)對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄情況等多種功能[14-15]。本研究根據(jù)李鐵柱等[16-17]已構(gòu)建的杜仲果實(shí)和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，將杜仲幼果和葉片轉(zhuǎn)錄組中的Unigene根據(jù)GO功能分析得出萜類化合物生物合成的代謝通路，對(duì)其幼果和葉片萜類合成MVA途徑基因的表達(dá)差異進(jìn)行了分析，闡明基因表達(dá)差異與橡膠含量的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系，以期為杜仲萜類化合物尤其是杜仲橡膠的生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

選取中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心(國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心)國審良種‘華仲6號(hào)’杜仲的幼果(授粉后50 d，杜仲橡膠合成第1個(gè)高峰期)和葉片(展葉后55 d，橡膠含量較高)為試驗(yàn)材料，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2杜仲樣品RNA的提取

分別取杜仲幼果和葉片約100 mg，采用Omega公司的Plant RNA Kit試劑盒提取杜仲幼果和葉片的總RNA，提取完畢測(cè)定總RNA品質(zhì)，如果A260/A280比值在1.8～2.2，表明提取的RNA符合要求。將杜仲幼果和葉片的RNA(約2 μg)送至深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因功能注釋。

1.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及Unigene功能注釋方法

深圳華大基因公司采用Illumina技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，首先是將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機(jī)剪切為小片段(或?qū)NA片段化后再反轉(zhuǎn)錄)，這樣可產(chǎn)生了成千上萬的短cDNA reads，然后再進(jìn)行Illumina測(cè)序。獲得序列數(shù)據(jù)后，對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接組裝，首先使用短reads組裝軟件SOAP denovo做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝，然后利用paired-end reads對(duì)Scaffold做補(bǔ)洞處理，最后將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對(duì)(期望值<0.000 01)，取比對(duì)結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。Unigene的表達(dá)量計(jì)算使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)，其計(jì)算公式如下：

式中:設(shè)RPKM為Unigene A的表達(dá)量，則C為唯一比對(duì)到Unigene A的reads數(shù)，N為唯一比對(duì)到所有Unigene的總reads數(shù)，L為Unigene A的堿基數(shù)[18]。

2結(jié)果與分析

2.1杜仲萜類物質(zhì)合成MVA途徑的代謝位點(diǎn)

將杜仲幼果和葉片Unigene輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MVA合成途徑共有6個(gè)基因23條Unigene被注釋，如圖1所示，其中代謝位點(diǎn)2.3.1.9為乙酰乙酰CoA硫解酶 (Acetyl-CoA acethyl transferase，ACOT)，共被注釋3條Unigene，記為EuACOT8-10；代謝位點(diǎn)2.3.3.10為3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)，被注釋3條Unigene，記為EuHMGS4-6；代謝位點(diǎn)1.1.1.34為3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)，被注釋8條Unigene，記為EuHMGR12-19；代謝位點(diǎn)2.7.1.36為甲羥戊酸激酶 (Mevalonate kinase，MK)，被注釋2條Unigene，記為EuMK3-4；代謝位點(diǎn)2.7.4.2為甲羥戊酸磷酸激酶 (5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)，被注釋1條Unigene，記為EuPMK3；代謝位點(diǎn)4.1.1.33為甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶 (Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDP)，被注釋6條Unigene，記為EuMDP6-11。

圖 1　杜仲M(fèi)VA途徑代謝位點(diǎn)

2.2杜仲乙酰乙酰CoA硫解酶基因(EuACOT)的確定及表達(dá)差異

2.2.1EuACOT的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片ACOT基因均有3條Unigene被注釋，與油茶(Camelliaoleifera,ADD10719.1)和煙草(Nicotianatabacum,AAU95619.1)的ACOT基因相似性達(dá)到82%～91%(表1)，因此命名為EuACOT基因，繼杜仲成熟果實(shí)EuACOT1-7基因家族[19]，命名為EuACOT8-10。

表 1　杜仲幼果和葉片EuACOT基因的相關(guān)信息

2.2.2EuACOT在杜仲幼果和葉片中的表達(dá)量差異乙酰乙酰CoA硫解酶是萜類物質(zhì)合成MVA途徑的起始酶，對(duì)眾多蛋白的乙?；哂行揎椬饔肹20-21]。由圖2可見，EuACOT在杜仲幼果和葉片中均有表達(dá)，且在幼果中的表達(dá)量均大于葉片；其中EuACOT8和EuACOT10在幼果中的表達(dá)量顯著高于葉片。無論在杜仲幼果還是葉片中，EuACOT的表達(dá)量大小順序均為EuACOT8>EuACOT10>EuACOT9。

2.3杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(EuHMGS)的確定及表達(dá)差異

2.3.1EuHMGS的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片HMGS基因有3條Unigene被注釋，與煙草屬觀賞煙(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02025.1)、喜樹(Camptothecaacuminata,ACD87446.1)的HMGS基因相似性達(dá)到61%～89%(表2)，因此命名為杜仲的Eu-HMGS基因，繼杜仲成熟果實(shí)EuHMGS1-3基因家族[19]，記為EuHMGS4-6。

圖 2　EuACOT基因在杜仲幼果和葉片中的差異表達(dá)

Unigene命名UnigenenameUnigene編號(hào)UnigeneID長(zhǎng)度/bpLength參考序列ID號(hào)ReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuHMGS4103121525ABV02025.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae089EuHMGS51361924ACD87446.1喜樹Camptothecaacuminata087EuHMGS640010558ABV02025.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae7e-6261

2.3.2EuHMGS基因在杜仲幼果和葉片中的表達(dá)量差異從圖3可以看出，EuHMGS家族的成員在杜仲幼果和葉片中均有表達(dá)，且在幼果中的表達(dá)量顯著高于葉片。無論在幼果還是葉片中，其表達(dá)量大小順序均為EuHMGS5>EuHMGS4>EuHMGS6。

圖 3　EuHMGS在杜仲幼果和葉片中的差異表達(dá)

2.4杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因(EuHMGR)的確定及表達(dá)差異

2.4.1EuHMGR的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片HMGR基因均有8條Unigene被注釋，與杜仲(E.ulmoides,AAV54051.1)、黃龍膽(Gentianalutea,BAE92730.1)、煙草(N.tabacum,AAB87727.1)、胡黃連(Picrorhizakurrooa，ABC74565.1)、丹參(Salviamiltiorrhiza，ACD37361.1)、黃龍膽(Gentianalutea，BAE92730.1)、喜樹(C.acuminata，P48021.1) 的HMGR基因相似性達(dá)到53%～99%(表3)，命名為EuHMGR基因，繼杜仲成熟果實(shí)EuHMGR1-11家族基因[19]，命名為EuHMGR12-19。

2.4.2EuHMGR基因在幼果和葉片中的表達(dá)量差異從圖4可以看出，家族成員EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特異表達(dá)，而其他EuHMGR家族成員在幼果和葉片中均有表達(dá)；EuHMGR14和EuHMGR19在葉片中的表達(dá)量大于幼果，而其他EuHMGR家族成員的表達(dá)量均是幼果大于葉片，其中EuHMGR18在幼果中的表達(dá)量顯著高于葉片。

2.5杜仲甲羥戊酸激酶基因(EuMK)的確定及表達(dá)差異

2.5.1EuMK的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片MK基因均有2條Unigene被注釋，與橡膠樹(Heveabrasiliensis,AAL18925.1)的MK基因相似性達(dá)到77%～85%(表4)，命名為EuMK基因，繼成熟果實(shí)EuMK1-2基因家族[19]，命名為EuMK3-4。

表 3　杜仲幼果和葉片EuHMGR基因的相關(guān)信息

Unigene命名UnigenenameUnigene編號(hào)UnigeneID長(zhǎng)度/bpLength參考序列IDReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMK3189271094AAL18925.1橡膠樹Heveabrasiliensis1e-17277EuMK42112480AAL18925.1橡膠樹Heveabrasiliensis6e-3385

2.5.2EuMK在杜仲幼果和葉片中的表達(dá)量差異從圖5可以看出，EuMK家族成員在杜仲幼果和葉片中均有表達(dá)，且在幼果中的表達(dá)量顯著高于葉片，無論是果實(shí)還是葉片中，表達(dá)量大小均為EuMK3>EuMK4。

2.6杜仲甲羥戊酸磷酸激酶基因(EuPMK)的確定及表達(dá)差異

2.6.1EuPMK的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片PMK基因均有1條Unigene被注釋，與茶(Camelliasinensis,AFC34137.1)的PMK基因相似性達(dá)到90%(表5)，故命名為EuPMK基因，繼杜仲成熟果實(shí)EuPMK1-2基因家族[19]，命名為EuPMK3。

圖 5　EuMK基因在杜仲幼果和葉片中的差異表達(dá)

Unigene命名UnigenenameUnigene編號(hào)UnigeneID長(zhǎng)度/bpLength參考序列IDReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuPMK3103211817AFC34137.1 茶Camelliasinensis090

2.6.2EuPMK基因在幼果和葉片中的表達(dá)量差異從圖6可以看出，EuPMK3基因在杜仲幼果和葉片中均有表達(dá)，且在幼果中的表達(dá)量大于葉片。

2.7杜仲甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(EuMDP)的確定及表達(dá)差異

2.7.1EuMDP的確定從杜仲幼果和葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片MDP基因有6條Unigene被注釋，與橡膠樹(Heveabrasiliensis,AAL18927.1，BAF98285.1)、煙草屬觀賞煙(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02028.1)、人參(Panaxginsen,ADI80345.1)的MDP基因相似性達(dá)到82%～89%(表6)，命名為EuMDP基因，繼成熟果實(shí)EuMDP1-5基因家族[19]，記為EuMDP6-11。

圖 6　EuPMK在杜仲幼果和葉片中的差異表達(dá)

Unigene命名UnigenenameUnigene編號(hào)UnigeneID長(zhǎng)度/bpLength參考序列ID號(hào)ReferencesequenceID物種species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMDP62961485AAL18927.1橡膠樹Heveabrasiliensis5e-1782EuMDP741324240ABV02028.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-3689EuMDP845009224ABV02028.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-4088EuMDP946901275ADI80345.1人參Panaxginsen1e-2689EuMDP1047529306ADI80345.1人參Panaxginsen1e-2689EuMDP116878952BAF98285.1橡膠樹Heveabrasiliensis9e-16084

2.7.2EuMDP在杜仲幼果和葉片中的表達(dá)量差異從圖7 可以看出，EuMDP家族成員在幼果和葉片中均有表達(dá)，其中EuMDP6和EuMDP9在葉片中的表達(dá)量大于幼果，其余成員表達(dá)量均是幼果大于葉片；除了EuMDP6在幼果與葉片中的表達(dá)量無顯著差異外，杜仲EuMDP家族其他成員在幼果與葉片中的表達(dá)量均存在顯著差異。

圖 7　EuMDP在杜仲幼果和葉片中的差異表達(dá)

3討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，萜類物質(zhì)合成MVA途徑共涉及23條Unigene，其中包括3條ACOT(EuACOT8-10)、3條HMGS(EuHMGS4-6)、8條HMGR(EuHMGR12-19)、2條MK(EuMK3-4)、1條PMK(EuPMK3)、6條MDP(EuMDP6-11)。利用RPKM法對(duì)杜仲幼果和葉片轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算分析，可以消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)基因表達(dá)豐度的影響[16-17,22]，從而可直接準(zhǔn)確地反應(yīng)基因的表達(dá)水平，為分析基因表達(dá)情況提供了方便有效的方法。根據(jù)杜仲幼果和葉片轉(zhuǎn)錄組RPKM數(shù)據(jù)分析，杜仲M(fèi)VA途徑中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在杜仲幼果和葉片中的表達(dá)量具有顯著差異，EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特異表達(dá)。另外，幼果和葉片中表達(dá)量具有顯著差異的基因中，僅EuMDP9在葉片中的表達(dá)量大于幼果，其余基因在杜仲幼果中的表達(dá)量大于葉片。綜上所述，杜仲果實(shí)和葉片中均存在萜類合成的MVA代謝途徑，且基因表達(dá)量在果實(shí)和葉片中具有明顯差異，果實(shí)的基因表達(dá)量顯著高于葉片，這與果實(shí)中杜仲橡膠含量遠(yuǎn)超過葉片相一致，推測(cè)杜仲橡膠合成的上游途徑主要以MVA途徑為主。

萜類是一大類植物次生代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多[23]。MVA途徑相關(guān)酶基因主要參與萜類物質(zhì)的合成，且對(duì)光合作用、呼吸作用、生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能等重要生物學(xué)進(jìn)程有影響，對(duì)細(xì)胞代謝的諸多方面以及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著重要作用。Wititsuwannakul等[24]證明巴西橡膠HMGR基因的表達(dá)量與其橡膠含量相關(guān)；Chappell[25]等將倉鼠的HMGR基因轉(zhuǎn)入煙草中，結(jié)果提高了總的 HMGR 酶活性，同時(shí)甾醇的含量也有一定增加；Ren Chen等[26]將EuIPI基因轉(zhuǎn)入杜仲，從而提高了轉(zhuǎn)基因杜仲中反式聚異戊二烯的含量，推測(cè)EuIPI的表達(dá)調(diào)控可提高杜仲產(chǎn)膠量。因此，綜上所述，將MVA途徑相關(guān)基因表達(dá)量提高或抑制其表達(dá)應(yīng)該會(huì)對(duì)IPP的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生影響，亦或是MVA途徑相關(guān)基因結(jié)合IPP基因一起調(diào)控下游杜仲膠合成關(guān)鍵基因的表達(dá)可以影響反式聚異戊二烯的含量，即合成杜仲膠的含量。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:114-115.

Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China [M].Beijing:Chemical Industry Press,2005:114-115.(in Chinese)

[2]杜紅巖.我國的杜仲膠資源及其開發(fā)潛力與產(chǎn)業(yè)發(fā)展思路 [J].經(jīng)濟(jì)林研究,2010,28(3):1-6.

Du H Y.Discussion on industry development and exploration potential of gutta-percha resource in China [J].Nonwood Forest Research,2010,28(3):1-6.(in Chinese)

[3]薛萍.杜仲研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景 [J].經(jīng)濟(jì)林研究,1995,13(3):56-58.

Xue P.Research status and development prospects ofEucommiaulmoidesOliv [J].Nonwood Forest Research,1995,13(3):56-58.(in Chinese)

[4]杜紅巖,杜蘭英,傅建敏,等.杜仲不同器官含膠率的差異及其相關(guān)性分析 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,26(4):1-4.

Du H Y,Du L Y,Fu J M,et al.The difference and its pertinence analysis of the gutta-percha contentin organs ofEucommiaulmoidesOliv [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology(Nat Sci Ed),2006,26(4):1-4.(in Chinese)

[5]Chaykin S,Law J,Phillips A H,et al.Phosphorylated intermediates in the synthesis of squalene [J].PNAS,1958,44(10):998-1004.

[6]Lynen F,Efferer H,Henning U,et al.Farnesyl-pyrophosphatund 3-Methyl-Δ3-butenyl-1-pyrophosphat,die biologischen vorstufendes squalens zur biosyntheseder terpene,Ⅲ [J].Angewandte Chemie,1958,70(24):738-742.

[7]Takeshi B,Michiko M,Koichirou G,et al.Contribution of mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to polyisoprenoid biosynthesis in the rubber-producing plantEucommiaulmoidesOliver [J].Z Naturforsch C,2010,65:363-372.

[8]蘭文智,余龍江,蔡永軍,等.類異戊二烯非甲羥戊酸代謝途徑的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 [J].西北植物學(xué)報(bào),2001,21(5)：1039-1047.

Lan W Z,Yu L J,Cai Y J,et al.Advance on molecular biology of isoprenoids non-mevalonate patnway [J].Acat Botanica Boreali-Occiden Sinica,2001,21 (5)：1039-1047.(in Chinese)

[9]韓軍麗,李振秋,劉本葉.植物萜類代謝工程 [J].生物工程學(xué)報(bào),2007,23(4):561-569.

Han J L,Li Z Q,Liu B Y.Metabolic engineering of terpenoids plants [J].Chinese Journal of Biotechnology,2007,23(4):561-569.(in Chinese)

[10]Mann V,Harker M,Pecker I,et al.Metabolic engineering of astaxanthin production in tobaccof lowers [J].Nat Biotechnol,2000,18:888-892.

[11]Lichtenthaler H K.The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate path- way of isoprenoid biosynthesis in plants [J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1999,50:47-65.

[12]祁云霞，劉永斌，榮威恒.轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNA-Seq 及其應(yīng)用 [J].遺傳,2011,33(11):1191-1202.

Qi Y X,Liu Y B,Rong W H.RNA-Seq and its applications:a new technology for transcriptomics [J].Hereditas,2011,33(11):1191-1202.(in Chinese)

[13]井趙斌，魏琳，俞靚，等.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其在牧草基因資源發(fā)掘中的應(yīng)用前景 [J].草業(yè)科學(xué),2011,28(7):1364-1369.

Jing Z B,Wei L,Yu L,et al.Transcription sequencing and its application prospective on discovering the gene resources of forages [J].Pratcultural Science,2011,28(7):1364-1369.(in Chinese)

[14]Wang X W,Luan J B,Li J M,et al.De novo characterization of a whitefly transcriptome and analysis of its gene expression during development [J].BMC Genomics，2010,24(11):400.doi:10.1186/1471-2164-11-400.

[15]侯志偉,王赟,高宏,等.dRNA-seq原理及其在原核生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的應(yīng)用 [J].遺傳,2013,35(8):983-991.

Hou Z W,Wang Y,Gao H,et al.The principle of dRNA-seq and its applications in prokaryotic transcriptome analyses [J].Hereditas,2013,35(8):983-991.(in Chinese)

[16]李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲果實(shí)和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,32(11):22-30.

Li T Z,Du H Y,Liu H M,et al.Transcriptome data assembly and gene function annotation ofEucommiamaturefruits and leaves [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology (Nat Sci Ed),2012,32(11):22-30.(in Chinese)

[17]李鐵柱,杜紅巖,劉慧敏,等.杜仲幼果和成熟果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,32(10):9-17.

Li T Z,Du H Y,Liu H M,et al.Transcriptome data assembly and gene function annotation ofEucommiamaturefruits and young fruits [J].Journal of Central South University of Forestry & Technology (Nat Sci Ed),2012,32(10):9-17.(in Chinese)

[18]Mortazavi A,Williams B A,Mccue Kenneth,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J].Nat Methods,2008,5(7):621-628.

[19]王淋,烏云塔娜,葉生晶.杜仲成熟果實(shí)和幼果 MVA 途徑基因表達(dá)差異分析 [J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(4):45-51.

Wang L,Wuyun T N,Ye S J.Analysis on gene differential expression in ripe and young fruits ofEucommiaulmoidesby MVA pathway [J].Nonwood Forest Research,2013,31(4):45-51.(in Chinese)

[20]張琳，譚曉風(fēng)，胡嬌,等.油茶乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因cDNA克隆及序列特征分析 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,31(8):108-112.

Zhang L,Tan X F,Hu J,et al.Cloning and sequence characterization of cDNA encoding acety-lCoAC-acetyl transferase inCamelliaoleifera[J].Journal of Central South University of Forestry & Technology(Nat Sci Ed),2011,31(8):108-112.(in Chinese)

[21]王計(jì)平,史華憑,李潤(rùn)植.植物種子油合成的調(diào)控與遺傳修飾 [J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2007,7(4):488-493.

Wang J P,Shi H P,Li R Z.Regulation and genetic modification of seed oil synthesis in plants [J].Journal of Plant Genetic Resources,2007,7(4):488-493.(in Chinese)

[22]Mortazavi A,Williams B A,Mccue K,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J].Nat Methods,2008,5(7):621-628.

[23]鄭清平,余龍江,劉智,等.紅豆杉細(xì)胞非甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶基因dxr的克隆與分析 [J].生物工程學(xué)報(bào),2004,7(20):548-553.

Zheng Q P,Yu L J,Liu Z,et al.Cloning and analys is of cDNA encoding key enzyme gene (dxr) of the non-MVA pathway inTaxuschinensiscells [J].Chinese Journal of Biotechnology,2004,7(20):548-553.(in Chinese)

[24]Wititsuwannakul R,Wititsuwannakul D,Suwanmanee P.Purification and characterization of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from latex of Hevea [J].Phytochem,1990,29:1401-1403.

[25]Chappell J,Wolf F,Proulx J,et al.Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plant [J].Plant Physiol,1995,109:1337-1343.

[26]Ren Chen,Yoko Harada,Takeshi Bamba,et al.Overexpression of an isopentenyl diphosphate isomerase gene to enhance trans-polyisoprene production inEucommiaulmoidesOliver [J].BMC Biotechnology，2012,12:78.

Differential expression of MVA pathway genes in young fruits and leaves ofEucommiaulmoidesOliver

WANG Lin1,2,WUYUN Ta-na1,2,YE Sheng-jing3

(1Non-timberResearchandDevelopmentCenterofCAF,Zhengzhou,Henan450003,China;2TheEucommiaEngineeringResearchCenterofStateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China;3CentralSouthForestInventoryandPlanningInstituteofStateForestryAdministration,Changsha,Hunan410014,China)

Abstract:【Objective】 Eucommia ulmoides Rubber (EuR) is one type of terpenoids,which can be synthesized by mevalonate (MVA) pathway.This study analyzed the differential expression of genes in MVA pathway in young fruits and leaves of E.ulmoides oliver and predicted main pathways of EuR synthesis.【Method】 According to the high-throughput transcriptome sequencing (RAN-seq) data,functional annotation and expression analysis in E.ulmoides young fruits and leaves,unigenes of MVA pathway were determined,and their expressions were systematically analyzed.【Result】 Twenty-three unigenes in MVA pathway were annotated including 3 acetyl-CoA C-acetyltransferase (EuACTO),3 hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (EuHMGS),8 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (EuHMGR),2 mevalonate kinase (EuMK),1 phosphomevalonate kinase (EuPMK),and 6 diphosphomevalonate decarboxylase (EuMDP).Reads Per Kilo bases per Million reads (RPKM) data analysis showed that the expressions of EuACOT8,EuACOT10,EuHMGS4,EuHMGS5,EuHMGS6,EuHMGR18,EuMK3,EuMK4,EuMDP7,EuMDP8,EuMDP9,EuMDP10,and EuMDP11 were significantly different in young fruits and leaves.Only the expression of EuMDP9 in leaves was greater than in young fruits,while the expressions of other genes in young fruits were greater than in leaves.Furthermore,EuHMGR15 and EuHMGR17 were unique in young fruits.【Conclusion】 Most of genes in MVA pathway were abundantly expressed in young fruits,which was consistent with the fact that rubbers form fruits were more than from leaves.Therefore,MVA pathway was considered the main synthetic pathway of EuR.

Key words：Eucommia ulmoides Olives;young fruits and leaves;MVA pathway;differential expression of gene

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.013

[收稿日期]2014-09-29

[基金項(xiàng)目]國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004029)

[作者簡(jiǎn)介]王淋(1986-)，女，遼寧鞍山人，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林育種研究。E-mail：174816279@qq.com[通信作者]烏云塔娜(1975-)，女，內(nèi)蒙古通遼人，教授，主要從事經(jīng)濟(jì)林育種栽培研究。E-mail：tanatanan@163.com

[中圖分類號(hào)]Q786

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)05-0097-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.026.html