唐 珍，郭冬梅

木質(zhì)素單體合成基因的分子進化分析

唐 珍，郭冬梅*

(川北醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，四川南充637000)

近年來，人們對基因所受的凈化選擇壓力強度與基因在代謝途徑或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所處的位置之間是否具有顯著相關(guān)性進行了激烈爭論．為解決這一爭論，本研究通過挖掘6個十字花目物種的全基因組序列庫，獲得了它們所擁有的全部10個參與木質(zhì)素單體合成的基因家族成員．在此基礎(chǔ)上，分別對每一基因家族進行分子進化分析．結(jié)果表明，參與木質(zhì)單體合成的但基因所受到的凈化選擇壓力強度與其在代謝途徑中所處的位置之間無相關(guān)性．本研究通過合理的取樣、可靠的分析方法以及理想的代謝途徑獲得了可靠的研究結(jié)果，并為解決解決以上爭議提供了有力的依據(jù)．

木質(zhì)素單體合成途徑;基因家族;分子進化;凈化選擇

基因在進化過程中所受的選擇壓力有3種類型，即凈化選擇(非同義突變對基因適合度有害)、中性選擇(非同義突變對適合度沒有影響)和正選擇(非同義突變對適合度有利)［1－2］．分子進化研究的方法之一即檢測基因所受的選擇壓力，進而探討基因進化與功能之間的關(guān)系．最初的分子進化研究對象主要是單個基因或基因家族，之后轉(zhuǎn)向為整個代謝途徑或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)．在這些研究中，關(guān)于基因所受到的自然選擇壓力強度與基因在代謝或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所處的位置是否具有相關(guān)性，引起人們激烈的爭論，研究者通過對不同代謝途徑或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行研究后得出截然不同的結(jié)論．有研究結(jié)果表明二者之間存在顯著的相關(guān)性，即位于代謝途徑上游或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的基因受到更強烈的凈化選擇作用，而位于其他位置的基因則受到更為松弛的選擇壓力［3－6］;然而，最近有對參與花器官發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的所有基因家族分子進化的研究，研究認(rèn)為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)并不能對基因的進化速率產(chǎn)生影響，能對其產(chǎn)生影響的是基因本身所行使的功能，即基因在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置與基因所受到的選擇壓力無關(guān)［7］．這2種截然不同的觀點到底是因為研究對象不同，即不同的代謝途徑或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能有不同的進化模式，還是由于某些研究中所采用的分析方法不當(dāng)造成的呢?要解決這一問題，需要對更多的代謝途徑進行研究．

木質(zhì)素是維管植物的重要組成部分，具有重要的生物學(xué)功能．它主要分布于植物細胞的次生細胞壁，為植物的向上生長提供機械支撐，參與植物中水分和溶質(zhì)的運輸以及植物的防御過程，在植物對環(huán)境的適應(yīng)中扮演重要角色［8－9］．木質(zhì)素由木質(zhì)素單體聚合而成，木質(zhì)素單體合成途徑是苯丙烷類代謝途徑的一個分支，另一分支是類黃酮合成途徑［10］．目前對木質(zhì)素單體合成途徑已有較深入的研究，特別是在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，參與該途徑的所有基因都被克隆，且基因功能也有深入研究［11－12］(圖1)，這為本研究提供了堅實的研究基礎(chǔ)．

本研究擬對參與木質(zhì)素單體合成途徑的所有基因進行分子進化研究．利用植物全基因組數(shù)據(jù)庫資源，以十字花目(Brassicales)中具有全基因組序列的6個物種為材料，通過同源搜索獲得參與該途徑的10個基因家族在6個物種中的直系同源成員信息．這10個家族包括:phenylalanine ammonialyase(PAL);cinnamate 4－h(huán)ydroxylase(C4H);4－coumarate:CoA ligase(4Cl);p－h(huán)ydroxycinnamoyl－CoA(HCT);caffeic acid/5－h(huán)ydroxyconiferaldehyde O－methyltransferase(COMT);p－coumarate 3－h(huán)ydroxylase(C3H);ferulate 5－h(huán)ydroxylase(F5H);caffeoyl－CoA O－methyltransferase (CCoAOMT);cinnamoyl－CoA reductase(CCR); cinnamyl alcohol dehydrogenase(CAD)．利用軟件PAML分別對這10個基因家族進行選擇檢驗，進而探討以上基因在木質(zhì)素單體合成途徑中所處的位置與基因所受到的自然選擇壓力的相關(guān)性．

1 材料與方法

1．1 序列搜索及直系同源成員的確定 由于木質(zhì)素合成途徑的10個基因家族都是多拷貝基因家族，但是真正參與木質(zhì)素單體合成途徑的僅僅是其中的一個或少數(shù)幾個成員［13］．本研究根據(jù)J．Rase等［11］的工作，并結(jié)合有關(guān)這些基因的功能研究結(jié)果［14－17］，從 NCBI獲得 Arabidopsis thaliana中所有真正參與木質(zhì)素單體合成途徑的基因家族成員信息，即所謂的bona fide成員．分別以每一個成員的核苷酸序列為模板，利用BLAST對植物全基因組數(shù)據(jù)庫(http://www．phytozome．net/)中十字花目的其他5個物種(即Arabidopsis lyrata，Capsella rubella，Brassica rapa，Thellungiella halophila，Carica papaya)進行同源搜索．在參考已有的相關(guān)基因家族的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果基礎(chǔ)［13－18］，重新構(gòu)建這10個基因家族在以上6個物種中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系．根據(jù)重建的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，就可以初步確定6個物種中所有真正參與木質(zhì)素單體合成途徑的bona fide成員，即10個基因家族成員在6個物種中各自的直系同源成員．序列分析中，序列比對采用BioEdit軟件［19］，系統(tǒng)發(fā)育重建采用PhyML軟件［20］．

1．2 選擇分析 最大似然法檢測基因所受的自然選擇壓力，使用PAML中的 codeml模塊分析軟件［21］．本研究分別對以上10個基因矩陣進行位點模型分析和枝模型(Free ratio branch model)分析．位點模型假定不同位點可以受到不同的選擇壓力，而系統(tǒng)樹上所有的枝則受到相同的選擇壓力，主要參數(shù)設(shè)置為Model=0;NSsites=0、1、2、3、7、8．模型M0/M3、M1a/M2a和M7/M8利用LRT進行兩兩比較，再通過卡方檢驗比較不同模型之間是否有顯著差異［22］．枝模型假定系統(tǒng)樹上不同枝可以受到不同的選擇壓力，而所有位點受到相同的選擇壓力，主要參數(shù)設(shè)置為Model=1;NSites=0［23］．

2 結(jié)果與分析

2．1 基因拷貝數(shù)目及序列特征 在本研究所涉及的6個物種中，10個基因家族的基因拷貝數(shù)目變異情況見表1，其中PAL和4CL的拷貝數(shù)目最多，為3～6個．基因成員數(shù)目最多的物種是Brassica rapa，為2～6個，這可能與該物種近期發(fā)生過全基因組的3倍化有關(guān)［24］．另外，除個別基因在個別物種中有3個成員外，剩下8個基因(除了 PAL和4CL外)在其他5個物種(除Brassica rapa外)中的成員數(shù)目基本為1～2個．兩條序列間的變異程度可以用系統(tǒng)發(fā)育樹中的枝長來度量，枝長代表了每一個密碼子的核苷酸替代數(shù)目．所有的枝長之和就是樹長，可以用它來衡量一個序列矩陣的整體變異程度［25－26］．本研究所涉及的 10個基因矩陣，除CCoAOMT外(樹長為0．56)，其余9個基因矩陣的樹長都在2～10的范圍內(nèi)(表2)．

2．2 選擇檢驗結(jié)果 位點模型的檢驗結(jié)果顯示所有基因在M0模型(所有位點以及所有枝都受到相同的選擇壓力)下的ω值變異范圍是0．02～0．15 (表2)．通過對不同模型的似然值ln L進行卡方檢驗，結(jié)果為:1)M0與M3差異顯著，表明不同位點受到的選擇壓力是有差異的;2)M1a(中性選擇模型)與M2a(正選擇模型)差異不顯著，表明M2a模型未能檢測到正選擇位點;3)M7/M8是M1a/M2a的改良模型，相對于M2a，M8更容易檢測到正選擇位點，其中在5個基因(C4H，C3H，F(xiàn)5H，COMT，CAD)中，這2個模型差異顯著．有關(guān)正選擇位點的貝葉斯分析中，僅2個基因(C3H和CAD)有唯一正選擇位點，其貝葉斯后驗概率(P)大于0．95(表2)．枝模型檢驗的結(jié)果顯示，除COMT的基因樹上有1個枝的ω值大于1外，其余所有基因樹上的所有枝的ω值都小于1(表2)．

表1 不同物種中的基因拷貝數(shù)目Table 1 Gene copy numbers in different species

表2 選擇檢驗結(jié)果Table 2 Results of selection test

3 討論

在用PAML進行選擇檢驗時，序列矩陣的變異程度(可以用樹長來度量)對于檢驗結(jié)果的可靠性有重要影響．一般說來，中等變異程度的序列矩陣(1＜樹長＜10)所得結(jié)果最為可靠．若序列間相似性太高(樹長＜1)，很難檢測到正選擇位點;反之，若序列變異太大(樹長＞10)，則所檢測到的正選擇位點屬于假陽性的可能性增加［25－26］．在本研究中，除CCoAOMT矩陣的樹長為0．56外，其余9個基因家族矩陣的樹長都在2～10的范圍內(nèi)(表2)．此外，當(dāng)單獨增加CCoAOMT的物種取樣，使樹長增加到6．7，選擇檢驗分析的結(jié)果仍無顯著變化(結(jié)果未顯示)．這表明本研究所涉及的基因家族矩陣都屬于中等變異程度，因此選擇檢驗結(jié)果的可靠性較高．

此外，能否準(zhǔn)確鑒定矩陣中成員間的同源關(guān)系類型，即它們彼此屬于直系還是旁系同源，這也會對檢驗結(jié)果的可靠性產(chǎn)生重要影響．本研究挑選十字花目的6個物種為研究對象，可以確保準(zhǔn)確鑒定基因間是否屬于直系同源．首先，該研究所挑選的6個物種都具有全基因組序列，這確保了在搜索基因家族成員時不會漏掉相關(guān)成員信息．其次，參與木質(zhì)單體合成途徑的所有基因在擬南芥中都做了詳盡的功能研究，因此容易確定參與木質(zhì)素合成途徑的成員．在本研究中，以擬南芥所有木質(zhì)單體基因為模板，通過同源搜索獲得了其他5個物種中同源序列．再對每一個基因家族進行系統(tǒng)發(fā)育重建，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的結(jié)果，就可以比較準(zhǔn)確地判斷哪些成員是擬南芥中成員的直系同源基因．這樣就獲得了其他5個物種中可能參與木質(zhì)素合成途徑的成員信息．因此，在本研究所涉及的10個基因矩陣中，來源于6個物種的成員應(yīng)該都屬于直系同源成員．以上合理的取樣和理想的代謝途徑這2個研究前提為隨后探討該代謝途徑中基因的選擇壓力與位置之間的關(guān)系這一科學(xué)問題提供了保障．

從理論上看，對于代謝途徑或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最終產(chǎn)物而言，有人推測位于上游或中心位置的基因?qū)认掠位蜻吘壩恢玫幕虍a(chǎn)生更重要的影響，因此前者應(yīng)該受到更強烈的自然選擇作用［3］．有一些具體的研究結(jié)果支持這一理論［3－6］．然而，當(dāng)人們對更多的代謝途徑或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行研究后，卻發(fā)現(xiàn)在某些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，基因所受到的選擇壓力與基因在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置無關(guān)，而可能與基因本身所行使的功能相關(guān)［7］．本研究的選擇分析結(jié)果表明，參與木質(zhì)素單體合成途徑的10個基因中，除了2個位點檢測到正選擇外，其余所有位點主要受到強烈的凈化選擇的作用(ω值變異范圍是0．02～0．15)(表2)．而除COMT的基因樹上有1個枝的ω值大于1外，其余所有基因樹上的所有枝的ω值都小于1(表2)，表明這些枝也都受到了凈化選擇作用．此外，基因所受到的凈化選擇強度與基因在代謝途徑中所處的位置無相關(guān)性．比如，位于代謝途徑第一位的PAL基因和位于分支位點的4CL基因的ω值并沒有小于其他基因(圖1和表2)，表明PAL和4CL所受到的選擇壓力并沒有比其它基因更大．此外，基因所受到的選擇壓力與基因家族拷貝數(shù)目之間也無顯著相關(guān)性，比如PAL和4CL擁有最多的基因拷貝數(shù)目，但并沒有表現(xiàn)出受到強烈或者更松弛的選擇壓力(表1和2)．也許，不同的代謝途徑或者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能具有不同的進化模式，這也是生物多樣性的體現(xiàn)．要解決這一爭論，需要對更多的代謝途徑或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行詳盡的分子進化研究．在本研究中，取樣是合理的(一個目內(nèi)不同物種，并且都具有全基因組序列)，分析方法是可靠的(序列變異適中)，所挑選的代謝途徑是理想的(參與木質(zhì)單體合成途徑的基因都已被清晰鑒定)，因此研究結(jié)果具有很高的可信度．而以前的研究很難同時滿足以上3個條件．

致謝 川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計劃項目(CBY13－A－ZP04和CBY15－A－YB27)對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意．

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Molecular Evolution of Genes Involved in the Monolignol Biosynthesis Pathway

TANG Zhen，GUO Dongmei

(Department of Biochemistry，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan)

In recent years，it is hotly debated whether there is a significant correlation between the strength of purifying selection and gene placement in its biochemical or regulatory network．In this study，all monolignol biosynthetic genes spanning ten families were recovered from 6 species with whole genome sequenced of Brassicales plants，and studies of molecular evolution of these genes were also conducted．Except PAL and 4CL have 3～6 copies in each species，gene copy number of the rest eight gene families is mainly 1～2．Results of selection test using PAML indicate that most sites of these genes are highly conserved and under purifying selection．However，there is no correlation between the strength of purifying selection and gene placement．

monolignol biosynthesis pathway;gene family;molecular evolution;purifying selection

Q3－3

A

1001－8395(2016)05－0760－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．05．025

(編輯 周 俊)

2015－09－20

四川省教育廳自然科學(xué)重點基金(15ZA0213)和四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013JY0072)

*通信作者簡介:郭冬梅(1983—)，女，講師，主要從事基因家族進化的研究，E－mail:dongmeiguo@nsmc．edu．cn