楊菊，張軍，原麗，曲雪松，祁金順

雙受體激動劑CI-1206拮抗Aβ1-42所致小鼠空間學(xué)習記憶損傷的作用*

楊菊，張軍，原麗，曲雪松，祁金順△

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，太原030001)

目的:探討葡萄糖依賴性促胰島素釋放激素(GIP)和胰高血糖素樣肽1(GLP-1)雙受體激動劑CI-1206拮抗淀粉樣β蛋白(Aβ)所致小鼠空間工作記憶及長時程記憶損傷的作用。方法:C57小鼠經(jīng)側(cè)腦室注射Aβ1-42寡聚體建立AD動物模型，經(jīng)腹腔注射CI-1206進行藥物干預(yù)，隨機分為對照組(saline+D-PBS)、Aβ1-42+saline、CI-1206+D-PBS、Aβ1-42+CI-1206組(n=12)，而后聯(lián)合應(yīng)用Y-迷宮和Morris水迷宮行為學(xué)手段檢測小鼠空間學(xué)習記憶。結(jié)果:①Aβ1-42+saline組小鼠在Y迷宮自發(fā)交替實驗中進臂正確百分比明顯低于對照組(P＜0．05);Aβ1-42+CI-1206組則明顯高于單獨給予Aβ1-42組(P＜0．05);②Morris水迷宮結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ1-42+saline組的小鼠逃避潛伏期明顯延長，目標象限游泳時間百分比降低(P＜0．05)，經(jīng)CI-1206處理可明顯改善(P＜0．05);③Aβ1-42和CI-1206均不影響小鼠的運動能力和視力。結(jié)論:腦室注射Aβ影響小鼠短期工作記憶及長期空間學(xué)習記憶能力;腹腔注射CI-1206可拮抗Aβ1-42所致的短期和長期記憶損傷。

CI-1206;淀粉樣β蛋白;Y迷宮;Morris水迷宮;空間學(xué)習記憶;小鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，其發(fā)病率隨著人口老齡化的加速而逐年升高，嚴重影響老年人的壽命和生活質(zhì)量。然而，目前仍缺乏有效的預(yù)防和治療AD的方法或藥物。在AD漫長的發(fā)病過程中，從輕度認知障礙(MCI)，到晚期嚴重智力下降和癡呆［1］，Aβ和磷酸化Tau蛋白都扮演著重要的角色，兩者還可以引起其他病理表現(xiàn)如炎癥、大腦基底樹突減少、膽堿能神經(jīng)元丟失和突觸數(shù)量減少等［2，3］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AD的發(fā)病與2型糖尿病之間有著密切關(guān)系［4，5］。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素和胰島素受體(IR)廣泛表達于大腦皮層、海馬、下丘腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng);胰島素和IR異常不僅與糖尿病發(fā)病機制相關(guān)，也參與AD的諸多病理過程［6］。然而，胰島素治療AD并不是一種理想的選擇。

近年來，治療T2DM新藥研究熱點聚焦于腸促胰島素(incretin)。腸促胰島素是人體內(nèi)的腸源性激素，主要包括胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)和葡萄糖依賴性促胰島素釋放激素(glucose-dependent insulinotropic，GIP)。GLP-1及其類似物具有誘導(dǎo)神經(jīng)突生長、減輕Aβ導(dǎo)致的突觸可塑性和認知行為損傷、減輕腦出血模型鼠的氧化應(yīng)激和細胞凋亡等神經(jīng)保護作用［7，8］。同樣，GIP在改善海馬突觸可塑性、減輕腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)、減輕小鼠空間參考記憶損傷等方面亦有著明顯的保護效應(yīng)［9，10］。CI-1206是一種新型的單分子雙受體激動劑，其在體內(nèi)可同時激活GLP-1和GIP受體，發(fā)揮良好的降血糖及促進胰島素釋放功能。CI-1206這種新型雙受體激動劑的外周效應(yīng)已被報道明顯優(yōu)于單受體激動劑的作用［11］，但其是否能夠拮抗Aβ的神經(jīng)毒性作用，發(fā)揮中樞性的神經(jīng)保護效應(yīng)還不清楚。因此，本研究在制備側(cè)腦室注射Aβ所致的小鼠學(xué)習記憶損傷動物模型基礎(chǔ)上，通過外周慢性持續(xù)給予CI-1206，觀察了CI-1206的神經(jīng)保護效應(yīng)。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗試劑Aβ1-42(Abcam，英國)依說明書分裝，使用前經(jīng)DMSO重懸后加入D-PBS到終濃度(2．25 mg/ml)，37℃孵育36 h以形成Aβ1-42寡聚體。CI-1206由上海強耀生物科技有限公司合成，使用前用生理鹽水溶解，終濃度為0．017 mg/ml。

1．1．2實驗動物與分組實驗選用健康雄性C57小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京)，體重為(25±5)g。48只小鼠在溫度為20℃～24℃、濕度為55%～60%、光照周期為12 h∶2 h和自由飲食的飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)7 d后，隨機分為四組:(1)對照組(saline+ D-PBS);(2)Aβ1-42+saline組;(3)CI-1206+DPBS組;(4)Aβ1-42+CI-1206組(n=12)。

1．2方法

1．2．1動物手術(shù)及側(cè)腦室注射將小鼠用5%水合氯醛(0．007～0．008 ml/g，i．p．)麻醉后，固定于腦立體定位儀(Neurostar，德國)上。根據(jù)小鼠腦圖譜(Paxinos and Waton)給予側(cè)腦室(前囟后0．5 mm，旁開1．1 mm，深度1．5 mm)注射Aβ1-42(Abcam，2 nmol/4μl，1μl/min)或等體積的vehicle(DPBS)。術(shù)后第2天，腹腔注射CI-1206(25 nmol/kg/ day)或等體積saline 21 d直至行為學(xué)實驗結(jié)束。

1．2．2 Y迷宮實驗腹腔給藥21 d后，首先進行Y迷宮行為學(xué)自發(fā)交替實驗。Y迷宮由三個完全相同的臂組成，三臂互為120度角，呈三等分輻射狀。Y迷宮自發(fā)交替實驗是一種常用的檢測嚙齒類動物短時程空間工作記憶的測試手段。實驗時，將小鼠放在三個臂的交匯點，讓小鼠自由進出三個臂，主要記錄指標包括:8 min內(nèi)小鼠進入各臂的順序和進入各臂的總次數(shù)。小鼠四肢全部進入一臂后記為進入該臂，否則視為未進臂。以連續(xù)進入三個不同的臂為一次正確交替反應(yīng)，記錄為正確交替次數(shù)，進臂正確率(=正確交替次數(shù)/(進臂總次數(shù)-2)×100%)反應(yīng)小鼠的工作記憶能力。在每一只鼠實驗結(jié)束后下一只鼠放入迷宮之前，用75%酒精棉球擦拭裝置，減少氣味對實驗的干擾。所有小鼠的自發(fā)活動由宮體上方的攝像頭及記錄軟件(SMART，Panlab Harward Apparatus，Bioscience Company，Holliston，MA，USA)記錄。

1．2．3 Morris水迷宮實驗Morris水迷宮實驗是用于檢測大小鼠長時程空間參考記憶的一種經(jīng)典手段。水迷宮由直徑為110 cm、深度為60 cm的不銹鋼水池作為宮體，內(nèi)壁涂成白色。實驗前將水池充滿自來水，實驗時，加入鈦白粉使得直徑約15 cm的水下平臺(水面下1．5 cm)不可見，水溫維持在25℃±2℃。所有小鼠活動由宮體上方攝像頭及記錄軟件(Ethovision 3．0，Noldus Information Technology，Wageningen，荷蘭)記錄。Morris水迷宮實驗測試分3部分進行:定位航行實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗。主要觀察指標為:小鼠逃避潛伏期和游泳距離、小鼠在目標象限(即平臺所在象限)內(nèi)游泳的時間和距離占總時間和總距離的百分比、小鼠游泳速度以及小鼠尋找可視平臺的潛伏期。實驗共6 d，前5天為空間定位航行實驗，檢測小鼠在60 s內(nèi)找到水下隱藏平臺的學(xué)習能力，記錄找到平臺所需的逃避潛伏期。定位航行實驗結(jié)束后第2天，即第6天，進行撤去水下平臺后的空間探索實驗，檢測小鼠在目標象限(即原平臺所在象限)游泳時間占全部游泳時間(60 s)的百分比，反映小鼠空間記憶能力。為了排除小鼠運動能力及視力障礙對實驗結(jié)果造成的影響，空間探索實驗6 h后進行可視平臺實驗。觀察各組小鼠找到可視平臺所需時間及小鼠平均游泳速度。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，采用SPSS13．0軟件統(tǒng)計分析及GraphPad Prism軟件作圖，結(jié)果進行析因分析。

2 結(jié)果

2．1慢性腹腔注射CI-1206逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42所致的小鼠空間工作記憶損傷

單獨給予Aβ1-42(Aβ1-42+saline)的小鼠在Y-迷宮自發(fā)交替實驗中的進臂正確率(60．25± 2．31)%明顯低于對照組小鼠(saline+D-PBS)(70．75±2．17)%(P＜0．01)，;而Aβ1-42聯(lián)合腹腔慢性持續(xù)注射CI-1206組小鼠(Aβ1-42+CI-1206)的進臂正確率(68．75±1．90)%明顯高于單獨給予Aβ1-42組小鼠(60．25±2．31)%(P＜0．01，圖1A)。此外四組小鼠總進臂次數(shù)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(圖1B)。

Fig．1 Effects of Aβ1-42 and CI-1206 on spatial working memory of mice in Y maze(珋x±s，n=12)

2．2慢性腹腔注射CI-1206逆轉(zhuǎn)Aβ1-42所致的小鼠空間參考記憶損傷

Y迷宮測試后第2天，對同一批小鼠進行Morris水迷宮實驗。在連續(xù)5 d的定位航行實驗中，各組小鼠找到水下平臺的逃避潛伏期均逐漸縮短，但Aβ1-42單獨處理組小鼠逃避潛伏期明顯高于其他組小鼠，在訓(xùn)練的第2～5天與對照組比較，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．01)。經(jīng)CI-1206慢性治療后，小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P＜0．01，圖2A)。第6天空間探索實驗中，水下平臺被撤除，Aβ1-42單獨處理組小鼠與對照組小鼠在目標象限中游泳時間占總時間的百分比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，分別為33．81%±2．07%和24．39%±2．67%(P＜0．01);同時，CI-1206慢性給藥治療組在目標象限游泳的時間百分比則明顯高于單獨給予Aβ1-42組，由24．39% ±2．67%增加到33．60%±2．85%(P＜0．01，圖2 B)。Aβ1-42處理的小鼠在原來的目標象限(第I象限)中游泳距離明顯較對照組減少;而經(jīng)CI-1206處理后的小鼠(Aβ1-42+CI-1206)游泳距離明顯較單獨Aβ1-42組增加(圖2C)。

2．3Aβ1-42和CI-1206不影響小鼠在水迷宮中的運動能力和視力

四組小鼠的平均游泳速度(圖3A)以及找到可視平臺所需時間(圖3 B)均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

Fig．2 CI-1206 antagonized Aβ1-42-induced impairment of spatial reference memory in MWM test(珋x±s，n=12)

Fig．3 CI-1206 and Aβ1-42 did not affect the motor ability and vision of mice

海馬是腦內(nèi)與學(xué)習記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，其功能正常與否不僅影響短時程的工作記憶，也傷害長時程學(xué)習記憶［12］。AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)病理特征最明顯的部位之一正是在海馬，其海馬內(nèi)突觸數(shù)量減少、神經(jīng)元丟失所致的海馬萎縮已有報道。海馬結(jié)構(gòu)和功能改變的原因，除了細胞內(nèi)過度磷酸化Tau蛋白外，海馬存在的大量淀粉樣β蛋白(Aβ)的沉積也是重要的因素［13］。目前，AD發(fā)病機制的Aβ學(xué)說已被廣泛認可。Aβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)經(jīng)分泌酶剪切后形成的片段，由36～43個氨基酸組成，主要片段為Aβ1-40和Aβ1-42［14］。Aβ各種片段均具有明顯的神經(jīng)毒性作用，包括Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ25-35甚至更小片段的Aβ31-35［15，16］，而Aβ1-42特別是其寡聚體形式被認為神經(jīng)毒性最強。

本研究在證實腦內(nèi)注射Aβ1-42寡聚體可以損傷小鼠空間工作記憶以及空間參考記憶的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)這些損傷效應(yīng)可被雙受體激動劑CI-1206所拮抗。經(jīng)慢性持續(xù)21 d的腹腔注射CI-1206治療后，Aβ1-42所致的兩種學(xué)習記憶損傷指標均有改善。這一結(jié)果，為AD臨床治療特別是患有糖尿病或血糖增高的AD患者提供了一種可能的預(yù)防和治療策略。近年來，糖尿病與AD的緊密聯(lián)系已受到廣泛關(guān)注，2型糖尿病被認為是AD的危險因素之一，將治療2型糖尿病的藥物用于AD治療或?qū)⒊蔀橐粋€研究熱點。CI-1206是一種新型的單分子雙受體激動劑，在體內(nèi)可同時激活GLP-1及GIP受體，且其在發(fā)揮降糖及促進胰島素釋放等代謝性功能時明顯效力優(yōu)于GLP-1或GIP單受體激動劑。與此同時，CI-1206還可降低單次給藥劑量，從而改善GLP-1導(dǎo)致的惡心等副作用。除此之外，CI-1206經(jīng)過合理改造，克服了GLP-1或GIP一經(jīng)釋放即被體內(nèi)DDPIV降解的作用，從而大大延長了藥物半衰期［11］，在C57小鼠體內(nèi)，4 h達到血藥濃度峰值，半衰期長達12 h，遠大于GLP-1或GIP的幾分鐘［17］。并且，已有不少報道指出，經(jīng)過改造后的CI-1206，脂溶性增強，更容易通過血腦屏障［18，19］。這些研究結(jié)果為本實驗外周給藥發(fā)揮中樞保護效應(yīng)提供了良好的理論基礎(chǔ)，我們的結(jié)果也間接證實了這一觀點。目前，還未見有關(guān)CI-1206用于AD患者或AD轉(zhuǎn)基因小鼠的研究報道，本研究在Aβ1-42所致AD樣損傷的基礎(chǔ)上觀察到的CI-1206神經(jīng)保護效應(yīng)還應(yīng)當深入研究。至于CI-1206對Aβ1-42損傷小鼠學(xué)習的保護作用機制，除了激動腦內(nèi)神經(jīng)元細胞膜上的GLP-1及GIP受體外，還有哪些細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與，尚有待進一步研究。

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Dual co-agonist CI-1206 antagonizes Aβ1-42-induced impairments in spatial learning and memory in mice

YANG Ju，ZHANG Jun，YUAN Li，QU Xue-song，QI Jin-shun△
(Department of Physiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective:To study the neuroprotective effects of a novel GIP/GLP-1 receptor dual agonist CI-1206 against Aβ1-42-induced impairments in spatial working memory and long term memory in mice．Methods:C57 mice，after receiving intracerebralventricular(i．c．v．)injection of Aβ1-42 and intraperitoneal injection of CI-1206，were divided into the following groups:saline+D-PBS，Aβ1-42+saline，CI-1206+D-PBS and Aβ1-42+CI-1206 group(n=12)．Y maze spontaneous alternation of mice was tested to assess short term working memory，and Morris water maze task was used to assess long term reference memory．Results:①The percentage of right alternation of mice in Aβ1-42+saline group was significantly decreased，while the percentage in Aβ1-42+CI-1206 group was significantly larger than that in Aβ1-42 alone group(P＜0．05)．②In Morris water maze test，the escape latency of mice in Aβ1-42+saline group showed a significant increase，with a significant decline in swimming time in target quadrant．Treatment with CI-1206 significantly antagonized these detrimental effects induced by Aβ1-42．③Aβ1-42 and CI-1206 did not affect the motor ability and vision of mice．Conclusion:I．C．V．a(chǎn)dministration of Aβ1-42 impaired the short term and long term spatial memory of mice，while CI-1206 could effectively antagonize the detrimental effects．

CI-1206;Amyloidβprotein;Y-maze;Morris water maze;spatial learning and memory;mouse

R338

A

1000-6834(2016)06-567-04

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．018

2016-01-27

2016-07-14

△【通訊作者】Tel:0351-4135091;E-mail:jinshunqi2009@163．com