阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞miRNA378與網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系*

阿霉素(doxorubicin)屬于蒽醌類抗生素，是目前最為有效的抗腫瘤藥物之一，其主要的毒副反應(yīng)是累積性、劑量依賴性的心肌毒性反應(yīng)，可進(jìn)一步發(fā)展成不可逆性心肌損傷，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭［1］。關(guān)于阿霉素心肌病的發(fā)病機制目前尚未清楚，近年來認(rèn)為與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［2-4］。凋亡的產(chǎn)生機制復(fù)雜，近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條新的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］。網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)是一種位于哺乳動物心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)內(nèi)屬于CREC家族具有多個EF-hand結(jié)構(gòu)的鈣離子(Ca2+)結(jié)合蛋白［6］，文獻(xiàn)報道:calumenin緩解心肌細(xì)胞ERS并減少ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量［7］。microRNAs(miRNAs)是一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶蛋白mR-NA 3＇端非編碼區(qū)的不完全互補結(jié)合，抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。文獻(xiàn)報道［8］:miRNA-378和miRNA-378下調(diào)H9c2心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)。本實驗擬從阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞miRNA378與calumenin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互關(guān)系和調(diào)控機制進(jìn)行研究，一定程度上揭示阿霉素心肌病合并心力衰竭的發(fā)生機制，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1．1動物與試劑

1～3 d，Balb/c新生乳鼠購置吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心，許可證號:scxk(吉)2011-0004;Ⅱ型膠原酶購于SCIENTIFIC，胰蛋白酶購于碧云天，Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke)公司，RNA simple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN)公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒由沈陽萬類生物科技公司合成;阿霉素(深圳萬東藥業(yè))。

1．2乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，PBS反復(fù)清洗。將心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。加入0．1%Ⅱ型膠原酶以及0．1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化好后將其移入15 ml離心管1 500 r/min離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，用吸管反復(fù)吹打后1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后放置到培養(yǎng)板中。成纖維細(xì)胞貼壁較快，2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細(xì)胞，上清懸液中為較純的心肌細(xì)胞。細(xì)胞放置在培養(yǎng)板后靜止培養(yǎng)24 h，以后2 d換1次液。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%左右，PBS清洗2次。按實驗內(nèi)容將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞濃度為5 ×104cells/ml，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。24 h后可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度一般在70%為宜。

1．3免疫組織化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞

各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定: (1)0．1%TritonX-100孵育;(2)3%過氧化氫孵育; (3)血清封閉;(4)一抗孵育;(5)二抗孵育;(6)辣根酶標(biāo)記;(7)DAB顯色;(8)蘇木素復(fù)染;(9)鏡檢。

1．4慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建miRNA-378高表達(dá)組

(1)準(zhǔn)備病毒:取出4℃保存的慢病毒(Invitrogen公司)，使用前輕輕搖勻。(2)感染目的細(xì)胞:病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實驗。(3)使用移液器吸取一定量(病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)比值為100∶1)的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。(4)在培養(yǎng)基中加入ploybrene(6μg/ml)來提高病毒的感染效率。(5)吸去細(xì)胞中原有的培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染慢病毒細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入含有病毒液的新培養(yǎng)基。(6)混勻后放于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。(7)24 h后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液(含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基)，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

1．5miRNA378沉默細(xì)胞的構(gòu)建及實驗分組

乳鼠心肌細(xì)胞接種于6孔板中，生長至細(xì)胞密度60%～75%時，參照Lipofectamine TM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗組轉(zhuǎn)染miR-378干擾序列(吉瑪生物)，陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性序列，空白對照組轉(zhuǎn)染生理鹽水。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，72 h穩(wěn)定表達(dá)后進(jìn)行后續(xù)實驗。將上述兩種處理后細(xì)胞更換完全培養(yǎng)基，進(jìn)行實驗分組:正常對照組、模型組(3 mg/l阿霉素)，miRNA-378過表達(dá)對照組(阿霉素3 mg/L +miRNA-378過表達(dá)空質(zhì)粒)，miRNA-378過表達(dá)對照組(阿霉素3 mg/L+miRNA-378過表達(dá)質(zhì)粒)，miRNA-378沉默對照組(阿霉素3 mg/L+miRNA-378沉默空質(zhì)粒)，miRNA-378沉默組(阿霉素3 mg/L+miRNA-378沉默質(zhì)粒)，每組設(shè)計6個復(fù)孔。

1．6RealtimePCR檢測各組心肌細(xì)胞calumenin、GRP78mRNA表達(dá)

經(jīng)real time PCR實驗步驟對各組心肌細(xì)胞calumenin、GRP78 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。每種樣本每個基因進(jìn)行4個復(fù)孔平行實驗，實驗重復(fù)3次(n= 3)，實驗數(shù)據(jù)的選取，是舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實驗保留數(shù)據(jù)，利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。

1．7統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SSPS 11．5統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2．1乳鼠心肌細(xì)胞免疫組化鑒定

乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞經(jīng)免疫組化實驗，檢測出心肌細(xì)胞特有的ɑ-SMA蛋白，確定為心室肌細(xì)胞(圖1)。

Fig．1 Cultured myocardial cell(A)the immunocytochemistry of cultured myocardial cell(B)(×400)

2．2檢測各組心肌細(xì)胞miRNA378表達(dá)

為驗證慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒是否成功上調(diào)或沉默miRNA378，real time PCR檢測對照組、miRNA378過表達(dá)對照組、miRNA378過表達(dá)組、miRNA378沉默對照組、miRNA378沉默組心肌細(xì)胞miRNA378表達(dá)，實驗結(jié)果顯示miRNA378過表達(dá)組心肌細(xì)胞miRNA378過表達(dá)成功(表1)。

2．3各組心肌細(xì)胞calumeninmRNA表達(dá)檢測

與對照組相比較，阿霉素組心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0．01);與阿霉素組相比較，miRNA378過表達(dá)組心肌細(xì)胞calumenin mRNA表達(dá)增加(P＜0．01);與阿霉素組相比較，miRNA378沉默組calumenin mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2．4各組心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78 mRNA表達(dá)檢測

與對照組相比較，阿霉素組心肌細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0．01);與阿霉素組相比較，miRNA378過表達(dá)組心肌細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)減少(P＜0．01);與阿霉素組相比較，miRNA378沉默組GRP78 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

Tab．1 The expressions of miRNA378/，calumenin/and GRP78 expression assayed by real-time quantitative PCR in different groups(珋x±s，n=6)

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)功能異常，可能致誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，并且識別錯誤折疊蛋白，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即ERS．本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介到了阿霉素心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡［9］，calumenin對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護作用［10］，而且發(fā)現(xiàn)阿霉素?fù)p傷可能誘發(fā)ERS，并通過ERS凋亡信號通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF4→CHOP/ IRE1→CHOP引起心肌細(xì)胞凋亡［11］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-378通過影響轉(zhuǎn)化因子β1(TGFβ-1)分泌而參與心肌纖維化過程［12］，抑制miRNA-378表達(dá)能誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化［13］，重度心力衰竭患者miRNA-378和miRNA-378表達(dá)顯著下降，隨著患者心功能好轉(zhuǎn)，miRNA-378和miRNA-378表達(dá)也明顯增加［14］，并且miRNA-378下調(diào)H9 c2心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)［8］。但阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞ERS、calumenin與miRNA是否存在相互關(guān)系?如果相互關(guān)聯(lián)，其調(diào)控機制又是如何?為明確這一問題，我們提出如下科學(xué)假說:阿霉素通過干預(yù)心肌細(xì)胞miRNA-378表達(dá)來影響calumenin表達(dá)，進(jìn)而引起ERS并通過ERS凋亡信號通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。但要明確miRNA-378調(diào)控calumenin表達(dá)進(jìn)而引發(fā)ERS的機制，必須上調(diào)miRNA-378表達(dá)，觀察calumenin及GRP78表達(dá)情況，再沉默miRNA-378觀察calumenin及GRP78表達(dá)情況。本實驗觀察到上調(diào)阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞miRNA-378表達(dá)后并沒有出現(xiàn)預(yù)想的calumenin表達(dá)減少，反而出現(xiàn)calumenin表達(dá)增加。但根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA-378下調(diào)calumenin表達(dá)［8］，因此上調(diào)miRNA378表達(dá)引起calumenin表達(dá)增加可能是間接調(diào)節(jié)作用而非直接調(diào)節(jié)作用。但上調(diào)阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞miRNA378表達(dá)是如何間接調(diào)節(jié)calumenin表達(dá)的，則還需要在以后實驗中進(jìn)一步闡明。

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The relationship between miRNA378，calumenin and endoplasmic reticulum stress in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by adriamycin

ZHAO Ming1△，CUI Xiao-xue2，YU Miao2，WANG Yi-lin2，LONG Jie2，ZHAO Qiang1
(1．The First Clinical Medical College of Inner Mongolia University for Nationalities，2．Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China)

Objective:To investigate the relationship between miRNA378，calumenin and endoplasmic reticulum stress in suckling mouse myocardium with myocarditis caused by adriamycin．Methods:The suckling mouse myocardium of primary culture were randomly divided into control group，adriamycin group，lentivirus infection miRNA378 over expression control group，lentivirus infection miRNA378 over expression group，lentivirus infection miRNA378 silence control group and lentivirus infection miRNA378 silence group．Firstly to identify the suckling mouse myocardium，α-SMA was monitored by immunohistochemical method，and secondly the ventricular myocytes were transfered by lentivirus plasmids．Then the expression change of miRNA378，calumenin and glucose regulated protein 78(GRP78)mRNA were detected by Quantitative Real-time PCR．Results:Compared with the adriamycin infection group，the expression of calumenin mRNA in lentivirus infection miRNA378 over expression group was increased(P＜0．01)，while the expression of GRP78 mRNA was reduced(P＜0．01);Compared with the adriamycin infection group，the expressions of calumenin and GRP78 mRNA in lentivirus infection miRNA378 silence group did not change insignificantly．Conclusion:Adriamycin injection may cause expression of calumenin in suckling mouse myocardium with myocarditis reduced，which may lead to the endoplasmic reticulum stress．This effect is related with miRNA378．

adriamycin;endoplasmic reticulum stress;miRNA378;calumenin;suckling mouse

2015-11-16

2016-06-28

△【通訊作者】Tel:13474859991;E-mail:langzhe73@163．com