杜麗東，吳國(guó)泰，王鳳玲，張瑛，任遠(yuǎn)△

當(dāng)歸黃芪提取物對(duì)慢性腹膜功能衰竭大鼠腹膜功能、結(jié)構(gòu)及TGF-β1表達(dá)的影響*

杜麗東1，2，吳國(guó)泰1，2，王鳳玲3，張瑛1，任遠(yuǎn)1，2△

(1．甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，2．甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3．甘肅省第二人民醫(yī)院，蘭州730000)

目的:觀察當(dāng)歸黃芪提取物(EAA)對(duì)大鼠腹膜功能、結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響。方法:50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、EAA高、低劑量組(n=10)。除正常對(duì)照組外，其余4組大鼠每天腹腔注射4．25%高糖腹透液100 ml/kg，連續(xù)40 d，并在第8天、10天、12天腹腔注射大腸桿菌脂多糖(LPS)5 mg/kg，建立大鼠慢性腹膜功能衰竭模型，造模的同時(shí)灌胃給予相應(yīng)藥物。通過稱大鼠體重和觀察活動(dòng)狀態(tài)，測(cè)定超濾量、腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能參數(shù)、壁層腹膜厚度、壁層腹膜TGF-β1的表達(dá)，研究EAA對(duì)大鼠腹膜功能、結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用及TGF-β1表達(dá)的影響。結(jié)果:EAA能升高高糖腹膜透析液聯(lián)合LPS誘發(fā)的腹膜功能衰竭大鼠超濾量和腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能參數(shù);使大鼠腹膜增厚程度降低，TGF-β1表達(dá)減少。結(jié)論:EAA對(duì)大鼠腹膜功能、結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用且能抑制TGF-β1表達(dá)。

當(dāng)歸黃芪提取物;腹膜透析;腹膜結(jié)構(gòu);腹膜功能;TGF-β1;大鼠

腹膜透析是終末期腎衰患者替代治療的重要手段之一，具有較多的比較優(yōu)勢(shì)，隨著透析時(shí)間延長(zhǎng)，腹膜纖維化、腹膜超濾和轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，甚至衰竭成為腹膜透析終止的主要原因［1，2］。因此，積極探尋保護(hù)腹膜功能的治療方法及藥物，預(yù)防和延緩腹膜功能衰竭是長(zhǎng)期腹膜透析患者透析成功的關(guān)鍵。研究顯示［3］腹膜間皮細(xì)胞損傷、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的過度表達(dá)使細(xì)胞移行、細(xì)胞外基質(zhì)合成增多在腹膜功能衰竭中扮演重要角色。研究多集中在腹膜透析時(shí)腹透液中加入中藥制劑或加用中藥口服，以保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞、改善患者整體狀況，提高患者生存質(zhì)量。中藥當(dāng)歸、黃芪含有多糖、皂苷、黃酮和微量元素，具擴(kuò)張小血管、改善微循環(huán)、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化等多重藥理作用［4，5］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明兩藥在腎、肝、肺等多個(gè)器官具有抗纖維化作用［6，7］。本研究建立大鼠腹膜功能衰竭模型，觀察當(dāng)歸黃芪提取物對(duì)大鼠腹膜功能、結(jié)構(gòu)和TGF-β1表達(dá)的影響，為其在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1藥物與試劑

當(dāng)歸和黃芪飲片，均購自蘭州復(fù)興厚藥材有限公司，批號(hào)分別為20141108和20150117，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)劉峰林博士鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicae sinensis(Olive．)Diels和豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．Var．mongholicus (Bge．)Hsiao的干燥根;取當(dāng)歸和黃芪飲片按1∶2質(zhì)量比混合，加水浸泡30 min后，煎煮2次，用水量分別為藥物的10和8倍，每次煎煮1 h，混合兩次濾液，濃縮至每毫升1 g藥材，冷藏備用。腹膜透析液(4．25%)，批號(hào):G1409021，廣州百特醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn);鹽酸貝那普利片，批號(hào):140803，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司生產(chǎn);大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，Lot:044M4004 V，Sigma試劑公司;水合氯醛，批號(hào):20150120，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);TGF-β1一抗，批號(hào):Lo414，二抗，批號(hào):15121A04，DBA顯色劑，批號(hào):K146712F均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;其余試劑為分析純。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，50只，體重(160±20)g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0004，常規(guī)飼養(yǎng)在溫度20℃±2℃，相對(duì)濕度60%～70%的環(huán)境中，適應(yīng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1．3儀器

AU5400全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)，BX51-32H01顯微鏡(日本奧林巴斯產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)，TGL16M常速低溫離心機(jī)(湖南省凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，BS1103型Sartorius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1．4慢性腹膜功能衰竭模型的復(fù)制

［8］，大鼠每天腹腔注射4．25%高糖透析液100 ml/kg，連續(xù)40 d，在第8天、10天、12天腹腔注射大腸桿菌脂多糖5 mg/kg，建立大鼠慢性腹膜功能衰竭模型。

1．5實(shí)驗(yàn)分組與處理

50只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=10):即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、貝那普利組、EAA高、低劑量組。造模的同時(shí)灌胃給藥，陽性對(duì)照組給予鹽酸貝那普利2．1 mg/kg，EAA高、低劑量組分別給予EAA生藥12 g/kg、3 g/kg，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容量生理鹽水，給藥容量10 ml/kg，每天1次，連續(xù)40 d。

1．6觀察指標(biāo)

1．6．1大鼠體重和活動(dòng)狀態(tài)各組大鼠分別在造模前和給藥第10天、20天、30天、40天稱體重，觀察活動(dòng)狀態(tài)。

1．6．2對(duì)大鼠腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能參數(shù)Dcr/Pcr，DUN/PUN及DGlu/D0Glu的影響造模給藥第40天(各組大鼠提前禁食12 h)，腹腔注射4．25%透析液2 h后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉大鼠，心臟采血約3 ml，制備血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中肌酐(creatinine，PCr)和尿素氮(urea nitrogen，PUN)的含量;脫頸椎處死大鼠，無菌注射器抽取腹水約5 ml，離心(1 500 r/min×15 min)，取上清液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腹透液中肌酐(creatinine，Dcr)、尿素氮(urea nitrogen，DUN)及葡萄糖(glucose，DGlu)的含量。計(jì)算腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能參數(shù):Dcr/Pcr、DUN/ PUN、DGlu/D0Glu，其中D0Glu為4．25%透析液中的葡萄糖含量。

1．6．3對(duì)大鼠超濾量(ultrafiltration volume，UF)和凈超濾量(net ultrafiltration volume，Net UF)的影響

準(zhǔn)確計(jì)量各大鼠腹腔內(nèi)液體容量，按公式計(jì)算UF和Net UF。UF(ml)=腹腔內(nèi)液體容量〔包括已抽出的透析液5 ml，用注射器可抽出的液體量和紗布提取的液體量〕。Net UF(ml)=UF-0h時(shí)(初始)腹腔注射的透析液量(ml)。紗布提取的液體量(ml) =［濕紗布質(zhì)量(g)-干紗布質(zhì)量(g)］×1．08(透析液的密度為1．08 g/ml)。

1．6．4對(duì)大鼠腹膜厚度的改變?nèi)「鞔笫笥覀?cè)壁層腹膜組織約2 cm×1 cm，10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。每張切片100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野分5處測(cè)量，取平均值作為壁層腹膜厚度。

1．6．5對(duì)大鼠壁層腹膜TGF-β1的表達(dá)取各大鼠左側(cè)壁層腹膜組織約2 cm×1 cm，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，免疫組化染色。使用Image-Pro Plus 6．0圖像分析系統(tǒng)處理，計(jì)算平均積分光密度(IOD)。

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)的形式表示，兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2．1對(duì)大鼠體重和活動(dòng)狀態(tài)的影響

與正常對(duì)照組比較，各組大鼠體重?zé)o明顯差異，活動(dòng)狀態(tài)均未見異常。

2．2對(duì)大鼠腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能參數(shù)Dcr/Pcr、DUN/PUN及DGlu/D0Glu的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠Dcr/Pcr、DUN/PUN及DGlu/D0Glu均顯著降低(P＜0．01);表明造

模使腹膜對(duì)肌酐、尿素氮的清除功能下降，葡萄糖的重吸收增多，腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低。與模型對(duì)照組比較，EAA高劑量組Dcr/Pcr，DUN/PUN和DGlu/D0Glu均顯著升高(P＜0．05，P＜0．01);EAA低劑量組DUN/PUN和DGlu/D0Glu顯著升高(P＜0．05，P＜0．01)，表明EAA可改善腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，使肌酐、尿素氮的清除增多，葡萄糖的重吸收減少(表1)。

2．3對(duì)大鼠超濾量(UF)和凈超濾量(NetUF)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠UF顯著降低(P＜0．01);與模型對(duì)照組比較，EAA高劑量組大鼠UF顯著升高(P＜0．05)，EAA低劑量組UF升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

Tab．1 Effects of EAA on the Dcr/Pcr，DUN/PUNand DGlu/D0Gluin rats(珋x±s，n=10)

Tab．2 Effects of EAA on the levels of UF and Net UF in rats (ml，珋x±s，n=10)

2．4對(duì)大鼠腹膜厚度的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腹膜厚度顯著增厚(P＜0．01);與模型對(duì)照組比較，EAA高、低劑量組大鼠腹膜增厚程度顯著降低(P＜0．05，P＜0．01);與陽性對(duì)照組比較，EAA高劑量組大鼠腹膜增厚程度顯著降低(P＜0．01)，EAA低劑量組腹膜增厚不明顯(表3)。

Tab．3 Effects of EAA on the thickness of parietal peritoneum in rats(珋x±s，n=10)

2．5對(duì)大鼠壁層腹膜TGF-β1表達(dá)的影響

正常對(duì)照組大鼠腹膜組織胞漿中TGF-β1僅有微弱表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腹膜間皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)顯著增加(P＜0．01);與模型對(duì)照組比較，EAA高、低劑量組TGF-β1表達(dá)顯著降低(P＜0．05);與陽性對(duì)照組比較，EAA高劑量組TGF-β1表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，表4)。

Tab．4 Effects of EAA on the expression of TGF-β1in parietal peritoneum in rats(珋x±s，n=10)

3 討論

腹膜透析是利用腹膜作為半透膜，借助血漿與透析液中溶質(zhì)濃度梯度和滲透梯度，通過彌散、滲透、超濾等原理清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物，超濾水分，維持電解質(zhì)和酸堿平衡，同時(shí)由透析液補(bǔ)充體內(nèi)必須物質(zhì)。目前腹膜透析成為治療慢性腎功能不全的安全、有效的方法而被廣泛使用。但在長(zhǎng)期的腹膜透析過程中，由于大量的非生理性腹透液注入腹腔內(nèi)，腹膜長(zhǎng)期浸泡在低pH、高糖、高乳酸鹽和葡萄糖降解產(chǎn)物的腹透液中，改變了腹腔原來的生理狀態(tài)，使腹腔的防御功能降低，腹膜間皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致腹膜增生、硬化、腹膜功能衰竭，腹膜透析失?。?］。組織病理學(xué)研究表明腹膜功能衰竭的表現(xiàn)為［3］:腹膜間皮細(xì)胞損傷和腹膜間皮-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)。因此防治腹膜纖維化而致腹膜功能衰竭的重要靶點(diǎn)是防治腹膜間皮細(xì)胞損傷、防治EMT導(dǎo)致細(xì)胞移行和細(xì)胞外基質(zhì)合成增多。TGF-β是EMT過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能刺激腹膜間皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腹膜功能衰竭。相反，抑制TGF-β的過度表達(dá)，就能抑制其下游相應(yīng)的細(xì)胞因子，減緩EMT的發(fā)生和發(fā)展，保護(hù)腹膜的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明長(zhǎng)期應(yīng)用高濃度葡萄糖透析液，葡萄糖在人體內(nèi)最終轉(zhuǎn)化為終末期糖基化產(chǎn)物，可引起腹膜慢性損傷及機(jī)械剝脫，導(dǎo)致纖維化并最終造成超濾衰竭。研究報(bào)道［10］透析液中添加LPS可使腹膜超濾功能和轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，腹膜結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化。本研究采用腹腔注射4．25%的高糖透析液聯(lián)合大腸桿菌脂多糖建立腹膜功能衰竭模型，結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠腹膜對(duì)水的超濾和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)減少，葡萄糖的重吸收增多;腹膜發(fā)生增厚等病理變化，TGF-β1表達(dá)增多。與文獻(xiàn)報(bào)道的腹膜纖維化而致腹膜功能衰竭的效果一致，該方法操作簡(jiǎn)單、成本較低，比較適合藥物篩選和基礎(chǔ)研究。

鹽酸貝那普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，研究表明［11］該藥能減少血管緊張素Ⅱ的生成，減緩血管緊張素在腹膜增厚等病理變化中的作用。因此，在現(xiàn)有的腹膜透析研究中多用鹽酸貝那普利作為陽性對(duì)照藥物。

在目前對(duì)于腹膜透析致腹膜功能衰竭尚無行之有效的辦法的情況下;我國(guó)許多研究人員把目光集中在向透液中加入腹膜保護(hù)劑和活血化淤的中藥，或者口服中藥制劑，延緩腹膜功能衰竭，提高患者生活質(zhì)量。中藥當(dāng)歸、黃芪分別為補(bǔ)血活血、補(bǔ)氣藥，當(dāng)歸黃芪藥對(duì)是常見的氣血雙補(bǔ)、益氣活血藥對(duì)，當(dāng)歸與黃芪常用配伍比例［12］為1∶2，2∶3，2∶1，3∶2，1∶5，當(dāng)歸與黃芪1∶1應(yīng)用，體現(xiàn)益氣補(bǔ)血;1∶2應(yīng)用，體現(xiàn)益氣以養(yǎng)血;2∶1應(yīng)用，體現(xiàn)養(yǎng)血補(bǔ)氣，補(bǔ)虛安胎;1∶5應(yīng)用，體現(xiàn)有形之血生于無形之氣，大補(bǔ)脾肺之氣以資化源，氣旺以生血。本研究發(fā)現(xiàn)EAA高劑量組Dcr/Pcr，DUN/PUN和DGlu/D0Glu顯著升高;EAA低劑量組DUN/PUN和DGlu/D0Glu顯著升高，說明不同劑量的EAA可不同程度的提高腹膜對(duì)水分的超濾，增加小分子溶質(zhì)的清除，降低葡萄糖的重吸收，改善腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。EAA能不同程度降低腹膜組織增厚程度且降低TGF-β1表達(dá)。

綜上所述，當(dāng)歸黃芪提取物具有改善腹膜結(jié)構(gòu)和功能，抑制壁層腹膜TGF-β1過度表達(dá)，通過抑制壁層腹膜TGF-β1表達(dá)而對(duì)抗慢性腹膜功能衰竭的作用。

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Effects of extraction of Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus on the peritoneal structure，functions and TGF-β1expression in the chronic peritoneal failure rats

DU Li-dong1，2，WU Guo-tai1，2，WANG Feng-ling3，ZHANG Ying1，REN Yuan1，2△
(1．Gansu University of Chinese Medicine，2．Gansu Province Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine，3．The Second People’s Hospital of Gansu Province，Lanzhou 730000，China)

Objective:To study the effects of extraction of Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus(EAA)on the peritoneal structure，functions and transforming growth factor-β1(TGF-β1)expression in the chronic peritoneal failure rats．Methods:Fifty SD rats were randomly divided into normal control group，model control group，positive control group，high-dose and low-dose EAA group(n=10)．The modeling rats were established by intraperitoneal injection(ip)4．25%high-glucose peritoneal dialysate 100 ml/ kg，lasted 40 d，and ip lipopolysaccharides(LPS)5 mg/kg at8thd，10thd and 12thd．At the same time，the rats were treated with the corresponding drugs．The body weight and general states，the levels of ultrafiltration volume，the parameters of peritoneal transport function，the changes of peritoneal morphology and the TGF-β1expression in parietal peritoneum of rats were observed．Results:EAA could increase the levels of ultrafiltration volume and improve the parameters of peritoneal transport function．The peritoneal thickness were decreased，and the TGF-β1expression in parietal peritoneum were also lowered significantly．Conclusion:EAA has some protective effects on the peritoneal structure and functions，and can inhibit TGF-β1expression．

Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus;peritoneal dialysis;peritonealstructure;peritoneal function; TGF-β1;rats

R285．5

A

1000-6834(2016)06-563-04

10．13459/j．cnki．cjap．2016．06．017

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1310RJZA090);甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年基金項(xiàng)目(BH2012-023)

2015-08-25

2016-05-28

△【通訊作者】Tel:0931-8762653;E-mail:Leyuan816@163．com

EAA:Angelicae sinensis and Astragalus mongholicus;UF: Ultrafiltration volume

*P＜0．05，＊＊P＜0．01 vs control group;#P＜0．05 vs model group