粟 米，何思寧，李煒曦，王 舒，談鳳笑，黃椰林

(1. 中山大學生命科學學院∥廣東省植物資源重點實驗室，廣東 廣州510275；2. 華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東 廣州 510642)

珍稀植物海南草海桐基于ITS序列分析的系統(tǒng)位置研究*

粟 米1，何思寧1，李煒曦2，王 舒2，談鳳笑2，黃椰林1

(1. 中山大學生命科學學院∥廣東省植物資源重點實驗室，廣東 廣州510275；2. 華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東 廣州 510642)

通過測定來自國內5個分布地點的海南草海桐ScaevolahainanensisHance群體核核糖體基因間隔區(qū)序列(nuclear ribosomal internal transcribed spacer region，ITS)，一方面評估海南草海桐的遺傳多樣性大小，另一方面，結合GenBank中已有的草海桐屬物種ITS序列來共同進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在確定海南草海桐在草海桐屬中的系統(tǒng)位置。研究結果表明海南草海桐遺傳多樣性水平極低，作為一種珍稀植物在分子水平上同樣面臨滅絕的風險。而分子聚類結果發(fā)現(xiàn)海南草海桐位于Scaevola組里的北半球譜系，并與夏威夷本地物種的親緣關系最近，兩地草海桐屬物種之間可能存在祖先—后代(progenitor-derivative)的擴散模式。研究結果同時否定了Scaevola組的單系性以及海南草海桐由同域廣布種草海桐演化而來的假說。

海南草海桐ScaevolahainanensisHance；ITS；系統(tǒng)發(fā)育分析

海南草海桐ScaevolahainanensisHance，又名小草海桐，屬于草海桐科Goodeniaceae草海桐屬Scaevola。該屬全世界大約130個種，該屬的起源以及現(xiàn)存物種都集中在澳大利亞。分布在澳大利亞以外的大約有40個種，其中草海桐S.taccada和非洲草海桐S.plumieri均為熱帶廣布種，其余物種大多零散分布在熱帶海島地區(qū)[1]，僅海南草海桐是唯一的一種澳大利亞以外沿大陸沿岸狹域分布的物種，分布于中國南部沿海地區(qū)以及越南與中國相鄰的北部灣地區(qū)[1]，生于海邊鹽田或與紅樹林同生，該地區(qū)同域分布的同屬植物只有草海桐[2]。從海南草海桐的分類學研究歷史來看，海南草海桐學名的命名者Hance于1878年命此學名，也就是以采集地海南島來命名種小名，但命名當時，以及往后的一段時日，包括命名者在內的分類學者都不大確定其是否可放在草海桐這一屬[3]。1915年日本植物學家早田文藏解剖來自臺灣的海南草海桐標本的花朵之后，強烈主張其屬于草海桐屬無誤[3]，但隨后的幾十年里，對該種的研究限于停頓，直到Carolin[4]于1990年在研究草海桐屬的系統(tǒng)分類時，在沒有見到該種標本的情況下，按前人的描述將海南草海桐歸到了Scaevola組，但他承認其植株形態(tài)和果實等特點并不完全與Scaevola組的特點相符合；2003年Howarth等[1]利用ITS分子數(shù)據(jù)對草海桐屬的系統(tǒng)分類進行了研究，尤其是對分布在澳大利亞以外的所有該屬物種的演化進行了深入探討，這也是唯一的關于草海桐屬分子系統(tǒng)學的報道，但唯獨就缺少海南草海桐的樣品和數(shù)據(jù)。作為只限于在中國南部和越南沿岸分布的一種本地草海桐屬植物，海南草海桐是否是由本地區(qū)與之同域分布，但同時又是泛熱帶廣布的唯一一種草海桐屬植物——草海桐演化而來？該問題是Howarth在他們研究中所提出的但尚未有數(shù)據(jù)驗證的一個假說[1]；此外，由于近年來海岸生態(tài)系統(tǒng)的破壞，目前海南草海桐的分布范圍不斷縮減，種群數(shù)量極其稀少，以前有海南草海桐記錄分布的區(qū)域如今大多數(shù)難以尋找蹤跡。依據(jù)世界自然保育聯(lián)盟(IUCN)的保育等級分類標準該種已被臺灣列為珍稀瀕危種(Critically Endangered，CR)[5]，在大陸也被列為珍稀易危植物(Vulnerable species，VU)[6]。針對以上問題，本研究將測定來自國內5個分布地點的海南草海桐的群體ITS序列，一方面評估該物種在物種水平和群體水平上的遺傳多樣性，另一方面，結合GenBank中已有的且唯一可獲得的草海桐屬各物種ITS序列來共同進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在確定海南草海桐在草海桐屬中的系統(tǒng)位置。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

從國內南部沿海地區(qū)(包括廣東、廣西、臺灣、和海南)采集了5個海南草海桐的群體，共50個個體(表1)。同時在廣東和臺灣各采集草海桐個體6個，采樣時用GPS定位儀記錄經緯度，嚴格按照群體采樣原則，個體間距離不小于5 m，葉片置于密封的硅膠袋中干燥保存，憑證標本存放于中山大學生物適應性進化研究室。

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA提取 采用改進的CTAB法[7]用紫外分光光度法測定其核酸含量以及吸光比值。用瓊脂糖電泳檢測其含量。

1.2.2 ITS 序列的擴增及測序 本研究所用ITS引物(ITS4，ITSLeu)同Howarth(2003)(上海生工合成)[1]。反應體系為30 μL，包括DNA 20～40 ng，引物0.15 μmol/L，MgCl21.5 mol/L，dNTP 0.1 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.5 U。擴增程序為：94 ℃，4 min → 94 ℃，45 s → 60 ℃，50 s→72 ℃，80 s →32個循環(huán)→72 ℃，6 min。PCR產物進行電泳檢測后，送華大基因公司進行雙向測序。

表1 實驗材料采集信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 首先采用Clustal-X軟件[8]和POPGENE[9]對所測得的海南草海桐和草海桐群體ITS序列進行對位排列和多樣性檢測，在獲得相應的單倍型信息后，用Clustal X軟件將本研究所測序列與GenBank已有的66個草海桐屬及其相關物種的ITS序列(見表2)共69個序列進行共同排序，再用PAUP 4.0 b10 軟件[10]進行最大簡約分析，外類群選取參照Howarth[1]研究中的設置，簡約法構樹中空位(gap)處理作缺失(missing)狀態(tài)。最大簡約樹(Maximum parsimony：MP)采用Heuristic法尋找。用bootstrap 值檢驗簡約樹中各分支的置信度，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。此外，該數(shù)據(jù)集也采用貝葉斯法推斷法(Bayesian inference：BI)進行構樹，采用MrBayes3.1.1軟件[11]，用MODELTEST 3.7[12]選擇最適模型。模型選擇的標準基于貝葉斯信息準則(Bayes information criterion，BIC)[13]。所有的貝葉斯分析均以隨機樹作為起始樹，4條鏈(3條熱鏈 1條冷鏈)同時運行5×106代，每1 000代對系統(tǒng)樹抽樣一次，其它參數(shù)的先驗值設定為默認值。為了進一步獲得分辨率更高的系統(tǒng)樹，排除差異較大的序列的分析干擾，我們在前面大數(shù)據(jù)集構樹結果的基礎上選取部分序列(共27個序列)構成小數(shù)據(jù)集，并采用同樣的兩種分析方法進行構樹，后者將Scaevolataccada和S.repens作為外類群。

表2 本研究所用序列的物種樣品信息及GenBank號(*代表自測序列)

2 結果與分析

2.1 基于ITS序列的海南草海桐群體遺傳多樣性檢測

本研究測定的海南草海桐5個種群共50個個體的ITS序列完全一致，具有唯一的單倍型和基因型，Nei遺傳多樣性指數(shù)為零，因此提交給GenBank唯一的登錄號KM921769。而本研究測定的草海桐2個群體共12個個體共含有兩種單倍型，登錄號分別為KP877531和KP877532，對應的基因型共3種。其中廣東徐聞群體同時存在2種單倍型和3種基因型，Nei遺傳多樣性指數(shù)為0.53。遺傳多樣性檢測結果表明：即使所檢測的草海桐群體和個體數(shù)均顯著少于海南草海桐，從遺傳多樣性水平上也明顯高于海南草海桐。這一檢測結果同 Ho等[14]針對海南草海桐臺灣群體的ISSR研究結果一致，同樣揭示了海南草海桐無論在群體水平還是在物種水平上的遺傳多樣性均極低。

2.2 基于大數(shù)據(jù)集(69個序列)的ITS序列分析結果

69個草海桐屬及其外類群物種序列(加入本研究所獲得的海南草海桐和中國分布草海桐的序列在內)的ITS全序列排序后的長度為803 bp，用PAUP 4.0 b10進行運算。有335個變異位點，243個為信息位點，分別占41.7%和30.2%。Heuristic 法找到90個最簡約樹，用嚴格一致性樹(strict consensus tree)進行系統(tǒng)分析。樹長為370，一致性指數(shù)(CI)和保持指數(shù)(RI)分別為0.629 3和0.830 2。MP樹圖與使用貝葉斯推斷法分析構建的系統(tǒng)樹基本一致，但各分支的支持率都較低，因此圖1未顯示MP樹，只顯示了具有較高分辨率的貝葉斯樹(BI)。實際上，在分析比較中考慮到各種之間較大的序列差異，采用復雜模型的貝葉斯法更為合理，構樹所對應的核苷酸模型按貝葉斯信息準則為GTR+I+G。從BI圖中可以得知，4個草海桐S.taccada個體序列聚在一起(支持率為100%)，1和2來自中國廣東和臺灣，3來自夏威夷，4來自太平洋中的Marquesas Islands。同域分布的草海桐和海南草海桐并不構成姐妹群關系，否定了海南草海桐是由該地區(qū)另一物種草海桐演化而來的設想。與之相對比的是，海南草海桐在系統(tǒng)樹上被歸為Howarth等建議的北半球譜系(Northern Hemisphere lineage)[1]，該分支包括非洲草海桐S.plumieri，S.socotraensis，S.wrightii，S.nitida和分布在夏威夷的8個本地種，但支持率只有0.53，除夏威夷本地物種形成單系類群外，北半球譜系內部各分支間均為平行關系。該分支網結于Howarth等所劃出的Subglobulifera類群(支持率為0.98)，該類群包括了大多數(shù)屬于S. sect.Xerocarpaser.Globuliferae的澳大利亞物種以及來自于婆羅洲的物種。

2.3 基于小數(shù)據(jù)集(27個序列)的ITS序列分析結果

確定了海南草海桐以高支持率屬于Subglobulifera類群后，為了進一步確定海南草海桐在Subglobulifera類群中的位置，排除大數(shù)據(jù)集內差異較大物種在系統(tǒng)分析上的干擾，將Subglobulifera類群內的所有25個物種(包括海南草海桐， 見圖1)，加上該類群之外的S.taccada和S.repens作為外類群，一共27個序列重新排序以進行系統(tǒng)發(fā)育分析。由于去除了序列差異極大的物種所帶來的信號干擾，兩種方法都獲得了分辨率和支持率得到提高的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中圖2為采用bootstrap法抽樣檢驗所得的一致性MP樹，圖中可以看到海南草海桐與夏威夷的8個本地物種構成姐妹群關系，且有較高的自展支持率：70%。使用貝葉斯法構建的BI樹見圖3，分辨率更高，Howarth等建議的北半球譜系(已標出)支持率為67%，在此譜系中，海南草海桐與夏威夷各物種所形成的分枝支持率為83%。

3 討 論

海南草海桐是唯一分布在澳大利亞以外沿大陸沿岸狹域分布的草海桐屬物種，僅分布于中國南部沿海地區(qū)以及越南與中國相鄰的北部灣地區(qū)，但近幾十年種群數(shù)量急劇減少，Ho等[14]的研究就指出海南草海桐在臺灣歷來的棲息地，如云林縣、嘉義縣及澎湖地區(qū)均已不見蹤跡，如今只在臺南將軍鄉(xiāng)剩最后一個群體，因此在臺灣已被列為珍稀瀕危種(CR)[5]。在大陸曾經有海南草海桐記錄分布的區(qū)域如今大多數(shù)也難以尋找蹤跡，因此該種也已被列為珍稀易危種(VU)[6]。我們在華南沿海的采樣過程同樣見證了海南草海桐種群的消失。海南草海桐瀕危的原因前人推測是由于體型不高，本身不能被遮光，生態(tài)幅度窄隘，因而在海岸大規(guī)模開發(fā)過程中逐漸消失[3]。本研究通過檢測來自國內五個分布地點的海南草海桐的群體ITS序列，揭示了海南草海桐在遺傳多樣性上同樣面臨滅絕的風險，盡管這只是基于一種分子標記——ITS序列的檢測結果，但ITS序列在草海桐屬的分子研究中被普遍認為是適合的分子標記[1]。此外，在對比研究中，即使所檢測的同域草海桐群體和個體數(shù)均顯著少于海南草海桐，但草海桐在ITS序列上也顯示出更高的遺傳多樣性水平。該遺傳多樣性檢測結果也與Ho等[14]利用ISSR對臺灣海南草海桐群體進行研究的結果相一致，在他們所獲得的233個條帶中，只發(fā)現(xiàn)6個多態(tài)性條帶。海南草海桐遺傳多樣性極低的檢測結果將為制定這一珍稀植物的保育策略提供重要信息。

圖1 基于69個ITS序列(大數(shù)據(jù)集)所構建的BI樹圖(數(shù)字代表后驗概率，只顯示主要分支)，圖中部分物種的代表個體多于1個，因此在物種名后附加數(shù)字以示區(qū)分，相對應的物種及其個體具體地理信息見表1Fig.1 The phylogenetic tree resulting from the Bayesian inference (BI) of 69 ITS gene sequences (large dataset). Posterior probability values are given above major branches. The species name with number means more than one individual for this species were used in this study. The information for all taxa was listed in the supplementary Table 1

圖2 基于27個ITS序列(小數(shù)據(jù)集)所構建的MP樹(數(shù)字代表bootstrap自展支持率)Fig.2 The phylogenetic tree resulting from the Maximum parsimony (MP) analysis of 27 ITS gene sequences (small dataset). Bootstrap values are given at nodes

圖3 基于27個ITS序列(小數(shù)據(jù)集)所構建的BI樹(數(shù)字代表后驗概率)Fig.3 The phylogenetic tree resulting from the Bayesian inference (BI) of 27 ITS gene sequences (small dataset). Posterior probability values are given at nodes

依據(jù)Carolin[15]所提出的經典的草海桐屬的分類系統(tǒng)，該屬被分成了3個組，分別是Scaevola組，Xerocarpa組和Enantiophyllum組。后兩組主要由分布在澳大利亞的物種所組成，包括了130個種中的大多數(shù)物種(約90種)，形態(tài)上主要以干外果皮、蔓生草本和灌木為最重要特征。而分布在澳大利亞以外的物種絕大部分被歸為Scaevola組，該組的主要特點是果實具肉質外果皮，植株常為高大的灌木甚至是喬木。Carolin[4]于1990年在研究草海桐屬的系統(tǒng)分類中，在沒有見到海南草海桐標本的情況下，按前人的描述將該種歸到了Scaevola組，但他承認其植株形態(tài)和果實等特點并不完全與Scaevola組的特點相符合；實際上按朱芳瑩[16]以及我們的觀察，海南草海桐實為蔓生的小灌木，肉質核果成熟后變干。但Howarth[1]在他們研究中發(fā)現(xiàn)Carolin所提出的3個組除Enantiophyllum組外都不為單系類群，因此單憑形態(tài)證據(jù)就對海南草海桐進行系統(tǒng)位置的確定是不太準確的。本研究基于ITS序列所得出的聚類結果發(fā)現(xiàn)海南草海桐位于Scaevola組里的一個分支譜系——北半球譜系(Northern Hemisphere lineage)。在Howarth[1]的研究中該譜系包括S.plumieri，S.socotraensis，S.wrightii，S.nitida和分布在夏威夷的8個本地種，但他的研究中未包括海南草海桐。本研究的結果支持海南草海桐屬于這一譜系，但該譜系總體的支持率并不高，在MP樹上支持率小于50%，在BI樹上支持率為67%， 在Howarth的研究中該譜系支持率同樣較低[1]。Howarth[1]認為是由于來自于澳大利亞的物種S.nitida的數(shù)據(jù)異常造成的，因此隨后將S.nitida排除在北半球譜系外。從北半球譜系所包括的幾個物種來看，分布地點分別是也門索科特拉島S.socotraensis，古巴S.wrightii，夏威夷(標記的7個本地種)，中國越南沿岸(海南草海桐)，相互之間地理距離相隔極遠。而該譜系中唯一的廣布種S.plumieri盡管廣布在熱帶美洲和非洲，但除了古巴外并未與北半球譜系其它物種在分布范圍上存在交集，因此Howarth[1]在研究中認為北半球譜系的祖先仍然位于澳大利亞，而現(xiàn)存的各個狹域物種均來自于鳥類對肉質果實的長距離擴散和隨后的本地適應，而狹域物種之間同樣存在與擴散相對應的祖先—后代(progenitor-derivative)形成模式，但廣布種的擴散更依賴于洋流。此外，分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示依據(jù)形態(tài)特征被歸入Scaevola組里的草海桐，盡管與海南草海桐同域分布，卻在系統(tǒng)位置上相隔較遠，這一結果否定了Scaevola組的單系性以及海南草海桐最有可能由草海桐演化而來的假說。這與前人針對夏威夷群島草海桐屬的研究結果相一致。他們的研究證實：在夏威夷群島分布的草海桐，也并未參與演化形成夏威夷的其他本地種[17]。本研究中，4個分布在全球不同地域的草海桐個體形成單系類群，在分子系統(tǒng)樹上獲得的極高支持(100%)。這一結果進一步反映了該廣布種并未在分布的不同地點獨立演化而表現(xiàn)出遺傳上的分化。

本研究基于ITS序列所得出的聚類結果還進一步揭示了海南草海桐與夏威夷本地種的緊密關系，尤其是與S.coriacea和S.gaudichaudii這兩個本地種在系統(tǒng)樹上組成的分支最近[1]。在形態(tài)上海南草海桐與其中S.coriacea最接近。二者均為匍匐肉質小灌木，莖均光滑，葉肉質，葉基不抱莖，花單生或呈簡單的總狀花序；苞葉與葉大小相近，小苞片生于花梗頂端，萼片波狀緣，花冠筒內部有毛，花柱下部有短毛；果實光滑無毛[2]。但相比海南草海桐的腋生花，S.coriacea的花是頂生的；S.gaudichaudii在形態(tài)特點上同前兩者大多類似，與S.coriacea和海南草海桐所不同的只是其花冠筒內部無毛。從生境來看，海南草海桐生長在較為濕潤低海拔的海邊濕地，而S.coriacea生長在海邊較干燥的沙丘，S.gaudichaudi則長在更為干燥和高海拔的山脊和灌木叢林中[17]，這種從海邊到內陸的生境變化反映了新種產生所依賴的生態(tài)位的必要性，而亞洲與夏威夷之間鳥類的遷移和對果實的長距離擴散則從另一個方面解釋了兩地植物存在祖先-后代(progenitor-derivative)擴散模式的可能性，這一推測與Howarth對草海桐屬北半球譜系其它物種在起源和適應上的討論高度一致[1]，這在一定程度上支持了海南草海桐在系統(tǒng)上位于北半球譜系，并更靠近夏威夷本地物種的結論。針對海南草海桐的系統(tǒng)發(fā)育研究，下一步將盡可能采用多基因數(shù)據(jù)聯(lián)合分析法[18]，尤其是加入葉綠體基因的數(shù)據(jù)進行研究[19]。但由于草海桐屬物種分布范圍極廣，采樣受限以及前人所測的基因數(shù)據(jù)只限于ITS序列，故短期內無法完成ITS外的其他基因的分析。今后應進一步加大采集力度，收集其他基因數(shù)據(jù)，以進一步驗證海南草海桐的系統(tǒng)位置，同時也為草海桐屬的起源和進化提供重要信息。

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Systematic position of a rare plant speciesScaevolahainanensisbased on ITS sequence analysis

SUMi1,HESining1,LIWeixi2,WANGSu2,TANFengxiao2,HUANGYelin1

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources，School of Life Sciences，Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275，China；2. South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Genetic diversity ofScaevolahainanensisHance is estimated based on the sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer region (ITS) from five populations distributed in China. Further, phylogenetic analysis of theS.hainanensisis performed based on combined ITS sequences data with other species ofScaevolaand outgroups available from GenBank. The results shows that the genetic diversity ofS.hainanensisis very low, implying that it is at risk of extinction at the genetic level as a rare plant. In the phylogenetic tree,S.hainanensisis located in the Northern Hemisphere lineage and closest to the clade consisting of local species in Hawaii with high support value, which imply the progenitor-derivative dispersal pattern ofScaevolaspecies between Asia and Hawaii. The results did not support the monophyly ofS. sectScaevolaand the hypothesis thatS.hainanensisis derived from a widespread and sympatric speciesS.taccadais rejected based on the present result.

ScaevolahainanesisHance；ITS；phylogenetic analysis

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.01.003

2015-03-11

國家自然科學基金資助項目(41276107，31200466，J1310025)

粟米(1994年生)，女；研究方向：生態(tài)與進化基因組；通訊作者：黃椰林;E-mail:lsshyl@mail.sysu.edu.cn

Q949.783

A

0529-6579(2016)01-0016-08