黃志堅(jiān)，陳勇貴，翁少萍, ，路曉鋒，鐘立洪，范文洲，陳旭凌，張慧文，何建國(guó),

(1. 水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

多種細(xì)菌與凡納濱對(duì)蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)爆發(fā)有關(guān)*

黃志堅(jiān)1，陳勇貴1，翁少萍1, 2，路曉鋒1，鐘立洪1，范文洲2，陳旭凌1，張慧文2，何建國(guó)1, 2

(1. 水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥中山大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510275;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

近年來(lái)，在中國(guó)南方超過(guò)50%以上的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)在養(yǎng)殖30 d后爆發(fā)1種疾病，導(dǎo)致80%以上的養(yǎng)殖對(duì)蝦死亡?；疾?duì)蝦臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動(dòng)力減弱、對(duì)蝦在池塘底部死亡，發(fā)病初期水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此養(yǎng)殖者通常將該病稱為“偷死病”?；疾?duì)蝦肝胰腺萎縮壞死是主要癥狀，因此，我們稱這種對(duì)蝦疾病為對(duì)蝦肝胰腺壞死癥(hepatopancreas necrosis syndrome, HPNS)。2012年3月-2013年10月，我們?cè)谥袊?guó)南方廣東、海南和廣西3個(gè)省的12個(gè)養(yǎng)殖地區(qū)采集具有HPNS癥狀的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行了組織病理觀察、病毒檢測(cè)與人工感染、細(xì)菌分離鑒定與人工感染研究。組織病理學(xué)研究表明具有HPNS癥狀的病蝦肝胰腺壞死，在部分區(qū)域肝胰腺管細(xì)胞消失，肝胰腺小管間結(jié)締組織減少。對(duì)305尾HPNS對(duì)蝦進(jìn)行11種對(duì)蝦病毒PCR檢測(cè)，并采用人工病毒感染方式感染健康對(duì)蝦，感染對(duì)蝦不表現(xiàn)HPNS癥狀。從63尾HPNS病蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離鑒定383株細(xì)菌，這些細(xì)菌分別屬于10個(gè)屬，49種細(xì)菌，每尾對(duì)蝦均混合感染多種細(xì)菌，其中38尾對(duì)蝦中分離到副溶血弧菌，34尾對(duì)蝦中分離到蠟樣芽孢桿菌，20尾對(duì)蝦中分離到蘇云金芽孢桿菌，19尾對(duì)蝦中分離到霍亂弧菌。選取副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌分別采用注射和浸泡方式感染健康對(duì)蝦，感染對(duì)蝦均出現(xiàn)HPNS癥狀。結(jié)果表明多種細(xì)菌與凡納濱對(duì)蝦HPNS爆發(fā)有關(guān)。

凡納濱對(duì)蝦；肝胰腺壞死癥；細(xì)菌；病毒

凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei現(xiàn)為世界第一大養(yǎng)殖對(duì)蝦種，占世界養(yǎng)殖對(duì)蝦總產(chǎn)量的70%。中國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量的30%，2012年中國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到145.32萬(wàn)t。近年來(lái)，一種稱為早期死亡綜合癥(early mortality syndrome, EMS)[1-3]或急性肝胰腺壞死綜合癥(acute hepatopancreas necrosis syndrome, AHPNS)[4-5]的對(duì)蝦疾病在中國(guó)、泰國(guó)、越南、印度尼西亞、印度和墨西哥等地對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中爆發(fā)[1-2,5-9]。EMS/AHPNS導(dǎo)致全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重?fù)p失[5,10-13]。最近在中國(guó)南方超過(guò)50%以上的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)在養(yǎng)殖30 d后爆發(fā)1種疾病，導(dǎo)致80%以上的養(yǎng)殖對(duì)蝦死亡。患病對(duì)蝦臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動(dòng)力減弱、在池塘底部死亡，水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此對(duì)蝦養(yǎng)殖者通常將該病稱為“偷死病”。肝胰腺萎縮壞死是患病對(duì)蝦的主要臨床癥狀，因此，我們稱這種對(duì)蝦疾病為對(duì)蝦肝胰腺壞死癥(hepatopancreas necrosis, HPNS)。盡管患有HPNS的對(duì)蝦與患有EMS/AHPNS的對(duì)蝦均表現(xiàn)為肝胰腺壞死，但HPNS對(duì)蝦與EMS/AHPNS對(duì)蝦不同，EMS/AHPNS是在對(duì)蝦養(yǎng)殖早期死亡(一般在7～30 d的養(yǎng)殖時(shí)間發(fā)病)，發(fā)病速度快，有報(bào)道認(rèn)為EMS/AHPNS 是由1株高致病力的副溶血弧菌致病菌引起對(duì)蝦急性大量死亡[1,14-17]。與EMS/AHPNS相比，HPNS的爆發(fā)和發(fā)病進(jìn)程相對(duì)比較緩慢，而且HPNS一般發(fā)生在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖30 d以后，池塘養(yǎng)殖對(duì)蝦不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，而是逐漸死亡，養(yǎng)殖到90 d左右，死亡率達(dá)到80%。

為了研究對(duì)蝦HPNS爆發(fā)是否跟細(xì)菌和/或病毒等因素有關(guān)，本文開(kāi)展了組織病理學(xué)、病毒檢測(cè)與人工感染、細(xì)菌分離鑒定與人工感染等方面的研究。

1 材料和方法

1.1 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦樣品采集

于2012年3月-2013年10月分別在中國(guó)南方廣東、海南和廣西3個(gè)省的12個(gè)凡納濱對(duì)蝦主要養(yǎng)殖區(qū)域收集具有典型HPNS癥狀的病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道樣品。為了檢測(cè)細(xì)菌或病毒病原，病蝦樣品分別在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行不同處理和保存。采用無(wú)菌操作方法現(xiàn)場(chǎng)取患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺、血液、腸道，用接種環(huán)分別在LB、TSA、TCBS、BHI平板培養(yǎng)基上劃線接種，平板培養(yǎng)基密封保存帶回實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)和鑒定細(xì)菌?，F(xiàn)場(chǎng)采集的病蝦樣品用冰盒冷凍，封裝后帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃凍存用于對(duì)蝦DNA病毒檢測(cè)和病毒人工感染。同時(shí)取對(duì)蝦不同組織用RNA later液(Invitrogen, USA)于-80 ℃保存，用于對(duì)蝦RNA病毒檢測(cè)。采集患病對(duì)蝦樣品同時(shí)用Davidson’s AFA組織固定液[18-19]固定用于組織病理分析。

1.2 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦組織病理觀察

采集36尾HPNS對(duì)蝦肝胰腺，Davidson’s AFA組織固定液固定，固定12～24 h后換φ=70%酒精保存[19]。將固定的對(duì)蝦組織用無(wú)菌去離子水沖洗12 h，然后用φ為50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明、透蠟，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(H&E)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦病毒PCR檢測(cè)

采用酚氯仿法提取HPNS對(duì)蝦基因組DNA進(jìn)行對(duì)蝦DNA病毒檢測(cè)[20]。采用Trizol法(Invitrogen，USA)提取HPNS對(duì)蝦總RNA，并用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以檢測(cè)HPNS對(duì)蝦RNA病毒。針對(duì)各種對(duì)蝦病毒性病原的高度保守區(qū)段設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR檢測(cè)方法分別檢測(cè)白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、對(duì)蝦桿狀病毒(BPV)、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)、肝胰腺細(xì)小病毒(HPV)、黃頭病毒(YHV)、桃拉綜合癥病毒(TSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、羅氏沼蝦諾達(dá)病毒衛(wèi)星病毒(XSV)和生長(zhǎng)緩慢綜合癥病毒(LSNV)。對(duì)蝦病毒檢測(cè)所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分析。

表1 病毒檢測(cè)的引物序列

1.4 病毒人工感染

實(shí)驗(yàn)所用健康凡納濱對(duì)蝦(均質(zhì)量5 g)由中山大學(xué)海洋生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心珠?；靥峁?。選取容積為0.8 m3的水族箱，試驗(yàn)用水為天然海水，水溫 28～32 ℃。選取大小均一適中、活力較好的對(duì)蝦放入水族箱暫養(yǎng)3～5 d，24 h充氣，每天按時(shí)喂料并吸污換水，直至對(duì)蝦生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定。感染試驗(yàn)分組前，隨機(jī)選取10尾試驗(yàn)對(duì)蝦進(jìn)行對(duì)蝦病毒檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到病毒的對(duì)蝦可進(jìn)行病毒攻毒試驗(yàn)。

小心剝離30尾具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸甲，稱取病蝦頭胸部用10倍體積的無(wú)菌PBS用勻漿器在冰上勻漿，勻漿液在5 000 r/min離心10 min，上清經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，10倍體積PBS液稀釋用于對(duì)蝦感染。實(shí)驗(yàn)健康對(duì)蝦分為過(guò)濾組、未過(guò)濾組和對(duì)照組3個(gè)組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組30尾對(duì)蝦。過(guò)濾組和未過(guò)濾組分別用0.5 mL過(guò)濾液和未過(guò)濾液稀釋液注射感染健康對(duì)蝦，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS緩沖液，觀察7 d。感染7 d后，每個(gè)平行組隨機(jī)選取5尾對(duì)蝦進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.5 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌分離和鑒定

從HPNS病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道分離的細(xì)菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)單一菌落在培養(yǎng)基中再次劃線純化和培養(yǎng)，直至獲得純化的單一菌落。采用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法[21]進(jìn)行細(xì)菌鑒定。細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增[22]采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen, Beijing)提取細(xì)菌基因組DNA。16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)的引物為通用引物，正向引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′，由上海英駿生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海英駿公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，以進(jìn)行細(xì)菌種類(lèi)鑒定和分析。

1.6 副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染凡納濱對(duì)蝦

選取來(lái)源于HPNS對(duì)蝦肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和來(lái)源于HPNS對(duì)蝦腸道的蘇云金芽孢桿菌(BT)，分別采取肌肉注射感染及浸泡感染方式進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦肝胰腺壞死癥細(xì)菌人工感染。

注射感染對(duì)蝦分為4個(gè)組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組30尾對(duì)蝦，分別注射細(xì)菌濃度為106CFU·mL-1的VP、BT和VP+BT 菌液50 μL/尾，對(duì)照組對(duì)蝦注射等量無(wú)菌PBS，注射劑量均為50 μL/尾。浸泡感染也分為4個(gè)組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組30尾對(duì)蝦，感染對(duì)蝦分別用細(xì)菌終濃度為105CFU.mL-1的VP、BT和VP+BT 菌液浸泡，對(duì)照組用天然海水浸泡。不同方式感染對(duì)蝦觀察14 d，記錄對(duì)蝦感染癥狀和死亡情況，從感染對(duì)蝦中分離和鑒定細(xì)菌，同時(shí)取感染對(duì)蝦組織用AFA組織固定液固定，用常規(guī)組織學(xué)方法進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)[19]。

2 結(jié) 果

2.1 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦癥狀和組織病理觀察

患HPNS對(duì)蝦的主要癥狀是活力減弱，攝食減弱或不攝食，肝胰腺邊緣不清晰呈彌散狀，最后肝胰腺萎縮壞事(圖1-a, 圖1-a’)。與健康凡納濱對(duì)蝦(圖1-b，圖1-b’，圖1-c)比較，患病對(duì)蝦肝胰腺肝小管B，F(xiàn)，R細(xì)胞壞死或脫落，肝小管間結(jié)締組織松散或壞死，嚴(yán)重者肝小管崩解(圖1-d)。

圖1 HPNS對(duì)蝦癥狀和組織病理觀察Fig.1 Symptoms and histopathology observation of shrimp with the symptoms of HPNS

2.2 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦病毒檢測(cè)和人工感染

采用PCR方法針對(duì)305尾具有HPNS癥狀的患病對(duì)蝦進(jìn)行對(duì)蝦病毒檢測(cè)攜帶情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，可檢測(cè)到WSSV、IHHNV 2種病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9種病毒在所有樣品中均未檢測(cè)出。其中WSSV一擴(kuò)中未檢出，僅在二擴(kuò)中檢出，二擴(kuò)檢出率為66.7%，IHHNV僅檢出2例。

選取具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸部組織制備組織勻漿液，分別用不經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的組織勻漿液和經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的組織勻漿液注射感染健康對(duì)蝦，感染后7 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果，未過(guò)濾組對(duì)蝦死亡率達(dá)到100%，表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀，過(guò)濾組對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)沒(méi)有死亡。對(duì)照組對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)也沒(méi)有死亡。感染結(jié)果表明病毒不是HPNS的主要病因。

2.3 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌分離鑒定

從63尾具HPNS癥狀的對(duì)蝦不同組織中分離鑒定49種細(xì)菌，分別屬于10個(gè)屬。所有這些細(xì)菌中，肝胰腺分離鑒定34種細(xì)菌，腸道31種，血淋巴39種(表2)。

其中弧菌屬Vibrio10種，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈維氏弧菌V.harveyi、溶藻弧菌V.alginolyticus、霍亂弧菌V.cholera、河流弧菌V.fluvialis、創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus、弗尼斯弧菌V.furnissii、遠(yuǎn)青弧菌V.azureus、需鈉弧菌V.natriegens、擬態(tài)弧菌V.mimicus；芽孢桿菌屬Bacillus11種，包括蠟樣芽孢桿菌B.cereus、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens、地衣芽孢桿菌B.licheniformis、蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis、枯草芽孢桿菌B.subtilis、高地芽孢桿菌B.altitudinis、死谷芽孢桿菌B.vallismortis、巨大芽孢桿菌B.megaterium、彎曲芽孢桿菌B.flexus、韓國(guó)芽孢桿菌B.koreensis、南海恩施芽孢桿菌B.ensch；氣單胞菌屬Aeromonas7種，包括豚鼠氣單胞菌A.caviae、嗜水氣單胞菌A.hydrophila、維羅納氣單胞菌A.veronii、溫和氣單胞菌A.sobria、斑點(diǎn)氣單胞菌A.punctata、舒氏氣單胞菌A.schubertii、腸棕氣單胞菌A.enteropelogenes；微小桿菌屬Exiguobacterium5種，包括印度微小桿菌E.indicum、金橙黃微小桿菌E.aurantiacum、乙酰微小桿菌E.acetylicum、深海微小桿菌E.profundum、海洋微球菌E.marinum；葡萄球菌屬Staphylococcus6種，包括沃氏葡萄球菌S.warneri、木糖葡萄球菌S.xylosus、巴氏葡萄球菌S.pasteuri、路鄧葡萄球菌S.lugdunensis、松鼠葡萄球菌S.sciuri、腐生葡萄球菌S.saprophyticus；不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter3種，包括約氏不動(dòng)桿菌A.johnsonii、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌A.baumnnii、溶血不動(dòng)桿菌A.heamolyticus；希瓦氏菌屬Shewanella3種，包括脫色希瓦氏菌S.decolorationis、海藻希瓦氏菌S.algae、鮑希瓦氏菌S.haliotis；發(fā)光桿菌屬Photobacterium2種，包括美人魚(yú)發(fā)光桿菌P.damselae和鰒發(fā)光桿菌P.leiognathi；腸桿菌屬Enterobacter 1種，阿氏腸桿菌Enterobacter asburiae；假單胞菌屬Pseudomonas1種，包括彎曲假單胞菌P.geniculate。

在63尾患病對(duì)蝦中，38尾對(duì)蝦中鑒定有副溶血弧菌V.parahaemolyticus，其余25尾沒(méi)有分離到，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的60.3%；有蠟樣芽孢桿菌B.cereus的對(duì)蝦34尾，其余29尾沒(méi)有分離到，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的54.0%；有蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis的對(duì)蝦20尾，其余43尾沒(méi)有分離到，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的31.8%；有霍亂弧菌V.cholera的對(duì)蝦19尾，其余44尾沒(méi)有分離到，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的30.2%；有金橙黃微小桿菌E.aurantiacum的對(duì)蝦14尾，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的22.2%；有嗜水氣單胞菌A.hydrophila的對(duì)蝦11尾，占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的17.5%；解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens的對(duì)蝦為7尾，分別占鑒定對(duì)蝦總數(shù)的11.1%；其他種細(xì)菌分別從一些HPNS單尾蝦中分離鑒定(表2)。不同種類(lèi)細(xì)菌可以從不同的單尾HPNS病蝦中分離，單尾HPNS病蝦中最多鑒定細(xì)菌9種，最少鑒定細(xì)菌3種。以上結(jié)果表明多種細(xì)菌可能與對(duì)蝦HPNS爆發(fā)有關(guān)。

2.4 肝胰腺壞死癥凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌人工感染

用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別注射感染健康對(duì)蝦，在感染后6 d全部死亡，死亡率100%，表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀。對(duì)照組死亡率為12%，沒(méi)有肝胰腺壞死癥狀(圖2)。用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別浸泡感染健康對(duì)蝦，感染組對(duì)蝦緩慢死亡，在感染后14 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果，VP+BT混合菌感染組對(duì)蝦死亡率較高，達(dá)到75%，VP感染組對(duì)蝦死亡率達(dá)到66%，BT感染組對(duì)蝦死亡率為62%，感染組死亡對(duì)蝦表現(xiàn)典型肝胰腺壞死癥狀。對(duì)照組死亡率為16%，沒(méi)有肝胰腺壞死癥狀(圖3)。

表2 63尾HPNS對(duì)蝦肝胰腺、腸道和血淋巴中分離鑒定的細(xì)菌

續(xù)表2對(duì)蝦編號(hào)肝胰腺腸道血淋巴019蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，霍亂弧菌V．cholera金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantia?cum，海洋微球菌E．marinum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus斑點(diǎn)氣單胞菌A．punctata，木糖葡萄球菌S．xylosus020霍亂弧菌V．cholera，海洋微球菌E．mari?num，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis木糖葡萄球菌S．xylosus，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis021木糖葡萄球菌S．xylosus，海洋微球菌E．marinum木糖葡萄球菌S．xylosus，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis022蠟樣芽孢桿菌B．cereus，需鈉弧菌V．natr?iegens，副溶血弧菌V．parahaemolyticus蘇云金芽孢桿菌B．thuringien?sis，霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus遠(yuǎn)青弧菌V．a(chǎn)zureus，蠟樣芽孢桿菌B．cereus023蠟樣芽孢桿菌B．cereus，霍亂弧菌V．chol?era，金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，蠟樣芽孢桿菌B．cereus，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes024副溶血弧菌V．parahaemolyticus，霍亂弧菌V．cholera霍亂弧菌V．cholera，副溶血弧菌V．parahaemolyticus蠟樣芽孢桿菌B．cereus，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis025枯草芽孢桿菌B．subtilis，舒氏氣單胞菌A．schubertii腸棕氣單胞菌A．enteropelo?genes，副溶血弧菌V．parahae?molyticus金橙黃微小桿菌E．a(chǎn)urantiacum，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，蠟樣芽孢桿菌B．cereus026副溶血弧菌V．parahaemolyticus，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，弗尼斯弧菌V．furnissii027副溶血弧菌V．parahaemolyticus，遠(yuǎn)青弧菌V．a(chǎn)zureus副溶血弧菌V．parahaemolyticus創(chuàng)傷弧菌V．vulnificus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus028深海微小桿菌E．profundum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus深海微小桿菌E．profundum，副溶血弧菌V．parahaemolyticus木糖葡萄球菌S．xylosus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus，嗜水氣單胞菌A．hydrophila029豚鼠氣單胞菌A．caviae，蠟樣芽孢桿菌B．cereus蠟樣芽孢桿菌B．cereus，副溶血弧菌V．parahaemolyticus需鈉弧菌V．natriegens，豚鼠氣單胞菌A．caviae030副溶血弧菌V．parahaemolyticus，路鄧葡萄球菌S．lugdunensis嗜水氣單胞菌A．hydrophila，腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes，需鈉弧菌V．natriegens嗜水氣單胞菌A．hydrophila，需鈉弧菌V．natriegens031嗜水氣單胞菌A．hydrophila，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum鰒發(fā)光桿菌P．leiognathi，溶血不動(dòng)桿菌A．heamolyticus，需鈉弧菌V．natriegens需鈉弧菌V．natriegens，霍亂弧菌V．cholera，脫色希瓦氏菌S．decol?orationis032溶藻弧菌V．a(chǎn)lginolyticus，溶血不動(dòng)桿菌A．heamolyticus，擬態(tài)弧菌V．mimicus巴氏葡萄球菌S．pasteuri，蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，溶藻弧菌V．a(chǎn)lginolyticus約氏不動(dòng)桿菌A．johnsonii，鰒發(fā)光桿菌P．leiognathi，蠟樣芽孢桿菌B．cereus033嗜水氣單胞菌A．hydrophila，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum，約氏不動(dòng)桿菌A．johnsonii腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis，乙酰微小桿菌E．a(chǎn)cetylicum，蠟樣芽孢桿菌B．cereus

圖2 副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌注射感染對(duì)蝦的情況Fig.2 Mortality of the shrimp injected by V. parahaemolyticus (VP), B. thuringiensis (BT) and VP + BT both bacteria

圖3 副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染對(duì)蝦的情況Fig.3 Mortality of the shrimp immersed by V. parahaemolyticus (VP), B. thuringiensis (BT) and VP + BT both bacteria

取不同感染方式感染對(duì)蝦進(jìn)行病毒PCR檢測(cè)，未檢查到病毒。感染對(duì)蝦重新進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，V1感染組對(duì)蝦中分離鑒定出副溶血弧菌，Z7感染組對(duì)蝦中分離鑒定出蘇云金芽孢桿菌，V1+Z7混合感染組分離鑒定的細(xì)菌有副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌，兩種細(xì)菌都可以分別從人工感染對(duì)蝦中對(duì)應(yīng)重新分離。這些結(jié)果表明副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌都可以感染健康對(duì)蝦產(chǎn)生HPNS癥狀。

分別用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT以及兩者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康對(duì)蝦，病蝦均能產(chǎn)生與對(duì)蝦自然發(fā)病的HPNS癥狀：攝食減少或不攝食，肝胰腺萎縮，B、F、R細(xì)胞壞死(圖4)。

3 討 論

有報(bào)道采用PCR方法證明WSSV、YHV、IMNV和TSV等對(duì)蝦病毒不是EMS的病因[8]。在本研究中我們運(yùn)用PCR方法檢測(cè)HPNS病蝦11種對(duì)蝦病毒，只有WSSV和IHHNV 2種病毒可檢測(cè)出，但病毒人工感染對(duì)蝦并沒(méi)有產(chǎn)生HPNS。因此對(duì)蝦HPNS不是由單一病毒引起的。

為了確定HPNS產(chǎn)生是否與細(xì)菌有關(guān)，我們采集63尾HPNS病蝦進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，細(xì)菌可以從每一尾對(duì)蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離，經(jīng)鑒定，這些細(xì)菌屬于10個(gè)屬，沒(méi)有單一的一種細(xì)菌可以從所有63尾HPNS病蝦中分離。比如，副溶血弧菌只從其中的38尾對(duì)蝦中分離到，蠟樣芽孢桿菌從其中34尾對(duì)蝦中分離到，蘇云金芽孢桿菌從其中20尾對(duì)蝦分離到，霍亂弧菌從其中19尾對(duì)蝦分離到。我們選擇副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染健康對(duì)蝦，所有發(fā)病對(duì)蝦均表現(xiàn)HPNS癥狀。結(jié)果表明HPNS產(chǎn)生與多種細(xì)菌種類(lèi)有關(guān)。

為什么HPNS產(chǎn)生會(huì)與多種細(xì)菌有關(guān)呢？我們認(rèn)為這要?dú)w結(jié)于水體理化因子和有毒藻類(lèi)的脅迫。HPNS爆發(fā)與水體理化因子(如氨氮，亞硝酸鹽等)密切相關(guān)。在氨和亞硝酸鹽濃度較高的養(yǎng)殖池塘越容易爆發(fā)HPNS感染。如果爆發(fā)HPNS疾病，減料停料可以有效降低養(yǎng)殖水體氨氮濃度并有效控制疾病的產(chǎn)展(未發(fā)表數(shù)據(jù))。如果養(yǎng)殖池塘有毒藻類(lèi)爆發(fā)，HPNS也會(huì)產(chǎn)生(未發(fā)表數(shù)據(jù))。在對(duì)蝦養(yǎng)殖中，減料和/或減少養(yǎng)殖密度將降低HPNS爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)蝦和不同魚(yú)類(lèi)(羅非魚(yú)、草魚(yú)、胡子鯰等)混養(yǎng)可以有效改善養(yǎng)殖環(huán)境并且降低HPNS爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，我們認(rèn)為對(duì)蝦養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)平衡被打破是HPNS爆發(fā)的根本原因，養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致條件致病菌大量產(chǎn)生和氨氮脅迫，對(duì)蝦處于亞健康狀態(tài)，多種細(xì)菌包括在非脅迫條件下不能感染對(duì)蝦的細(xì)菌也可以感染對(duì)蝦。環(huán)境脅迫及導(dǎo)致條件致病菌繁生的生態(tài)系統(tǒng)是對(duì)蝦發(fā)生HPNS的根本原因。

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Multiple bacteria species were involved in hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS) ofLitopenaeusvannamei

HUANGZhijian1,CHENYonggui1,WENGShaoping1, 2,LUXiaofeng1,ZHONGLihong1,FANWenzhou2,CHENXuling1,ZHANGHuiwen2,HEJianguo1, 2

(1. MOE Key Laboratory of Aquatic Product Safety∥School of Marine Sciences,Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

In recent years, a disease outbreak occurred in >50 percent ofLitopenaeusvannameifarms at about 30 days after frys are released into the ponds in southern China. About 80% culture shrimps were dead in culture period. The clinical symptoms of the diseased shrimps include atrophy and necrosis of the hepatopancreas, weakened activity, and shrimp found dead in the bottom of the pond. The farmers in China usually called this symptom as “hidden death disease”. Since hepatopancreas atrophy and necrosis are the main symptoms of the disease, so we called this disease as hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS). In March 2012 to October 2013, we have collected the diseasedL.vannameiwith the symptoms of HPNS in 12 farms from Guangdong, Hainan and Guangxi provinces, China. Histopathology showed necrosis of hepatopancreas of the diseased shrimps, disappearance of some hepatopancreatic epidermal cells, and connective tissue. We used PCR to detect the presence of 11 viruses in 305 HPNS shrimps and performed artificial viral infection to healthy shrimps. The artificially infected shrimps did not show symptoms of HPNS. A total of 383 bacteria strains were identified from hepatopancreas, hemolymph and intestine of 63 diseased shrimps. These bacteria belong to 10 genera, 49 species. We isolatedVibrioparahaemolyticusfrom 38 shrimps,Bacilluscereusfrom 34 shrimps,B.thuringiensisfrom 20 shrimps andV.cholerafrom 19 shrimps. Injection and immersion ofV.parahaemolyticusandB.thuringiensiscan cause symptoms of HPNS. The results suggest that multiple bacteria were involved in HPNS ofL.vannamei.

Litopenaeusvannamei; hepatopancreas necrosis syndrome (HPNS); bacterium; virus

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.01.001

2015-12-14

國(guó)家基金聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1131002)；國(guó)家科技支撐資助項(xiàng)目(2012BAD17B03)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資助資金(CARS-47)；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(201103034)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012A020602084)；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(201510010071)

黃志堅(jiān)(1970年生)，男；陳勇貴(1969年生)，男；翁少萍(1963年生)，女；以上3人并列第一作者；通訊作者：何建國(guó)；E-mail:lsshjg@mail.sysu.edu.cn

S941.42

A

0529-6579(2016)01-0001-11