梁玉琴，韓衛(wèi)娟，張嘉嘉，梁晉軍，孫　鵬，傅建敏

(1 國家林業(yè)局 泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003)

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河南省柿種質(zhì)資源葉片總酚、黃酮和單寧含量的差異分析

梁玉琴1,2，韓衛(wèi)娟1，張嘉嘉1，梁晉軍1,2，孫鵬1，傅建敏1,2

(1 國家林業(yè)局 泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003)

[摘要]【目的】 分析河南省柿種質(zhì)資源葉片中總酚、總黃酮和單寧含量的差異性，并根據(jù)成分含量對資源進行評價及分類，初步篩選出高含量優(yōu)良柿種質(zhì)。【方法】 對來自河南省不同地區(qū)的122份柿種質(zhì)資源進行葉片總酚、總黃酮和單寧含量測定，分析各成分含量的差異性、分布規(guī)律和相關性及其在不同地區(qū)間的差異性，并根據(jù)各成分含量高低進行資源分類與篩選。【結(jié)果】 河南省柿資源葉片中總酚、總黃酮和單寧含量平均值分別為122.75，81.09和52.15 mg/g，變異系數(shù)分別為30.56%，46.85%和27.58%?？偡雍考蟹植荚?03.87～144.25 mg/g，黃酮含量集中分布在54.39～96.93 mg/g，單寧含量集中分布在44.91～60.55 mg/g。不同地區(qū)間3種成分含量均存在極顯著差異(P<0.01)，且3種成分含量在不同地區(qū)間的變異程度大小基本一致，即洛陽最高，南陽、豫北地區(qū)次之，三門峽、平頂山相對較小。3種成分含量彼此間呈極顯著正相關關系(P<0.01)，且一元線性回歸擬合效果較好。綜合評價3種成分含量的高低，可將所有資源分為4大類，從中初步篩選出了14份高含量優(yōu)良葉用種質(zhì)?！窘Y(jié)論】 河南省柿種質(zhì)資源葉片中總酚、總黃酮和單寧含量變異程度高，具有豐富的多樣性，可根據(jù)任何1種成分的含量預測另外2種成分含量的高低。

[關鍵詞]總酚；總黃酮；單寧；柿；種質(zhì)資源

柿(DiospyroskakiThunb)屬于柿科(Ebenaeeae)柿屬(Diospyros)落葉喬木，是重要的木本糧食樹種，具有極高的經(jīng)濟價值[1]，除了果實可食用加工外，其葉、花、皮、根、蒂等均可入藥，其中柿葉片作為傳統(tǒng)中藥材，始載于明代藥籍《滇南本草》[2]。眾多研究證明，柿樹葉片富含維生素C、蘆丁、槲皮素、山奈酚、多種氨基酸等營養(yǎng)成分[3-4]，具有抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化、抗癌防癌、軟化血管、降脂降壓等功效[5-6]；已有研究表明，黃酮類化合物是柿葉的主要藥用成分[7]。柿種質(zhì)資源豐富多樣，現(xiàn)有品種近 1 000 種，目前關于柿葉的研究多集中在功能成分提取方法或藥理作用等方面[8-11]，其試驗材料均為單一柿品種或未知柿資源，而針對不同資源進行葉片成分差異分析的報道極少，僅見費學謙等[12]對20份柿屬植物進行了維生素C和酚類物質(zhì)的差異分析，盧濤等[13]對75份柿資源進行了抗壞血酸和谷胱甘肽含量的多樣性研究。柿樹體高大枝繁葉茂，葉片生物量可觀，隨著研究的不斷深入，人們已不再局限于柿果實的利用，也開始注重葉片有效成分的開發(fā)與利用，相對柿眾多的資源種類，其葉片有效成分含量差異巨大，對柿種質(zhì)資源進行系統(tǒng)評價，篩選葉片功能成分含量高的種質(zhì)是開發(fā)利用的基礎。

黃酮是柿葉的主要功能成分，單寧是柿葉茶制作過程中影響口感的關鍵因素之一，這兩類化合物均屬于酚類物質(zhì)，分析不同柿資源中總酚、總黃酮和單寧含量的差異性及分布規(guī)律等，對柿葉利用具有重要意義。河南省不僅是柿五大主產(chǎn)區(qū)之一，也是柿的主要分布區(qū)之一[14]，境內(nèi)柿種質(zhì)資源數(shù)量多、類型豐富。本研究對河南省不同地區(qū)的122份柿種質(zhì)資源葉片中總酚、黃酮和單寧的含量進行了差異分析，根據(jù)3種成分含量高低對柿資源進行了綜合評價及分類，從中篩選出高含量優(yōu)良種質(zhì)，以期為葉用柿品種的選育提供理論依據(jù)及物質(zhì)基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料采自河南省柿資源自然分布區(qū)，包括洛陽、三門峽、平頂山、南陽及新鄉(xiāng)、安陽等豫北少數(shù)山區(qū)(表1)，共計122份種質(zhì)資源。選擇樹勢優(yōu)良、無病蟲害的盛果期植株，樹齡大于20年，于2013年9-10月隨機采集樹體各個方位枝條中部的典型成熟葉片，低溫保存帶回實驗室備用。

表 1　供試柿種質(zhì)資源的產(chǎn)地及名稱

續(xù)表 1　Continued table 1

1.2樣品處理

將采集的柿新鮮葉片置于60 ℃鼓風干燥器中干燥至質(zhì)量恒定不變，粉碎后過孔徑0.147 mm篩。取5 g粉末用體積分數(shù)60%乙醇超聲波提取30 min，減壓抽濾并定容至100 mL，提取液在4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3測定方法

所有樣品均在北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心進行3種成分含量的測定，其中總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[15]測定，以沒食子酸為標準品；黃酮含量采用AlCl3-(HAc-NaAc)顯色法[16]測定，以蘆丁為標準品，在400 nm處測定其吸光度；單寧含量參照陳佩等[17]的Folin-Ciocalteu法測定，以單寧酸為標準品；3種成分含量的單位均為“mg/g”。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用 SPSS 18.0軟件計算3種成分含量的平均值、標準差、變異系數(shù)、極差、百分位數(shù)等指標，其中變異系數(shù)計算公式為CV=σ/μ(σ為標準差，μ為均值)；構(gòu)建各成分含量的頻率分布圖，分析其分布規(guī)律；利用單因素方差法分析不同地區(qū)間各成分含量的差異性，并進行Tukey HSD 多重比較(P<0.05水平)；利用Pearson相關分析法分析3種成分含量之間的相關性，并利用Excel 2013軟件進行回歸分析；最后根據(jù)成分含量對所有資源進行聚類分析，根據(jù)分析結(jié)果，對各資源進行綜合評價及分類。

2結(jié)果與分析

2.1河南柿葉不同成分含量的差異

河南省各地柿種質(zhì)資源葉片中總酚、總黃酮和單寧含量的差異情況(表2)顯示，柿葉中總酚、總黃酮和單寧含量變異程度均較高，變異幅度大，具有豐富的多樣性，其中黃酮含量均值為81.09 mg/g，變異程度最高，變異系數(shù)高達46.85%，變幅為8.77～200.00 mg/g；總酚含量平均為122.75 mg/g，變異程度略低于黃酮含量，其變異系數(shù)為30.56%，極小值6.66 mg/g，極大值219.03 mg/g；單寧含量平均為52.15 mg/g，變異程度相對最小，變異系數(shù)為27.58%，變幅為17.65～92.92 mg/g。百分位數(shù)分析結(jié)果顯示，河南省50%的柿資源總酚含量集中在103.87～144.25 mg/g，黃酮含量集中在54.39～96.93 mg/g，單寧含量集中在44.91～60.55 mg/g。若確定某一個柿新資源葉片中3種成分的含量，即可根據(jù)上述百分位數(shù)含量值，估測該樣品中3種成分含量在整體資源中的地位，初步評價資源的利用價值。

表 2　河南省柿種質(zhì)資源葉片總酚、總黃酮和單寧含量的差異

2.2河南柿葉不同成分含量的分布規(guī)律

圖1為河南省柿種質(zhì)資源葉片中總酚、總黃酮和單寧含量的頻數(shù)分布情況。從圖1可以看出，3種成分在不同資源間差異程度大，分布范圍廣。大部分柿資源葉片中總酚含量集中分布在100.00～150.00 mg/g，缺乏含量在25.00～50.00 mg/g的資源；總黃酮含量集中分布在50.00～100.00 mg/g，缺乏含量在162.50～187.50 mg/g的資源；單寧含量集中分布在45.00～65.00 mg/g，頻數(shù)分布結(jié)果與百分位數(shù)分析結(jié)果基本一致。

圖 1河南省柿種質(zhì)資源葉片中3種成分含量的分布頻數(shù)

Fig.1Frequency distribution of the three components in persimmon leaves of Henan

2.3河南不同地區(qū)間柿葉成分含量的差異

河南省不同地區(qū)間柿葉總酚、總黃酮、單寧含量差異情況(表3)顯示，柿產(chǎn)地不同，其葉片各成分含量差異程度不同。由均值分析結(jié)果可知，3種成分含量最高的均為豫北地區(qū)，南陽次之，三門峽第3，總酚和單寧含量以洛陽最小，而總黃酮含量以平頂山最小。變異系數(shù)反映了各地3種成分含量的變異程度。表3結(jié)果顯示，3種成分變異程度大小順序基本一致，即洛陽地區(qū)最高，南陽、豫北地區(qū)次之，三門峽和平頂山地區(qū)相對較小，各地區(qū)3種成分含量的差異程度與各地樣品數(shù)量有一定相關性，即隨著樣品量增加，各成分含量均值隨之降低，變異程度隨之增大。上述結(jié)果一定程度上反映了河南各地柿資源葉片成分含量具有較高的多樣性，各地可根據(jù)不同用途有針對性地進行資源開發(fā)利用。

由表3還可以看出，河南省不同地區(qū)間柿葉總酚、總黃酮和單寧含量均存在極顯著差異(P<0.01)，豫北地區(qū)柿葉片中總酚含量顯著高于洛陽、三門峽和平頂山地區(qū)，而與南陽地區(qū)無顯著差異；單寧、總黃酮含量則顯示除豫北地區(qū)外，其他4個地區(qū)之間無顯著差異。深入分析可知，豫北地區(qū)處于河南北部太行山區(qū)，其他4個地區(qū)均屬于南部秦嶺山區(qū)，由于豫北緯度相對較高，氣溫偏低，可能更有利于柿葉中酚類物質(zhì)的合成與積累，因此造成這些地區(qū)柿葉中各成分含量顯著高于其他地區(qū)。

表 3　河南省不同地區(qū)間柿葉總酚、總黃酮、單寧含量的差異

注：同列數(shù)據(jù)后標不同大寫字母表示同一成分含量在不同地區(qū)間存在極顯著差異(P<0.01)。

Note：Different uppercase letters mean highly significantly difference(P<0.01)in the same component between different regions.

2.4河南柿葉各成分含量間的相關性及回歸分析

河南柿葉各成分含量之間的相關系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果(表4)顯示，河南省柿資源葉片中總酚、總黃酮、單寧含量兩兩之間均呈極顯著的正相關關系，相關系數(shù)均高于0.85，三者變化趨勢一致，即某一成分含量增高，另外2種成分含量也隨之增高。進一步對總酚、總黃酮及單寧3種成分含量進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)兩兩之間呈較好的一元線性回歸，回歸方程擬合結(jié)果(圖2)顯示，方程擬合效果較好，其R2值均大于0.7，其中單寧與總酚R2值最大，為0.818。由回歸方程同樣可以看出，3種成分含量彼此間呈正相關關系，結(jié)果與相關性分析一致，說明在對這些柿資源葉片中的成分進行測定及評價時，可以根據(jù)某一種成分的含量狀況預測另外2種成分的含量狀況。

表 4　河南省柿種質(zhì)資源葉片總酚、

注：**代表相關性極顯著。

Note:“**” means highly significant correlation.

圖 2　河南省柿種質(zhì)資源葉片總酚、總黃酮、單寧含量間的一元線性回歸分析

2.5河南柿種質(zhì)資源基于不同成分含量的聚類結(jié)果

122份柿資源根據(jù)總酚含量可以劃分為4類(圖3)，其中A類含量最高，均值為195.13 mg/g，包括小柿1、豫北2、洛11、南9、大蓋柿、南8、小蓋柿和南1共8份資源，占總數(shù)的6.56%；B類含量均值為138.68 mg/g，共67份資源，占總數(shù)的54.92%；C類含量均值為98.00 mg/g，共40份資源，占總數(shù)的32.79%；D類含量最低，均值僅28.98 mg/g，共7份資源，僅占總數(shù)的5.73%。根據(jù)黃酮和單寧含量，所有資源均可劃分為3類(圖4和圖5)，其中黃酮含量最高的A類資源共11份，占總數(shù)的9.02%，包括洛11、大蓋柿、凍青柿、尿罐、南10、石榴柿2、南8、小牛心、南1、豫北2和小柿1，其均值高達163.00 mg/g；B類均值為95.63 mg/g，共57份資源(46.72%)；C類均值為49.06 mg/g，共54份資源(44.26%)。單寧含量最高的A類均值為78.14 mg/g，包括豫北2、大蓋柿、石榴柿2、南1、小柿1、洛11、小牛心、南10、南8、大尖尖、大雁過紅、尿罐、凍青柿和小蓋柿共14份資源，占總數(shù)的11.48%；B類含量中等水平，均值為53.37 mg/g，共86份資源，占總數(shù)的70.49%；C類含量最低，均值30.84 mg/g，共22份資源，占總數(shù)的18.03%。綜合比較3種成分含量，均劃分在高含量類別的資源共有6份，包括小柿1、豫北2、洛11、大蓋柿、南8和南1，這些資源可以作為葉用優(yōu)良種質(zhì)進行深入開發(fā)利用，也是雜交育種的優(yōu)選種質(zhì)。此外聚類分析結(jié)果同樣說明，122份柿種質(zhì)葉片中3種成分含量具有一定的相關性，這與相關性分析結(jié)果一致，并且大部分資源各成分含量處于中等水平，與頻率分布結(jié)果一致。

2.6河南柿種質(zhì)資源葉片成分含量綜合評價及分類

根據(jù)葉片中總酚、總黃酮、單寧3種成分的含量高低對所有資源進行綜合評價，聚類分析結(jié)果(圖6)顯示，122份柿種質(zhì)資源可以劃分為4大類(Ⅰ～Ⅳ)，其中第Ⅰ類為高含量類群，包括小雁過紅、大尖尖、尿罐、凍青柿、小牛心等14份資源；第Ⅱ類成分含量較高，包括大牛心2、鬼臉青1、灰子柿1、血罐、干刺兒、盒柿、大雁過紅等64份資源；第Ⅲ類成分含量中等，包括大牛心1、竹子冠、大饃饃2、南陽紅1、小面黃蛋等35份資源；第Ⅳ類成分含量最低，包括出頭1、鏡面、八月黃3、水葫蘆2等9份資源。

根據(jù)聚類結(jié)果，對不同類別的柿資源葉片中各成分含量進行深入分析，結(jié)果(表5)顯示，122份柿資源中，Ⅰ類資源占11.48%，總酚含量在155.31～219.03 mg/g，均值為181.23 mg/g；單寧含量為68.45～92.92 mg/g，均值78.14 mg/g；黃酮含量為110.53～200.00 mg/g，均值為154.39 mg/g，此類群中的資源3種成分含量綜合最高。所有資源中有50%以上種質(zhì)屬于第Ⅱ類(52.46%)，第Ⅲ類資源占總數(shù)的28.69%，說明河南省柿種質(zhì)葉片中總酚、黃酮、單寧含量集中分布在中等水平，與頻率分布結(jié)果一致；此外，Ⅱ、Ⅲ類群資源的總酚含量均值分別為134.39和99.73 mg/g，單寧含量均值分別為55.33和43. 41 mg/g，黃酮含量均值分別為89.58和50.38 mg/g。第Ⅳ類群資源總酚含量為6.66～72.57 mg/g，均值為38.52 mg/g；黃酮含量為8.7～77.19 mg/g，均值為26.12 mg/g；單寧含量為17.65～29.89 mg/g，均值23.14 mg/g；此類群柿資源葉片中3種成分含量均較低，其比例僅占柿資源總數(shù)的7.38%。

圖 3　河南省122份柿種質(zhì)資源基于葉片

圖 5　河南省122份柿種質(zhì)資源基于葉片

根據(jù)柿資源分類情況，統(tǒng)計河南不同地區(qū)不同類型柿資源的分布數(shù)量，結(jié)果見表6。由表6可以看出，不同類型柿資源在河南各地的數(shù)量具有明顯差異，且低含量的資源均分布在洛陽地區(qū)；南陽、三門峽、平頂山和豫北地區(qū)的柿資源，葉片中3種成分含量大多處于中等偏上水平，而且平頂山地區(qū)缺乏含量很高的資源類型。各地可根據(jù)各自柿資源類型分布狀況，有針對性地進行資源的有效開發(fā)利用。洛陽地區(qū)柿資源中Ⅱ、Ⅲ類群資源數(shù)量分別為33份和19份，占該地區(qū)資源總數(shù)的76.47%，說明該地區(qū)柿資源葉片中3種成分含量同樣集中分布在中等水平，且該地區(qū)柿資源數(shù)量最多、變異最大、類型最全面。

表 5　河南省柿種質(zhì)資源不同類別間葉片總酚、總黃酮、單寧含量的差異

注：分類號與圖6中對應。下表同。

Note：The No.of clusters in table 5 is same for Fig.6.The same is table 6.

表 6　柿不同種質(zhì)資源類型在河南省不同地區(qū)的數(shù)量分布狀況

3討論

河南省柿資源葉片中總酚、總黃酮、單寧含量變異程度均較高，變異幅度大，具有豐富的多樣性，3種成分含量均值分別為122.75，81.09和52.15 mg/g。費學謙等[12]分析了不同甜柿類型及柿近緣野生種葉片的多酚類物質(zhì)含量，其最高值為77.22 mg/g；中國傳統(tǒng)中藥材中槐花多酚含量較高，為 91.33 mg/g[18]，連翹為7.94 mg/g，金銀花為8.58 mg/g[19]，比較可知河南省柿資源葉片中多酚含量均顯著高于其他省區(qū)柿資源或者其他常用傳統(tǒng)中藥材。目前已知黃酮含量較高的中藥材有銀杏、金銀花等，其含量分別為8.96和4.46 mg/g[20-21]，而本研究測定的柿葉黃酮含量是銀杏、金銀花的10倍以上，充分說明柿葉有較高的藥用價值，其開發(fā)利用潛力巨大。單寧既是抗營養(yǎng)因子，也是影響口感的重要因素之一，柿葉作為飲品原料在開發(fā)利用時，單寧含量是重要的考察指標。目前關于柿單寧含量的研究多集中在果實方面，葉片中單寧含量的研究尚未見系統(tǒng)報道，本研究系統(tǒng)比較了河南省柿資源葉片中單寧含量的差異，為柿葉開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。單寧、黃酮類化合物在分類上均屬于多酚，本研究結(jié)果顯示，河南省柿資源葉片中總酚、總黃酮、單寧含量彼此間呈極顯著的正相關關系，回歸分析證實其一元線性回歸效果較好，因此在資源開發(fā)利用時，通過測定其中1種成分的含量即可預測另外2種成分的含量，既節(jié)約時間、成本，也提高工作效率。

柿樹體可生長為高大喬木，枝葉繁茂，除了利用果實，其葉片也是開發(fā)利用的重要資源，目前市場上雖然已有柿葉茶銷售，但數(shù)量極少，規(guī)模也小，葉片需求量微乎其微，絕大部分柿樹葉均自然脫落，未有效利用，造成極大浪費。本研究系統(tǒng)分析了河南省各地柿資源葉片中多酚類化合物含量的差異性，結(jié)果顯示80%以上的柿資源葉片中多酚類物質(zhì)含量集中分布在中等偏上水平，根據(jù)總酚、總黃酮、單寧3種成分含量高低對所有資源進行綜合評價，初步篩選出了綜合含量較高的資源14份，這些資源分布在河南不同地區(qū)，可作為后期開發(fā)利用的優(yōu)良葉用品種進行深入研究，也是雜交育種工作的優(yōu)選種質(zhì)資源。

此外，河南省柿資源集中分布于西南部及北部丘陵山區(qū)，各地資源數(shù)量差異較大，尤以洛陽地區(qū)資源數(shù)量最多，其變異程度最高，所含類型最全面，分析發(fā)現(xiàn)洛陽大部分地區(qū)處于秦嶺東脈伏牛山區(qū)，屬于溫帶季風氣候，適宜柿樹生長發(fā)育，且柿本身根系發(fā)達、耐瘠薄干旱，適合山區(qū)種植，作為古老的木本糧食樹種，在當?shù)匾延? 000多年的栽培歷史[22]，百年以上大樹數(shù)量極多。綜上所述，該地區(qū)發(fā)展柿產(chǎn)業(yè)具有絕對優(yōu)勢，應注重加強該地區(qū)柿資源的收集與保存工作，加大扶植力度，促進當?shù)厥临Y源有效開發(fā)利用。

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Differences in contents of total phenols,flavonoid and tannin in leaves of persimmon germplasms in Henan

LIANG Yu-qin1,2,HAN Wei-juan1,ZHANG Jia-jia1,LIANG Jin-jun1,2,SUN Peng1,FU Jian-min1,2

(1PaulowniaResearch&DevelopmentCenterofChina,StateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China;2Non-timberForestryResearch&DevelopmentCenter,ChineseAcademyofForestry,Zhengzhou,Henan450003,China)

Abstract:【Objective】 The aim of this study was to synthetically assess differences in contents of phenols,flavonoid and tannin in leaves of persimmon germplasms in Henan,classify the germplasms according to contents of components,and select germplasms with high contents.【Method】 The phenols,flavonoid and tannin contents in leaves of 122 persimmon germplasms from different regions in Henan were detected.Variation,distribution and correlation of contents of the three components among different regions were analyzed.Then germplasms were clustered and selected according to contents of the components.【Result】 The mean contents of phenols,flavonoid and tannin were 122.75,81.09 and 52.15 mg/g with variation coefficients of 30.56%,46.85% and 27.58%,respectively.The contents of phenols,flavonoid and tannin mainly distributed at 103.87-144.25 mg/g,54.39-96.93 mg/g,and 44.91-60.55 mg/g,respectively.There was highly significantly difference in the three components among different regions (P<0.01) with the same decreasing order of Luoyang>Nanyang>northern Henan>Sanmenxia>Pingdingshan.Significant positive correlations existed among the three component contents (P<0.01) with good unary linear regression results.The 122 genotypes of persimmons were divided into four groups according to the contents of the three components and 14 excellent germplasms were selected for leaf utilization.【Conclusion】 There were high variations and polymorphisms in contents of total phenols,flavonoid and tannin in leaves of persimmon germplasms in Henan.The content of one component can be used to determine the contents of other two components.

Key words:phenols;flavonoid;tannin;persimmon;germplasms

[文章編號]1671-9387(2016)01-0139-10

[中圖分類號]S665.2

[文獻標志碼]A

[作者簡介]梁玉琴(1986-)，女，山東煙臺人，在讀博士，主要從事經(jīng)濟林育種與栽培研究。E-mail：yqliang1986@126.com[通信作者]傅建敏(1966-)，女，河南許昌人，副研究員，主要從事經(jīng)濟林育種與栽培研究。E-mail：fjm371@163.com

[基金項目]國家“十二五”科技計劃項目“澀柿種質(zhì)資源收集評價與新品種選育”(2013BAD14B0502)

[收稿日期]2014-05-21

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.021

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.042.html