王延穩(wěn)，呂志強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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家蠶腸道感染細(xì)菌后6種抗菌肽基因表達(dá)的變化

王延穩(wěn)，呂志強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究感染綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)后，家蠶中腸和脂肪體中6種抗菌肽基因表達(dá)的變化，為家蠶腸道免疫研究提供一定的理論依據(jù)?！痉椒ā?給家蠶喂食感染綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌，以喂生理鹽水為對(duì)照，利用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)感染不同時(shí)間(1，2，4，8，16，24 h)后中腸和脂肪體中6種抗菌肽基因表達(dá)的變化。【結(jié)果】 喂食綠膿桿菌1，2 h后，中腸中抗菌肽Gloverin2、Lebocin、CecropinB6、CecropinD和Moricin的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；喂食金黃色葡萄球菌1，2，4 h后，中腸中6種抗菌肽的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。在脂肪體中，感染兩種細(xì)菌后，僅抗菌肽CecropinD、Moricin和Attacin2相對(duì)表達(dá)量的變化較為顯著。【結(jié)論】 家蠶在感染不同細(xì)菌后所誘導(dǎo)的免疫機(jī)制不同。細(xì)菌經(jīng)由口器進(jìn)入家蠶腸道，可同時(shí)引起上皮免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]家蠶；細(xì)菌；抗菌肽基因；半定量RT-PCR

昆蟲缺乏獲得性免疫，主要依靠先天性免疫(Innate immunity)來(lái)抵御病原菌的入侵[1-2]。昆蟲先天性免疫反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制與哺乳動(dòng)物相似，都能刺激細(xì)胞產(chǎn)生吞噬作用，誘導(dǎo)抗菌肽基因的表達(dá)[3]。昆蟲的先天性免疫反應(yīng)包括：上表皮(角質(zhì)層、氣管、腸道)的阻礙和凝血，體液免疫——脂肪體中抗菌肽的產(chǎn)生，細(xì)胞免疫(血細(xì)胞吞噬微生物和包囊較大病原物)。此外，昆蟲的防御機(jī)制還包括黑化作用及附帶產(chǎn)生的凝固、傷口愈合和包囊[4-7]等現(xiàn)象。無(wú)脊椎動(dòng)物的上皮細(xì)胞是構(gòu)成先天性免疫的第一道防線，其主要免疫反應(yīng)是產(chǎn)生抗菌肽[8-9]。有關(guān)昆蟲上皮免疫的研究主要集中于腸道上皮細(xì)胞免疫方面，昆蟲的腸道分為：前腸、中腸和后腸。中腸由內(nèi)胚層發(fā)育而來(lái)，沒(méi)有角質(zhì)層覆蓋，由上皮層及緊鄰的圍食膜構(gòu)成，圍食膜將中腸上皮層細(xì)胞和中腸腔隔開(kāi)[10]。人們對(duì)昆蟲腸道的解剖結(jié)構(gòu)有較為細(xì)致的了解，但對(duì)其在免疫中的作用所知有限，由于中腸結(jié)構(gòu)的特殊性，針對(duì)昆蟲腸道免疫反應(yīng)的研究主要集中于中腸免疫反應(yīng)方面[9,11-14]。

昆蟲腸道中可誘導(dǎo)的防御機(jī)制包括兩個(gè)方面：一是局部抗菌肽(AMP)的產(chǎn)生；二是活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產(chǎn)生[15]。其中抗菌肽的產(chǎn)生發(fā)揮著舉足輕重的作用，昆蟲被感染后，其體內(nèi)能快速產(chǎn)生抗菌肽以抵御微生物的侵染[5]。昆蟲抗菌肽具有分子質(zhì)量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抗菌譜廣、強(qiáng)堿性和無(wú)免疫原性等特點(diǎn)，其對(duì)各種病原物如細(xì)菌、真菌、病毒及病原蟲均具有殺傷作用，且作用機(jī)制獨(dú)特，不會(huì)損害和破壞高等動(dòng)物的正常細(xì)胞[16]。目前已知的家蠶抗菌肽基因有40個(gè)，按照它們之間序列的相似性可以分為Cecropin、Moricin、Gloverin、Attacin、Enbocin、Lebocin和Defensin 7個(gè)家族[17-23]。

昆蟲昆蟲取食時(shí)，微生物會(huì)與食物一起經(jīng)由口器進(jìn)入腸道中，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞接觸到大量的微生物，從而引發(fā)感染。家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，研究感染后家蠶體內(nèi)抗菌肽的表達(dá)規(guī)律具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)給家蠶喂食綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)，來(lái)檢測(cè)感染不同時(shí)間后家蠶中腸和脂肪體中抗菌肽基因相對(duì)表達(dá)量的變化，以期初步了解蠶的腸道免疫機(jī)制，為鱗翅目昆蟲的腸道免疫研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

供試家蠶為Nastari品系，蠶卵由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理與生態(tài)研究所的凌爾軍教授提供。在人工氣候箱中孵育，飼養(yǎng)條件為：溫度26 ℃，光照周期12L/12D，相對(duì)濕度85%，孵化后開(kāi)始喂食新鮮桑葉至4齡末期，幼蟲進(jìn)入5齡改喂人工飼料。

1.2細(xì)菌菌株

革蘭氏陰性菌：綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa),革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)。

1.3主要儀器和試劑

主要儀器：人工氣候箱RXZ型(寧波江南儀器廠)、UNIQUE-E20 Unique多功能超純水儀(Reserch公司)、Hitachi CF16RXⅡ離心機(jī)(日立公司)、Bioer Life Pro PCR儀(Harlow Scientific公司)、電泳槽(天能公司)、UVP凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)。

主要試劑：RNase Zap (Ambion公司)、Direct-zolTMRNA Mini Prep試劑盒(ZYMO RESEARCH公司)、M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Invitrogen公司)、Platinum?Taq DNA Polymerase(Invitrogen公司)。

1.4方法

1.4.1家蠶喂食感染及組織提取選取5齡第2天的家蠶饑餓處理24 h，然后每頭喂食添加50 μg四環(huán)素(Tetracycline)的5 mm3人工飼料，以去除家蠶體內(nèi)的細(xì)菌。喂食抗生素24 h后，分別將滅菌的生理鹽水(對(duì)照)、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌添加到5 mm3人工飼料中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每處理各喂食10頭家蠶。在家蠶取食1，2，4，8，16，24 h后，分別將3個(gè)處理家蠶置于冰上冷凍20 min。用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精擦拭解剖工具、清潔蟲體表面，將家蠶表皮剪開(kāi)，去除圍食膜及食物后取其中腸，并用經(jīng)DEPC處理的無(wú)菌水清洗，保存于3 mL Trizol中，然后用鑷子刮取脂肪體，保存于2 mL Trizol中，均置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)采用活菌感染，試驗(yàn)操作過(guò)程中需帶手套，試驗(yàn)前后及時(shí)用酒精消毒，必要時(shí)在超凈工作臺(tái)操作，試驗(yàn)結(jié)束后將剩余活菌用84消毒液滅活，防止其對(duì)環(huán)境造成污染。

1.4.2總RNA提取及cDNA合成將保存在Trizol中的中腸和脂肪體組織分別通過(guò)勻漿器研磨均勻，使用Trizol提取總RNA。將得到的總RNA用Direct-zolTMRNA Mini Prep試劑盒純化。取1 μL純化好的RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA，并稀釋至10 ng/μL備用。

1.4.3半定量RT-PCR檢測(cè)本試驗(yàn)用于擴(kuò)增6種抗菌肽基因Gloverin2、Lebocin、CecropinB6、CecropinD、Moricin和Attacin2的引物如表1所示，以RP49作為內(nèi)參基因。半定量RT-PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPmix 1 μL，50 mmol/L MgCl25 μL,F-Primer 1 μL,R-Primer 1 μL,Platinum?Taq DNA聚合酶 0.2 μL,ddH2O 31.8 μL,cDNA 5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)償延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表 1　本試驗(yàn)所用的半定量RT-PCR引物

1.4.4數(shù)據(jù)處理用Launch VisionWorksLS軟件分析半定量RT-PCR的結(jié)果，得出6種抗菌肽基因的相對(duì)表達(dá)量，然后用GraphPad Prism 5軟件分析其隨感染時(shí)間的變化趨勢(shì)，通過(guò)t檢驗(yàn)分析各組間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1喂食細(xì)菌對(duì)家蠶Gloverin2相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中Gloverin2相對(duì)表達(dá)量的變化如圖1-A所示。從圖1-A可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌1，2，4 h后，Gloverin2相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，且喂食金黃色葡萄球菌后Gloverin2相對(duì)表達(dá)量均較高，感染細(xì)菌1 h后Gloverin2相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到最高。與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌24 h后Gloverin2相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中Gloverin2相對(duì)表達(dá)量的變化如 圖1-B 所示。從圖1-B可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后Gloverin2相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。

圖 1　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中Gloverin2基因的相對(duì)表達(dá)量

2.2喂食細(xì)菌對(duì)家蠶Lebocin相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中Lebocin相對(duì)表達(dá)量的變化如圖2-A所示。從圖2-A可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌1，2，4 h后Lebocin相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，且喂食金黃色葡萄球菌后Lebocin相對(duì)表達(dá)量均較高，感染細(xì)菌2 h后Lebocin相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到最高，喂食綠膿桿菌24 h后Lebocin相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中Lebocin相對(duì)表達(dá)量的變化如圖2-B所示。從圖2-B可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后Lebocin相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。

圖 2　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中Lebocin基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3喂食細(xì)菌對(duì)家蠶CecropinB6相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中CecropinB6相對(duì)表達(dá)量的變化如 圖3-A 所示。從圖3-A可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌1，2，16 h后CecropinB6相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且2 h后相對(duì)表達(dá)量最高；喂食金黃色葡萄球菌1，2，4 h后CecropinB6相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且4 h后相對(duì)表達(dá)量最高。與感染綠膿桿菌相比，感染金黃色葡萄球菌1，2,4 h后CecropinB6相對(duì)表達(dá)量均較高。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中CecropinB6相對(duì)表達(dá)量的變化如圖3-B所示。從圖3-B可以看出，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后CecropinB6相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。

圖 3　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中CecropinB6基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4喂食細(xì)菌對(duì)家蠶CecropinD相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中CecropinD相對(duì)表達(dá)量的變化如圖4-A所示。從圖4-A可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌1，2 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；喂食金黃色葡萄球菌1，2，4 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且4 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量最高。與感染綠膿桿菌相比，感染金黃色葡萄球菌1，2，4 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量均較高。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中CecropinD相對(duì)表達(dá)量的變化如圖4-B所示。從圖4-B可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌2，4，24 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，8 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)；喂食金黃色葡萄球菌2，4，16，24 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，8 h后CecropinD相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖 4　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中CecropinD基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5喂食細(xì)菌對(duì)家蠶Moricin相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中Moricin相對(duì)表達(dá)量的變化如圖5-A所示。從圖5-A可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌1，2 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且1 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量最高；喂食金黃色葡萄球菌1，2，4 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且1 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量最高。與感染綠膿桿菌相比，感染金黃色葡萄球菌1，4 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量均較高。喂食綠膿桿菌24 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，喂食食金黃色葡萄球菌8，16，24 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中Moricin相對(duì)表達(dá)量的變化如圖5-B所示。從圖5-B可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌4，24 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，8 h后Moricin相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

圖 5　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中Moricin基因的相對(duì)表達(dá)量

2.6喂食細(xì)菌對(duì)家蠶Attacin2相對(duì)表達(dá)量的影響

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶中腸中Attacin2相對(duì)表達(dá)量的變化如圖6-A所示。從圖6-A可以看出，喂食綠膿桿菌后Attacin2相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著變化；與對(duì)照相比，喂食金黃色葡萄球菌后2，4，8 h后Attacin2相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且4 h后Attacin2相對(duì)表達(dá)量最高。

喂食生理鹽水、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌后，家蠶脂肪體中Attacin2相對(duì)表達(dá)量的變化如圖6-B所示。從圖6-B可以看出，與對(duì)照相比，喂食綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌4，24 h后Attacin2相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)。

圖 6　喂食不同細(xì)菌后家蠶中腸(A)和脂肪體(B)中Attacin2基因的相對(duì)表達(dá)量

3討論

本試驗(yàn)選用綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌喂食感染家蠶幼蟲，然后在不同時(shí)間點(diǎn)分別提取中腸和脂肪體兩種組織，利用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了家蠶中6種抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明,感染兩種細(xì)菌后家蠶中腸中抗菌肽基因相對(duì)表達(dá)量的變化隨時(shí)間變化有所不同。家蠶喂食綠膿桿菌1，2 h后，中腸中抗菌肽Gloverin2、Lebcion、CecropinB6、CecropinD和Moricin的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，且感染1 h后抗菌肽Gloverin2、Moricin的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，感染2 h后抗菌肽Lebcion、CecropinB6的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，但24 h后Gloverin2、Lebcion和Moricin的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，也許是由于一些抑制因子[24]的表達(dá)造成的，以防止家蠶過(guò)度免疫對(duì)自身造成傷害。有研究表明，喂食金黃色葡萄球菌后抗菌肽Gloverin2、CecropinD和Moricin的相對(duì)表達(dá)量會(huì)上調(diào)[24]，這與本研究結(jié)果一致，同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，感染金黃色葡萄球菌后抗菌肽CecropinB6、Lebcion和Attacin2的相對(duì)表達(dá)量也會(huì)上調(diào)。同喂食綠膿桿菌相比，喂食金黃色葡萄球菌1，2，4 h后中腸中6種抗菌肽的相對(duì)表達(dá)量均較高，說(shuō)明家蠶對(duì)不同細(xì)菌的敏感度不同。在脂肪體中，抗菌肽CecropinD、Moricin和Attacin2的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化最顯著，其他3種抗菌肽相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比變化不明顯，說(shuō)明給家蠶喂食細(xì)菌可誘導(dǎo)脂肪體中部分抗菌肽的表達(dá)。

家蠶腸道感染細(xì)菌后，不同細(xì)菌所誘導(dǎo)的抗菌肽相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化不同，表明家蠶對(duì)不同類型的細(xì)菌有不同的防御機(jī)制；家蠶腸道是相對(duì)封閉的管道，而且腸道細(xì)胞和脂肪體細(xì)胞屬于不同的免疫組織，雖然細(xì)菌經(jīng)由口器進(jìn)入腸道，但仍然能夠誘導(dǎo)脂肪體中抗菌肽的表達(dá)，這可能是由于一些信號(hào)因子穿過(guò)腸壁細(xì)胞進(jìn)入血腔中，或是因?yàn)榧?xì)菌穿過(guò)腸壁細(xì)胞進(jìn)入血腔中，也可能是這兩種因素同時(shí)導(dǎo)致的。

總體來(lái)看，在家蠶的腸道免疫中，感染不同細(xì)菌所誘導(dǎo)的抗菌肽種類有所不同，且腸道感染細(xì)菌后既能引起腸道免疫反應(yīng)，影響中腸中抗菌肽基因的表達(dá)，又能引起體液免疫反應(yīng)，影響脂肪體中抗菌肽基因的表達(dá)。

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Expression of 6 antimicrobial peptide genes in silkworm,Bombyxmoriafter oral bacterial infection

WANG Yan-wen,Lü Zhi-qiang

(CollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The expression of 6 antimicrobial peptide genes after oral infection with Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus was studied to provide theoretical basis for gut immune of silkworm.【Method】 Using physiological saline as control check,the expression of 6 antimicrobial peptide genes in midgut and fat body of silkworm after 1,2,4,8,16,and 24 h Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus infection was studied by semi-quantitative RT-PCR.【Result】 Silkworm significantly up-regulated the relative expression of Gloverin2,Lebocin,CecropinB6,CecropinD and Moricin after infection 1,2 h with P.aeruginosa and the relative expression of all 6 antimicrobial peptides increased after infection 1,2,and 4 h with S.aureus in midgut.After oral infection with two bacteria,the relative expression of CecropinD,Moricin and Attacin2 was significant different in fat body.【Conclusion】 The immune mechanisms of silkworm against different bacteria were different.Bacteria in intestine via mouthparts could induce both epithelial immune response and humoral immune response.

Key words:silkworm;bacteria;antibacterial peptides gene;semi-quantitative RT-PCR

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)01-0185-07

[中圖分類號(hào)]S186；Q966

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡(jiǎn)介]王延穩(wěn)(1987-)，女，山東濟(jì)寧人，碩士，主要從事家蠶免疫研究。E-mail：wangyanwen4366@163.com[通信作者]呂志強(qiáng)(1971-)，男，陜西漢中人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事昆蟲生理生化和昆蟲免疫研究。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)子課題(2012CB114604)；教育部基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(CX200908)

[收稿日期]2014-05-06

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.027

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.054.html

E-mail：zhiqianglu@gmail.com