張波泳， 江振作， 王躍飛*， 楊　龍， 楊　帆， 于卉娟

（1.天津市現(xiàn)代中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

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UPLC/ESI-Q-TOF MS法分析鮮地黃、生地黃、熟地黃的化學(xué)成分

張波泳1，2， 江振作1，2， 王躍飛1，2*， 楊龍1，2， 楊帆1，2， 于卉娟1，2

（1.天津市現(xiàn)代中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

摘要：目的 建立超高效液相色譜-電噴霧/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/ESI-Q-TOFMS）法分析鮮地黃、生地黃、熟地黃中的化學(xué)成分。方法 分析采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1％甲酸溶液-甲醇，梯度洗脫；柱溫40℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。結(jié)果 共鑒定了26個(gè)化學(xué)成分，包括12個(gè)環(huán)烯醚萜苷、8個(gè)苯乙醇苷、3個(gè)核苷、2個(gè)有機(jī)酸、1個(gè)紫羅蘭酮。梓醇、益母草苷、毛蕊花糖苷是鮮地黃和生地黃中的主要成分，而在熟地黃中含有量較低；地黃苷D在3種炮制品中的含有量均較高，比較穩(wěn)定。結(jié)論該方法可為控制地黃質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鮮地黃；生地黃；熟地黃；化學(xué)成分；UPLC/ESI-Q-TOFMS

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的新鮮或干燥塊根，主要存在3種形式，分別為鮮地黃、生地黃、熟地黃［1］。其中，鮮地黃味甘、苦，性寒，具有清熱生津、涼血、止血的功效，主要用于治療熱病傷陰、舌絳煩渴、溫毒發(fā)斑等證；生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效，擅于治療熱入營(yíng)血、吐血、津傷便秘、陰虛發(fā)熱等證；熟地黃性由寒轉(zhuǎn)溫，味由苦轉(zhuǎn)甘，具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓的功效，主要用于治療血虛萎黃、心悸怔仲、月經(jīng)不調(diào)等證。文獻(xiàn)報(bào)道，地黃主要含有多糖［2］、環(huán)烯醚萜苷［3-4］、苯乙醇苷［5］、核苷等［6］成分，具有調(diào)節(jié)血糖［7-9］、抑制肺纖維化［10］、抗炎解熱等［11］作用。

為進(jìn)一步研究鮮地黃、生地黃、熟地黃的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-電噴霧/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/ESI-Q-TOF MS）技術(shù)，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合準(zhǔn)分子離子、二級(jí)碎片離子信息以及相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出26個(gè)化學(xué)成分，包括12個(gè)環(huán)烯醚萜苷、8個(gè)苯乙醇苷、3個(gè)核苷、2個(gè)有機(jī)酸、1個(gè)紫羅蘭酮。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀（包括Waters ACQUITY二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、MassL-ynx色譜工作站）、電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；SB25-12 DTN超聲波清洗器、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XS205十萬(wàn)分之一、AL204萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ACS-30電子計(jì)價(jià)秤（上海花潮電器有限公司）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。甲醇為色譜純（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；甲酸為色譜純（美國(guó)Mreda公司）。

鮮地黃于2014年采自甘肅，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥副教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch的塊根。黃酒（批號(hào)20140105）購(gòu)自紹興越皇貢釀酒有限公司。

地黃苷C、地黃苷D、梓醇、益母草苷、密力特苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；鳥(niǎo)苷、腺苷（天津一方科技有限公司）；桃葉珊瑚苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；京尼平苷（四川省維克奇生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鮮地黃、生地黃、熟地黃樣品的制備 鮮地黃：除去蘆頭、須根及泥沙。生地黃：鮮地黃緩慢烘焙至約8成干，切厚片，即得。熟地黃：將生地黃和黃酒以10∶3比例混合，拌勻，置于密閉容器內(nèi)，燉至黃酒吸盡，放涼，取出，緩慢烘干至外皮黏液稍干，如此反復(fù)9次，干燥，即得［1，12］。

地黃炮制過(guò)程質(zhì)量變化曲線見(jiàn)圖1。

圖1　質(zhì)量變化曲線Fig.1 Curve of weight change

2.2 供試品溶液制備 分別精密稱(chēng)取鮮地黃（凍干）、生地黃、熟地黃粉末（過(guò)100目篩）0.5 g，置于10 mL量瓶中，加入50％甲醇適量，超聲（功率500 W）30 min，放冷至室溫，50％甲醇定容，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液置于2 mL量瓶中，加水稀釋定容，搖勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取梓醇、鳥(niǎo)苷、腺苷、桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、京尼平苷、地黃苷D、地黃苷C、益母草苷、蜜力特苷對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，少量DMSO溶解，甲醇定容，搖勻，各取適量置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得（質(zhì)量濃度分別為40.24、43.92、87.20、21.28、10.68、10.64、16.14、20.96、20.68、20.72、22.44 μg/mL）。

2.4 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1％甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～7 min，1％→22％B；7～9 min，22％→25％B；9～16 min，25％→44％B；16～20 min，44％→55％ B；20～30 min，55％→80％B；30～31 min，80％→99％B）；柱溫40℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.5 MS檢測(cè)條件 Xevo G2-S ESI離子源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓-2.0 kV；錐孔電壓40 V；補(bǔ)償電壓80 V；離子源溫度100℃；脫溶劑溫度450℃；錐孔氣50 L/h；脫溶劑氣800 L/h；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500。校正液亮氨酸-腦啡肽，［M+H］+556.277 1，［M-H］-554.261 5。

3 結(jié)果

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，結(jié)合準(zhǔn)分子離子、二級(jí)碎片離子信息及相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出26個(gè)化合物，其中，色譜峰2、4、7～13、15、18、26為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，14、16、17、19、21、22、23、25為苯乙醇苷類(lèi)化合物，3、5、6為核苷類(lèi)化合物，1、20為有機(jī)酸類(lèi)化合物，24為紫羅蘭酮類(lèi)化合物，具體見(jiàn)表1。UPLC/ESI-Q-TOF MS色譜圖見(jiàn)圖2。

表1　化學(xué)成分分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of chem ical constituents

續(xù)表1　

圖2　UPLC/ESI-Q-TOF MS色譜圖Fig.2 UPLC/ESI-Q-TOFMS chromatograms

4 討論

實(shí)驗(yàn)顯示，地黃炮制后化學(xué)成分有所變化。其中，梓醇、益母草苷、毛蕊花糖苷等是鮮地黃和生地黃中的主要成分，具有降糖等［25-26］功效，而在熟地黃中含有量較低，推測(cè)可能與此類(lèi)結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性差有關(guān)，在高溫炮制時(shí)易發(fā)生降解［27］；地黃苷D在鮮地黃、生地黃、熟地黃中的含有量均較高，具有滋陰補(bǔ)血［28-30］功效，在炮制過(guò)程中比較穩(wěn)定，變化不明顯。

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［綜 述］

Analysis of chem ical constituents in fresh，dried and prepared Rehmanniae Radiχ by UPLC/ESI-Q-TOF MS

ZHANG Bo-yong1，2， JIANG Zhen-zuo1，2， WANG Yue-fei1，2*， YANG Long1，2， YANG Fan1，2， YU Hui-juan1，2
（1.Tianjin MuniciPal State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine—State Key Laboratory Breeding BaseCo-founded by p rovinceand Ministry of Education；Instituteof TraditionalChineseMedicine，Tianjin University of Traditional ChineseMedicine，Tianjin 300193，China；2.Research and DeveloPment Center of New Chinese Medicine，Tianjin International Joint Academy of Biomedicine，Tianjin 300457，China）

ABSTRACT：AIM To establish an ultra performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry（UPLC/ESI-Q-TOFMS）method for analyzing the chemical constituents in fresh，dried and prepared Rehmanniae Radix.METHODS The analysiswas carried out on an Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），mobile phase was 0.1％formic acid solution-methanolwith gradient elution，column temperature wasmaintained at 40℃，flow rate was 0.3 mL/min，and injection volume was 2 μL.RESULTS Total twenty-six chemical constituents were identified，including twelve iridoid glycosides，eight phenylethanoid glycosides，three nucleosides，two organic acids，and one ionone.Catalpol，leonuride and verbascoside were themain constituents in fresh and dried Radix Rehmannia，whose contentswere low in prepared Rehmanniae Radix.The content of rehmannioside D was high in three processed products，which was relatively stable.CONCLUSION Thismethod can provide the scientific evidence for controlling the quality of Rehmanniae Radix.

KEY WORDS：fresh Rehmanniae Radix；dried Rehmanniae Radix；prepared Rehmanniae Radix；chemical constituents；UPLC/ESI-Q-TOFMS

*通信作者：王躍飛，男，副研究員，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究。Tel：（022）27386453，E-mail：wangyuefei_ 2006@hotmail.com

作者簡(jiǎn)介：張波泳（1990—），男，碩士生，從事中藥質(zhì)量控制研究。Tel：（022）27386453

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81202877）

收稿日期：2015-08-15

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.029

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1104-05