劉新國(guó)， 程　璐， 楊全偉， 張　耕

（武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢430022）

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微透析法研究環(huán)維黃楊星D透皮貼劑透皮吸收行為

劉新國(guó)， 程璐， 楊全偉， 張耕*

（武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢430022）

摘要：目的 采用微透析法研究環(huán)維黃楊星D透皮貼劑經(jīng)皮給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)行為。方法 線性微透析探針植入Wistar大鼠真皮在線取樣。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定透析液中環(huán)維黃楊星D的回收率與其體內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果 環(huán)維黃楊星D在0.1～90 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 34），定量限為10 pg/mL。透皮貼劑的皮膚局部藥物動(dòng)力學(xué)行為符合單室模型，藥物平均滯留時(shí)間在12 h以上?；|(zhì)藥物質(zhì)量濃度越高，單位時(shí)間透皮量越大，但不呈比例增加。結(jié)論 經(jīng)皮微透析在微創(chuàng)條件下，可滿足環(huán)維黃楊星D透皮貼劑連續(xù)取樣及動(dòng)態(tài)分析的要求。

關(guān)鍵詞：環(huán)維黃楊星D；透皮貼劑；透皮吸收；藥物動(dòng)力學(xué)；微透析；LC-MS/MS

黃楊寧系從黃楊科植物中國(guó)小葉黃楊Buxus microPhylla Sieb. et Zucc. var. sinica Rehd. et Wils.及其同屬植物中提取得到的生物堿［1］，其主要有效成分環(huán)維黃楊星D（CVB-D）是《中國(guó)藥典》2000年版一部的新增品種，具有行氣活血，通絡(luò)止痛的功效，臨床用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、脈結(jié)代、冠心病、心律失常等［2］。但其靜注后組織親和力強(qiáng)，攝取快，藥物在組織中的潴留時(shí)間久，排泄緩慢，導(dǎo)致多次給藥時(shí)各臟器出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象。根據(jù)環(huán)維黃楊星D的理化性質(zhì)、藥理特性、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及心血管系統(tǒng)疾病需長(zhǎng)期用藥的特點(diǎn)［3］，前期將其研制成經(jīng)皮給藥貼劑，發(fā)現(xiàn)其黏性適中，皮膚相容性好，具有良好的體外釋藥性和平穩(wěn)的經(jīng)皮滲透速率［4］。鑒于微透析采樣技術(shù)可在基本不干擾生物體內(nèi)正常生理的情況下，進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)、在線取樣和檢測(cè)，國(guó)外利用該技術(shù)進(jìn)行化學(xué)單體藥物的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)研究［5-6］，而國(guó)內(nèi)主要針對(duì)局部組織的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行［7-8］。本實(shí)驗(yàn)利用微透析線性探針骨性半透膜來模擬皮下毛細(xì)血管，聯(lián)合使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)，對(duì)環(huán)維黃楊星D經(jīng)皮給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。

1 試藥、儀器與動(dòng)物

1.1 藥品與試劑 環(huán)維黃楊星D對(duì)照品（批號(hào)888-200001）、多萘哌齊（批號(hào)100650-200301）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司）；醋酸銨為色譜純（美國(guó)Dikma公司）；其他試劑均為分析純；純凈水（Purlab classic純水系統(tǒng)制備）。

環(huán)維黃楊星D透皮貼劑（自制，批號(hào)20081206，規(guī)格0.1、0.5、1.0 mg/cm2）。制備方法為精密稱取Eudragit E100適量，加入琥珀酸（交聯(lián)劑）和無水乙醇，靜置密閉過夜以使其充分溶解、交聯(lián)，再加入癸二酸二丁酯（增塑劑）和氮酮（促滲劑），混合均勻。精密稱取環(huán)維黃楊星D原料藥適量，無水乙醇溶解，與上述交聯(lián)改性的壓敏膠液混合，攪拌均勻，靜置一段時(shí)間以使氣泡消失，涂布于防黏紙上，80℃固化10 min后轉(zhuǎn)移至背襯層，切割，制成不同載藥量的單層貼劑。

1.2 儀器 Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備Finnigan Surveyor自動(dòng)進(jìn)樣器、電噴霧電離源（ESI源）、Xcalibur 1.3系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；微透析設(shè)備，配備MD-2000線性微透析探針（10 mm）、MD 1001灌注器推進(jìn)泵、MD-0100灌注器（1 mL）、MD 1002灌注器支架、MD-1000流速控制器（美國(guó)BAS公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；Precisa XR205SM-DR電子天平（十萬分之一，瑞士普利賽斯公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）2009-0001。

2 LC-MS/MS法測(cè)定環(huán)維黃楊星D的質(zhì)量濃度

2.1 色譜與質(zhì)譜條件［9］

2.1.1 色譜條件 Agilent Elipse plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相60％甲醇（含0.15％甲酸、2 mmol/L乙酸銨）；體積流量0.2 mL/min；柱溫22℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 大氣壓電噴霧離子（APC-ESI）源，源電壓4.0 kV；加熱毛細(xì)管溫度320℃；鞘氣（N2）壓力138 kPa；輔助氣（N2）體積流量5 mL/min；正離子模式檢測(cè)，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；用于定量的離子分別為環(huán)維黃楊星D m/z403（母離子）→372（子離子）、多萘哌齊（內(nèi)標(biāo)）m/z 380（母離子）→243（子離子）；掃描時(shí)間0.5 s。

2.2 專屬性考察 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，環(huán)維黃楊星D的出峰時(shí)間在1.20 min左右，而內(nèi)標(biāo)峰在1.63 min左右。兩者峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，基線平穩(wěn)，見圖1～3。由此表明，該方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定微透析樣品中環(huán)維黃楊星D的質(zhì)量濃度，靈敏度高。

圖1　空白微透析液加入環(huán)維黃楊星D的質(zhì)譜圖Fig.1 M ass spectrograms of blanKm icrodialysates added w ith cyclovirobuxine D

圖2　空白微透析液的質(zhì)譜圖Fig.2 M ass spectrogram s of b lanKm icrodialysates

圖3　未知微透析液的質(zhì)譜圖Fig.3 M ass spectrograms of unKnown m icrodialysates

2.3 貯備液的配制

2.3.1 環(huán)維黃楊星D對(duì)照品貯備液的配制 精密稱取環(huán)維黃楊星D對(duì)照品適量，置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相配成50 μg/mL的溶液，置于4℃冰箱中保存，即得。使用時(shí)，用流動(dòng)相稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)貯備液的配制 精密稱取多萘哌齊對(duì)照品適量，置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相配成50 μg/mL的溶液，置于4℃冰箱中保存，即得。使用時(shí)，用流動(dòng)相稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.4 供試品溶液制備 取透析液60 μL，分別加入10 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，1.2 mol/L氫氧化鈉溶液60 μL，渦旋混勻30 s。再加叔丁基甲醚-二氯甲烷（2∶1）300 μL，渦旋混勻1 min，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上層萃取液200 μL，40℃水浴N2吹干，殘?jiān)?0 μL流動(dòng)相溶解。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取1.5 mL玻璃離心管若干支，分別精密加入環(huán)維黃楊星D對(duì)照品及空白透析液適量，渦旋混勻，配成0.1、1、5、10、30、50、90 ng/mL系列樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣5 μL分析。以環(huán)維黃楊星D與內(nèi)標(biāo)峰的面積比（Ai/As）對(duì)環(huán)維黃楊星D的質(zhì)量濃度（C）回歸，得回歸方程C=13.813 3Ai/As-0.909 70，r=0.999 34，表明環(huán)維黃楊星D在0.1～90 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限為10 pg/mL。

2.6 方法回收率及精密度 用空白透析液配制含低、中、高質(zhì)量濃度（0.5、5、50 ng/mL）環(huán)維黃楊星D的微透析溶液5份，精密吸取60 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，記錄環(huán)維黃楊星D和多萘哌齊的峰面積。再配置含3種質(zhì)量濃度環(huán)維黃楊星D的甲醇溶液，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0 μL流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣5 μL，記錄兩者峰面積。比較兩種溶液的峰面積，計(jì)算環(huán)維黃楊星D回收率和日內(nèi)RSD。連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得日間RSD，結(jié)果見表1。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of precision tests

3 皮膚微透析試驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220 g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境7 d以上，生活在潔凈環(huán)境中，自由飲水，房間溫度保持在（22±1）℃，相對(duì)濕度保持在35％～50％。

3.2 皮膚微透析樣品采集 取大鼠12只，剪去背部絨毛，脫毛膏脫毛后飼養(yǎng)6 d（確保皮膚表面無破損和紅斑水腫）。實(shí)驗(yàn)前，注射25％烏拉坦（0.4 mL/100 g體質(zhì)量）麻醉，固定于保溫隔墊上，使其體溫保持在37.5℃左右。用特制引導(dǎo)針將線性微透析探針平刺植入皮膚真皮層中（圖4和圖5，平均深度［350±42］μm），引導(dǎo)針抽回，微透析探針膜管留于大鼠皮膚組織中，再將線性微透析探針與微透析裝置相連（圖6）。先以空白灌流液平衡3.0 h后接樣，作為空白透析液。將環(huán)維黃楊星D透皮貼劑（含藥量分別為0.1、0.5、1.0 mg/cm2，給藥面積4 cm×2.5 cm）局部貼敷于探針上部脫毛皮膚，聚乙烯薄膜覆蓋，給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h收集透析液，LC-MS/MS法測(cè)定透析液樣品中環(huán)維黃楊星D質(zhì)量濃度。

圖4　探針植入皮膚組織圖（100倍）Fig.4 Figure of probe implanted into sKin issue（×100）

圖5　探針植入皮膚組織圖（200倍）Fig.5 Figure of p robe im p lanted into sKin issue（×200）

圖6　經(jīng)皮微透析照片F(xiàn)ig.6 Photograph of percutaneousm icrodialysis

3.3 探針體內(nèi)相對(duì)回收率穩(wěn)定性考察 藥物動(dòng)力學(xué)研究通常需要較長(zhǎng)時(shí)間，同一根微透析探針的體內(nèi)回收率如果在采樣過程中不能保持相對(duì)穩(wěn)定，則預(yù)測(cè)的相對(duì)回收率不能用來校正“真實(shí)濃度”。因此，實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)探針體內(nèi)相對(duì)回收率的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

按“3.2”項(xiàng)下方法操作，采用含藥30％乙醇-林格氏液（100 ng/mL），以1 μL/min的體積流量灌注探針。穩(wěn)定60 min后，以60 min為間隔接收透析液，LC-MS/MS法測(cè)定環(huán)維黃楊星D質(zhì)量濃度，按公式計(jì)算體內(nèi)相對(duì)損失率（RL），結(jié)果見圖7。

圖7　相對(duì)回收率穩(wěn)定性Fig.7 Stability of relative recoveries

由圖可知，體內(nèi)探針相對(duì)損失率在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定（RSD=3.82％），滿足藥物動(dòng)力學(xué)研究的要求。但探針體內(nèi)外相對(duì)損失率并不相等，體內(nèi)（47.66％）小于體外（49.77％）。

3.4 皮膚局部藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及結(jié)果分析 按“3.2項(xiàng)”下方法進(jìn)行皮膚微透析實(shí)驗(yàn)，LC-MS/MS法測(cè)定透析液中環(huán)維黃楊星D質(zhì)量濃度，以當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得，并同時(shí)測(cè)定質(zhì)控樣本。然后，以體內(nèi)相對(duì)回收率校正得到真實(shí)值，計(jì)算公式如下。

透皮貼劑皮膚給藥后，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)皮下環(huán)維黃楊星D質(zhì)量濃度，藥物動(dòng)力學(xué)曲線見圖8。

圖8　濃度-時(shí)間曲線Fig.8 Concentration-time curves

藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過Winnonlin軟件計(jì)算，曲線下面積（AUC）采用梯形面積法計(jì)算，以AIC最小值為隔室模型判斷標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑皮膚局部藥物動(dòng)力學(xué)過程符合單室模型，權(quán)重為uniform weight，參數(shù)見表2，結(jié)果見表3。

表2　房室模型擬合的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 PharmacoKinetic parameters fitted w ith com partmentmodel

從表可知，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的藥物平均滯留時(shí)間在12 h以上，透皮效果持久。藥物透皮量可用AUClast來反映，而單位時(shí)間內(nèi)平均透皮量可用AUClast/MRTlast表示，基質(zhì)藥物質(zhì)量濃度越高，單位時(shí)間內(nèi)透皮量越大，但不呈等比例增加。因此，壓敏膠中藥物質(zhì)量濃度并非是決定貼劑透皮速率的唯一因素，包括制劑處方因素在內(nèi)，影響貼劑中藥物釋放各因素之間的相互作用可能才是決定藥物透皮效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

表3　非房室模型擬合的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 PharmacoKinetic parameters fitted w ithout compartmentmodel

4 討論

微透析探針有很多種，本實(shí)驗(yàn)采用線性微透析探針，其探頭包括雙層管，外周裹著一層油性管，中間部分有個(gè)“窗口半透膜”，有著增加探針穩(wěn)定性、保證半透膜進(jìn)入或退出組織等作用。探針的入口處有一個(gè)Luer Lock連接器，以鏈接匹配的注射器或鏈接微蠕動(dòng)泵輸入透析液，另一端則用于接收含藥透析液。

探針整體模擬皮下毛細(xì)血管時(shí)，僅允許小于半透膜膜孔的分子進(jìn)入或輸出。故需要用一個(gè)引導(dǎo)針植入真皮層，然后緩慢輸入（0.5～4.0 μL/min）灌流液來與外周組織液產(chǎn)生輸入-輸出的動(dòng)態(tài)平衡，用于交換小于半透膜截?cái)嘀档奈镔|(zhì)。物質(zhì)的質(zhì)量濃度梯度交換基于Fick's第二法則，而平衡速度則與藥物的擴(kuò)散率及質(zhì)量濃度梯度大小有關(guān)［10］。

綜上所述，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的皮下藥物動(dòng)力學(xué)行為與體外透皮結(jié)果之間存在一定相關(guān)性［4］。經(jīng)皮微透析能在微創(chuàng)的條件下，滿足定性、定量、定位、連續(xù)取樣及動(dòng)態(tài)分析的研究要求，可為經(jīng)皮給藥的藥物動(dòng)力學(xué)研究，以及相關(guān)藥物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠和全新的手段［11］。

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Percutaneous absorption behavior of cyclovirobuxine D transdermal patch by m icrodialysis

LIU Xin-guo， CHENG Lu， YANG Quan-wei， ZHANG Geng*
（Wuhan MuniciPal No.1 HosPital，Wuhan 430022，China）

ABSTRACT：AIM To study the pharmacokinetic behavior of cyclovirobuxine D transdermal patch after percutaneous administration by microdialysis.M ETHODS A linearmicrodialysis probe was implanted into Wistar rats' dermis for continuous sampling.The recovery rate of cyclovirobuxine D in dialysate and its stability in vivo were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.RESULTS Cyclovirobuxine D showed a good linear relationship within the range of 0.1 -90 ng/mL（r=0.999 34），whose limit of quantification was10 pg/mL.The pharmacokinetic behavior of transdermal patch in local skin accorded with single compartmentmodel，and the average residence time of drug wasmore than 12 h.The higher concentration ofmatrix drug permitted a greater percutaneous amount per unit time，but not proportionally.CONCLUSION Minimally invasive，subcutaneousmicrodialysis can satisfy the continuous sampling and dynamic analysis for cyclovirobuxine D transdermal patch.

KEY WORDS：cyclovirobuxine D；transdermal patch；percutaneous absorption；pharmacokinetics；microdialysis；LC-MS/MS

*通信作者：張 耕，男，碩士，主任藥師，從事藥物新制劑、新技術(shù)研究與醫(yī)院藥學(xué)管理工作。Tel：（027）61871268

作者簡(jiǎn)介：劉新國(guó)，男，博士，主管中藥師，從事醫(yī)院藥物制劑的研究與開發(fā)。Tel：13628661063，E-mail：lxgdata@126.com

收稿日期：2015-10-19

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.009

中圖分類號(hào)：R969.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1006-05