王 婧, 趙 磊, 車(chē)娟娟, 李卉惠, 龐歆橋, 吳 軍, 馬妮娜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科, 北京 100050)

大黃素聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞系PANC- 1細(xì)胞增殖能力的研究*

王 婧, 趙 磊, 車(chē)娟娟, 李卉惠, 龐歆橋, 吳 軍, 馬妮娜△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科, 北京 100050)

目的：驗(yàn)證大黃素聯(lián)合吉西他濱(gemcitabine，GEM)抑制胰腺癌細(xì)胞系PANC- 1細(xì)胞增殖的作用，探討大黃素促PANC- 1細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用機(jī)制。方法： MTT方法檢測(cè)大黃素單藥以及與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PANC- 1細(xì)胞增殖能力的影響。ELISA方法測(cè)定細(xì)胞上清IL- 6水平。RT- PCR方法檢測(cè)大黃素處理后PANC- 1細(xì)胞內(nèi)侵襲相關(guān)基因MMP- 9的表達(dá)情況。Western blot方法分別檢測(cè)大黃素以及吉西他濱處理PANC- 1后凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl- 2的表達(dá)水平。結(jié)果： MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，加藥處理細(xì)胞72h后，大黃素組(40μmol/l)PANC- 1細(xì)胞抑制率為31%，GEM組(20μmol/l)的抑制率為35%，聯(lián)合用藥組的抑制率為49%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL- 6濃度大黃素組為(22.41±2.27)ng/ml，聯(lián)合用藥組為(15.44±3.91)ng/ml。實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大黃素組、聯(lián)合用藥組MMP- 9 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，GEM組較對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大黃素組、GEM組、聯(lián)合用藥組Bax表達(dá)水平上調(diào)，但Bcl- 2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大黃素組、GEM組、聯(lián)合用藥組的Bax/Bcl- 2分別為2.71±0.25, 4.73±0.17, 5.72±0.36，均顯著高于對(duì)照組1.14±0.15，結(jié)論： 體外研究結(jié)果顯示大黃素能夠抑制腫瘤PANC- 1細(xì)胞增殖，具有促細(xì)胞凋亡的作用，與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)。

大黃素； 胰腺癌； 凋亡

大黃是臨床常用中藥之一，具有瀉下等多種功效。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，大黃類(lèi)藥物在治療胰腺癌患者腹部脹滿(mǎn)不適有良好療效。課題組既往研究證實(shí)[1]，大黃對(duì)胰腺的保護(hù)機(jī)制可能與降低胰酶、減少炎性介質(zhì)、保護(hù)胰腺細(xì)胞、保護(hù)胃腸道等有關(guān)。大黃素是大黃的有效活性成分，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究大黃素與吉西他濱(gemcitabin, GEM)聯(lián)合作用對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，探討大黃素促腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC- 1由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院樣本庫(kù)提供，培養(yǎng)傳代于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2，37℃溫箱，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

大黃素購(gòu)于Sigma公司(St. Louis, USA)，使用dimethylsulfoxide (DMSO)溶解至0.2mmol/l，-20℃分裝保存，二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)的終濃度小于0.1%。吉西他濱(Gemcitabine，GEM)購(gòu)自禮來(lái)公司(Ely Lilly)，使用生理鹽水溶解至50g/L保存。1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自ExCell公司?；|(zhì)金屬蛋白酶- 9(matrix metalloproteinases- 9，MMP- 9)和GAPDH引物由北京奧克鼎盛生物技術(shù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

本研究共分為4組，A組：對(duì)照組(0.1%DMSO)，B組：GEM組(GEM，20μmol/l)、C組：大黃素組(Emodin,40μmol/l)，D組：聯(lián)合用藥組(GEM，20μmol/l+Emodin,40μmol/l)，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC- 1細(xì)胞鋪于96孔板內(nèi)，每孔50μl細(xì)胞懸液(含1× 104個(gè)細(xì)胞)，加入1640培養(yǎng)液50μl，使終體積為100μl。待培養(yǎng)72h細(xì)胞充分貼壁后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組、GEM組、大黃素組和聯(lián)合用藥組，干預(yù)72h作為實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間，每孔加入MTT溶液 20μl，37℃孵育4h，然后吸出上清，每孔各加入DMSO 150μl震蕩10分鐘，震蕩混勻后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)為490nm處的OD值。計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ELISA法測(cè)定白介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)表達(dá)

分別收集4組細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，選取美國(guó)Rapid Bio公司ELISA試劑盒，儀器：酶標(biāo)儀(SLT型，奧地利)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。(1)提前20min取出試劑盒，平衡至室溫。從密封袋中取出IL- 6抗體包被板； (2)分別將標(biāo)本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90 min；(3)去除孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350μl，靜置30s后甩干液體，在吸水紙上拍干，洗板5次；(4)除空白孔外，加入生物素化抗體工作液100μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育60 min，洗板5次；(5)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育30min，洗板5次，(6)加入顯色劑100pil；fL，避光37℃孵箱孵育15～20min。(7)加入終止液100μl/孔，混勻后即刻(5min內(nèi))測(cè)量波長(zhǎng)為450nnm處的A450值。

1.6 RT- PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP- 9 mRNA表達(dá)

培養(yǎng)收集4組胰腺癌PANC- 1細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH循環(huán)次數(shù)為25，退火溫度為60 ℃，MMP- 9循環(huán)次數(shù)為30，退火溫度為58℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶和內(nèi)參，條帶經(jīng)紫外光顯色灰度掃描，檢測(cè)4組胰腺癌PANC- 1細(xì)胞系MMP- 9的mRNA表達(dá)。引物序列如表1。

表1 MMP- 9 PCR引物序列

1.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白BCL- 2、Bax表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC- 1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，加藥處理后繼續(xù)放入37℃溫箱培養(yǎng)24h。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，每個(gè)樣品上樣30μg，行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國(guó)MiLLipore公司)上，封閉后順序加一抗(1 ∶1 000)，二抗(1 ∶5 000)，進(jìn)行雜交，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)MiLLipore公司)檢測(cè)雜交信號(hào)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大黃素、GEM以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC- 1細(xì)胞增殖能力的影響

應(yīng)用不同濃度大黃素(10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、80μmol/l、160μmol/l)對(duì)PANC- 1細(xì)胞進(jìn)行刺激，MTT方法檢測(cè)結(jié)果顯示：?jiǎn)斡么簏S素刺激胰腺癌細(xì)胞，其對(duì)增殖能力的抑制作用呈劑量依賴(lài)性(見(jiàn)圖1)。10μmol/l大黃素抑制率為17%，40μmol/l大黃素抑制率為49%，隨著大黃素濃度的增加，抑制率增加。根據(jù)IC50值，選擇40 μmol/l為大黃素濃度，加藥處理細(xì)胞72h后，大黃素組PANC- 1細(xì)胞抑制率為31%，，GEM組的抑制率為35%，聯(lián)合用藥組的抑制率為47%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度大黃素對(duì)PANC- 1細(xì)胞的增殖抑制作用

*與對(duì)照組(0μmol/l)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖2 不同組別藥物干預(yù)對(duì)PANC- 1細(xì)胞的增殖抑制作用

*與對(duì)照組(0μmol/l)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.2 大黃素、GEM以及聯(lián)合用藥對(duì)PANC- 1細(xì)胞上清液中IL- 6的影響

72h時(shí)取細(xì)胞上清，測(cè)定IL- 6濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組IL- 6濃度為(27.27±0.74)ng/ml，大黃素組為(22.59±0.64)ng/ml，GEM組為(20.44±0.69)ng/ml，聯(lián)合用藥組為(15.62±0.68)ng/ml。實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GEM組顯著低于大黃素組，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，聯(lián)合用藥組顯著低于大黃素組及GEM組(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖3。

圖3 大黃素組、GEM組以及聯(lián)合用藥組PANC- 1細(xì)胞上清液中IL- 6水平

2.3 大黃素、GEM以及聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)MMP- 9 mRNA表達(dá)

通過(guò)RT-PCR方法測(cè)定PANC- 1細(xì)胞內(nèi)MMP- 9 mRNA表達(dá)水平，計(jì)算各組MMP- 9與對(duì)照組的比值，大黃素組、GEM組、聯(lián)合用藥組MMP- 9 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組。 大黃素組和聯(lián)合用藥組低于GEM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大黃素組和聯(lián)合用藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖4。

表3 大黃素組、GEM組以及聯(lián)合用藥組PANC- 1細(xì)胞內(nèi)MMP- 9 mRNA水平

圖4 大黃素組、GEM組以及聯(lián)合組PANC- 1細(xì)胞MMP- 9水平

2.4 大黃素、GEM以及聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Bcl- 2、Bax表達(dá)

Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：用藥物干預(yù)PANC- 1細(xì)胞72h后，提取總蛋白，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl- 2的表達(dá)水平， 對(duì)照組、大黃素組、GEM組及聯(lián)合用藥組的Bax/Bcl- 2比值分別為 1.14±0.15, 2.71±0.25, 4.73±0.17, 5.72±0.36，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組，其中以聯(lián)合用藥組比值最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 不同用藥組細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Bax、Bcl- 2的表達(dá)

3 討 論

胰腺癌是惡性度較高的腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。胰腺癌的早期診斷困難，90%患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)。胰腺癌病程短、進(jìn)展快、死亡率高，其中位生存時(shí)間僅為6個(gè)月。盡管目前腫瘤的治療發(fā)展日新月異，但胰腺癌的診療瓶頸一直難以突破，胰腺癌患者整體預(yù)后不容樂(lè)觀(guān)，亟待大量的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研發(fā)療效更確切、毒副作用更小的治療方案[2]。

我們既往研究證實(shí)，大黃對(duì)胰腺的保護(hù)機(jī)制可能與降低胰酶、減少炎性介質(zhì)、保護(hù)胰腺細(xì)胞、保護(hù)胃腸道以及減少其他器官功能障礙等有關(guān)[1]。大黃素是大黃的主要有效成分，能夠起到保護(hù)胰腺的作用。近年來(lái)，諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制包括抑制腫瘤新生血管生成[3]、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]、抑制抑癌基因P16、RASSF1A、ppENK的甲基化[6]、抑制化療藥物的耐藥性產(chǎn)生等機(jī)制有關(guān)。本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素和/或GEM處理細(xì)胞72h后，大黃素組PANC- 1細(xì)胞抑制率為31%，GEM組的抑制率為35%，GEM+大黃素組的抑制率為47%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示大黃素能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，與GEM聯(lián)合使用抑制作用更為明顯。

IL- 6是核因子- κB(nuclear factor- kappa B, NF- κB)信號(hào)通路的下游炎癥介質(zhì)，它通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和激活因子3傳遞信號(hào)，阻斷炎癥過(guò)程中的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)[7]。本研究測(cè)定IL- 6濃度發(fā)現(xiàn)，大黃素組為(22.59±0.64)ng/ml，GEM組為(20.44±0.69)ng/ml，聯(lián)合用藥組為(15.62±0.68)ng/ml。實(shí)驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示大黃素可抑制胰腺癌PANC- 1細(xì)胞IL- 6水平，與GEM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)顯著降低IL- 6水平。

MMP家族能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜的完整性，從而引起腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。在MMP家族中，MMP- 9在各種惡性腫瘤中普遍存在，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切。因此，盡早抑制MMP- 9的表達(dá)可以減少腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，從而成為一個(gè)腫瘤治療靶點(diǎn)[8]。本研究觀(guān)察了大黃素、吉西他濱用藥后胰腺癌細(xì)胞MMP- 9水平的差異，結(jié)果顯示大黃素組、大黃素+GEM組的MMP- 9顯著下降，提示大黃素能夠抑制MMP- 9的水平，有助于減少腫瘤的侵襲。

凋亡在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是重要的研究?jī)?nèi)容，諸多化療藥物和活性成分能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡而起到抑制腫瘤的作用[9]。Bcl- 2和Bax是Bcl- 2基因家族的主要成員，在功能性調(diào)控凋亡過(guò)程中起重要作用。Bcl- 2是凋亡控制基因，可以維持細(xì)胞的正常形態(tài)抑制腫瘤的發(fā)生。Bax是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的蛋白，Bax/Bcl- 2的比值變化可以反應(yīng)凋亡促進(jìn)或抑制。課題組對(duì)大黃素與胰腺癌細(xì)胞Bax/Bcl- 2信號(hào)通路的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示藥物干預(yù)組Bax/Bcl- 2顯著上調(diào)，提示大黃素、GEM均有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，兩藥聯(lián)用凋亡作用更為顯著。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了由于大黃素能夠下調(diào)IL- 6、MMP- 9的水平，上調(diào)凋亡相關(guān)通路過(guò)程中Bax/Bcl- 2蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌PANC- 1細(xì)胞抑制增殖、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移作用，與GEM聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用更為明顯，可起到協(xié)同效應(yīng)，從而為大黃素在臨床上的應(yīng)用奠定了更堅(jiān)實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Inhibitory Effect of Emodin and Gemcitabine on Proliferation of Pancreatic Cancer Cell Line PANC- 1*

Wang Jing, Zhao Lei, Che Juanjuan, et al

(DepartmentofOncology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

Objective: To investigate the antitumor mechanisms of emodin with gemcitabine in the pancreatic cancer cell line PANC- 1 by proliferation, migration and invasion. Methods: The cell proliferation of PANC- 1 intervened by emodin with or without gemcitabine was detected by 4-methyl-teerazolium (MTT). IL- 6 was measured by ELISA from cellular supernatant. The expression of the gene MMP- 9 was detected by RT-PCR. Bax and Bcl- 2 protein were detected by western blot. Results: The PANC- 1 cell inhibition rate was 31% in Emodin group (40μmol/l), 35% in the GEM group (20μmol/l), and 49% in the combination group . Statistically significant differences were observed between these three groups with the control group(P<0.05). IL- 6 concentration of emodin group and combination group was (22.41±2.27) ng/ml and (15.44±3.91) ng/ml, respectively. IL- 6 concentration of the experimental groups were significantly lower than that of the control group with statistically significant difference (P<0.05). MMP- 9 mRNA expression level of emodin group and combination group were significantly lower than that of the control group. Bax/Bcl- 2 of emodin group, GEM group and combination group were (2.71±0.25),(4.73±0.17), and (5.72±0.36) respectively, which were significantly higher than that of control group (1.14±0.15). Conclusion： In vitro studies show that emodin can inhibit the proliferation and stimulate the apoptosis of pancreatic cancer cell line PANC- 1, furthermore, when comined with gemcitabine, emodin has stronger antitumor effect.

Emodin; Pancreatic Cancer; Apotosis

2015- 02- 15

2016- 06- 22

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助( 81000187)；北京市醫(yī)院管理局“青苗”計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(QML20150107)；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項(xiàng)目資助(QN2015-08)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專(zhuān)項(xiàng)基金資助(2016)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)-臨床合作課題資助項(xiàng)目(14JL31)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院院?jiǎn)?dòng)基金資助(yyqdkt2014-10)

王 婧(1981-)，女，山東人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：惡性腫瘤的綜合診治。

△馬妮娜，副主任醫(yī)師，E-mail： manina1970@sina.com

R735.9；R730-3

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.03.002