馬勝 唐新

【摘 要】目的：建立高效液相色譜法測(cè)定益智健腦膠囊中補(bǔ)骨脂素的含量。方法：采用AgiLent1 200serier SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈-水（40∶60）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素在25.06～250.60 μmg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 94，平均回收率為98.97%，RSD=0.61%，補(bǔ)骨脂素與供試品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，分離度良好，補(bǔ)骨脂素峰理論塔板數(shù)不低于4 000。該法簡(jiǎn)便、快速、專屬性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

【關(guān)鍵詞】補(bǔ)骨脂素；益智健腦膠囊；高效液相色譜法；含量

【中圖分類號(hào)】R286 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2016）10-0071-04

益智健腦膠囊為廣西強(qiáng)壽藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司在研新藥品種，由五指毛桃、扶芳藤、牛大力、千斤拔、紅參、熟地黃、肉蓯蓉、山茱萸、當(dāng)歸、肉桂、三七、升麻、甘草等13味中藥組成，具有補(bǔ)腎益脾、健腦生髓的功效，用于脾腎不足、精血虧虛所致健忘頭昏、步態(tài)不穩(wěn)、倦態(tài)食少、腰膝酸軟等癥。臨床上用于主治腦萎縮（癡呆癥）、中風(fēng)后遺癥等疾病。處方中的君藥為五指毛桃。五指毛桃又名南芪、五爪龍、五指牛奶、土北芪，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡(luò)之功效[1]，臨床上主要用于脾虛浮腫、食少無(wú)力、肝炎、風(fēng)濕痹痛、肺癆咳嗽等癥。研究表明，五指毛桃含有補(bǔ)骨脂素、十六酸、佛手內(nèi)酯、油酸等化合物[2-3]，其中補(bǔ)骨脂素為其主要成分，可作為本品含量測(cè)定基準(zhǔn)物進(jìn)行研究，以保證新藥益智健腦膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量。

腦萎縮癥是老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，常發(fā)生于50歲以上，病程可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年，男性多于女性，腦萎縮有彌漫性腦萎縮（包括皮層萎縮、小腦萎縮及皮層、小腦、腦干萎縮）及局限性腦萎縮（多見(jiàn)于局限性腦器質(zhì)性病變后如外傷、血管病、顱內(nèi)局限性感染后等），其中彌漫性腦萎縮以癡呆、智能減退、記憶障礙、性格改變、行為障礙為主。有的伴有偏癱和癲癇發(fā)作。局灶性腦萎縮以性格改變?yōu)橹?；小腦萎縮以語(yǔ)言障礙及形體的共濟(jì)失調(diào)和震顫為主。

腦萎縮的原因是很多方面的。由于年老血液成分異常等因素，血液的黏稠度增高，使血流緩慢、血流量減少，致使正常的機(jī)能活動(dòng)所需的能量減少；且年老微循環(huán)發(fā)生障礙，微循環(huán)網(wǎng)血液不暢，則記憶商可降低；老年人動(dòng)脈含氧量降低，使腦細(xì)胞陷于相對(duì)缺氧，可引起腦細(xì)胞合成各種酶和神經(jīng)傳導(dǎo)質(zhì)的量減少，均可導(dǎo)致腦萎縮。此外，遺傳在本病的發(fā)生過(guò)程中也起了一定作用，衰老的過(guò)程、代謝障礙、內(nèi)分泌機(jī)能減退等因素也與發(fā)病相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦萎縮癥屬于先天稟賦不足，腎元虧虛或疾病遷延日久，氣血不足，腦髓不充，筋脈失養(yǎng)所致；或因情志失調(diào)、氣機(jī)不暢、氣滯血瘀致使五臟功能失調(diào)使然，其中以腎元虧虛為本。腎受五臟六腑之精而藏之，且生髓并上注于腦，使髓海充養(yǎng)，髓海有余，則輕勁多力，自過(guò)其度。此外，本病與肝、脾二臟功能失調(diào)，亦有著十分密切的關(guān)系。因此，補(bǔ)腎健脾是治療本病的根本，益智健腦膠囊由五指毛桃等13味中藥組成，具有補(bǔ)腎益脾、健腦生髓的功效，對(duì)治療腎虛、脾虛引起的腦萎縮癥具有較好的療效。腦萎縮癥病因復(fù)雜，起病緩慢，不易被發(fā)覺(jué)，病程長(zhǎng)，進(jìn)展緩慢，而且可能逐漸加重，影響患者的正常生活和工作，及早發(fā)現(xiàn)、積極適當(dāng)?shù)乜刂撇∏楹瓦M(jìn)一步治療具有重要意義。

1 儀器與試藥

美國(guó)AngiLent公司1 200高效液相色譜儀；AgiLent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110739-201508），乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。益智健腦膠囊及缺五指毛桃的陰性對(duì)照樣品為廣西強(qiáng)壽藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司自制樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgiLent C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（40∶60）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL·min-1。

在上述色譜條件下，補(bǔ)骨脂素與供試品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，分離度良好，補(bǔ)骨脂素峰理論塔板數(shù)不低于4 000，補(bǔ)骨脂素及益智健腦膠囊供試樣品色譜圖如圖1所示。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，用甲醇制成每1 mL含50 μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）60 min，取出放冷，過(guò)濾，濾渣及濾器用甲醇適量洗滌3次，濾液及洗滌液置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取干燥至恒重的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品12.53 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，與儲(chǔ)備液一起組成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取以上不同濃度對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣分析，以對(duì)照品溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則補(bǔ)骨脂素的回歸方程為y=1 860 509.68x+121 204.36（r=0.999 94）。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素在25.06～250.60 μmg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，進(jìn)樣量10 μL與補(bǔ)骨脂素峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積RSD為1.02%，表明精密度較好（見(jiàn)表1）。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取益智健腦膠囊同一供試品溶液（批號(hào)：150601）在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果供試品溶液補(bǔ)骨脂素峰面積RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，峰面積沒(méi)有在考察時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（見(jiàn)表2）。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批益智健腦膠囊（批號(hào)：150601）細(xì)粉6份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測(cè)定補(bǔ)骨脂素峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果供試品中補(bǔ)骨脂素含量的RSD值為1.02%，表明實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性較好（見(jiàn)表3）。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取9份已知含量的益智健腦膠囊（批號(hào)：150601）細(xì)粉約1.0 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中。精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品15.46 mg置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。每個(gè)具塞錐形瓶分別準(zhǔn)確加入對(duì)照品5 mL和甲醇45 mL，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制成供試品液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果平均回收率為98.97%，RSD=0.61%（見(jiàn)表4）。

2.9 干擾試驗(yàn)

取缺五指毛桃的陰性樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制成陰性樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，本品輔料在補(bǔ)骨脂素出峰時(shí)間無(wú)吸收，證明輔料對(duì)補(bǔ)骨脂素的測(cè)定無(wú)干擾，從而可保證本品測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。

2.10 樣品測(cè)定

精密吸取供試品溶液10 μL分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，每樣平行測(cè)定5份，計(jì)算樣品中補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果10批樣品的補(bǔ)骨脂素含量為1.483 1～1.534 6 mg/g（見(jiàn)表5）。

3 討論

（1）供試品溶液制備的選擇采用甲醇直接超聲提取并稀釋樣品后進(jìn)樣，樣品色譜峰中，在補(bǔ)骨脂素出峰時(shí)間的2倍以后未出現(xiàn)雜質(zhì)峰，方法簡(jiǎn)便，分離效果理想。

（2）波長(zhǎng)的選擇。取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在波長(zhǎng)250 nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為250 nm。

（3）流動(dòng)相選擇。根據(jù)文獻(xiàn)資料及自擬，選擇了4個(gè)不同組成的流動(dòng)相進(jìn)行篩選試驗(yàn)，結(jié)果流動(dòng)相[乙腈-水（40∶60）]峰形良好，被測(cè)成分分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000。

（4）柱溫、流速改變的影響。取對(duì)照品溶液進(jìn)樣，考察初始柱溫在20℃、25℃、30℃，流速在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min條件下，被測(cè)成分的分離度，結(jié)果柱溫在25℃、流速為1.0 mL/min時(shí)分離度良好，能夠保證補(bǔ)骨脂素檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

（5）不同牌子或型號(hào)柱子的影響。采用3個(gè)不同廠家（“菲羅門”“安捷倫”“伊力特”）不同型號(hào)的柱子按相同色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果被測(cè)成分分離度均良好，證明不同牌子或型號(hào)的柱子對(duì)本品檢測(cè)影響不大。

（6）流動(dòng)相比例的影響。對(duì)本品檢測(cè)流動(dòng)相[乙腈-水（40∶60）]的比例進(jìn)行微調(diào)，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果被測(cè)成分分離度均良好，證明本品檢測(cè)使用的流動(dòng)相較為適宜。

（7）破壞性試驗(yàn)的影響。采用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高熱、高濕、強(qiáng)光、氧化等方法對(duì)本品供試品液進(jìn)行人為破壞，并進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果被測(cè)成分峰形良好，保留時(shí)間、分離度、板數(shù)均符合要求，證明本品檢測(cè)方法準(zhǔn)屬性較強(qiáng)。

（8）重現(xiàn)性試驗(yàn)。在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員分別對(duì)同一批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果RSD值為1.02%，誤差在規(guī)定范圍內(nèi)，證明本檢測(cè)方法重現(xiàn)性良好。

4 小結(jié)

本文建立的高效液相色譜法，結(jié)果較為準(zhǔn)確，且簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、可靠。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典編委會(huì).現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：371.

[2]董青松，歐彪，陳乾平，等.五指毛桃研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)藥，2006，28（6）：950-952.

[3]趙麗萍，狄文武，馮鋒，等.五指毛桃的化學(xué)成分[J].藥學(xué)與臨床研究，2008，16（1）：5-7.

[責(zé)任編輯：陳澤琦]