賓珍蘭 湯丹峰 鄭杰 劉一丁 陳勵(lì)虹 周瑞陽(yáng)

摘要：【目的】明確牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]大孢子與小孢子的發(fā)生發(fā)育情況，為其耕作栽培學(xué)及植物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，也為其遺傳育種研究及品種改良打下基礎(chǔ)。【方法】于盛花期采集不同發(fā)育時(shí)期的牛角瓜花蕾，運(yùn)用石蠟切片技術(shù)觀察其大孢子與小孢子的發(fā)生發(fā)育特征。【結(jié)果】牛角瓜大孢子與小孢子的發(fā)育時(shí)期與其花器官外部形態(tài)特征存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，雄蕊的發(fā)生發(fā)育早于雌蕊。牛角瓜小孢子黏連成塊狀結(jié)構(gòu)，與普通植物的分散型小孢子形成鮮明對(duì)比，其小孢子母細(xì)胞發(fā)育為連續(xù)型，絨氈層細(xì)胞有3～4層，為腺質(zhì)絨氈層，單核期絨氈層細(xì)胞壁開(kāi)始降解，花粉成熟后絨氈層細(xì)胞自溶。胚囊發(fā)育類型為蓼型，胚珠橫生，無(wú)珠被；四分體呈線型排列，成熟胚囊有次生核?！窘Y(jié)論】牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小密切相關(guān)，其結(jié)實(shí)率低并非雌性或雄性敗育所致。

關(guān)鍵詞： 牛角瓜；花粉塊；大孢子；小孢子；發(fā)生發(fā)育特征

中圖分類號(hào)： S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）10-1658-06

0 引言

【研究意義】牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]又名斷腸草、五狗臥花，屬蘿藦科常綠灌木，樹(shù)高可達(dá)3.0 m，全株富含乳汁，自然分布于熱帶和南亞熱帶地區(qū)，可在干熱河谷、沙漠化、鹽堿地、沙灘等荒地推廣種植。牛角瓜是一味傳統(tǒng)中藥，富含牛角瓜苷、強(qiáng)心苷和生物堿等有效成分，具有強(qiáng)心鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抗癌等作用。牛角瓜纖維是牛角瓜種子上生長(zhǎng)的附屬物，平均長(zhǎng)度34.0 mm，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型可利用的植物纖維（方國(guó)平和胡惠民，2014），但牛角瓜存在大量落花現(xiàn)象，受精結(jié)實(shí)率極低，其纖維產(chǎn)量一般僅有75 kg/ha左右。因此，明確牛角瓜的生殖生長(zhǎng)規(guī)律是其品種改良和高產(chǎn)栽培技術(shù)研究的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，已有較多關(guān)于牛角瓜纖維的研究報(bào)道。黃惠民（2009）通過(guò)對(duì)牛角瓜纖維進(jìn)行特殊處理，最終得到可紡纖維，開(kāi)啟了人們對(duì)牛角瓜利用的新認(rèn)識(shí)，即牛角瓜纖維可作為一種新型的紡織原料。費(fèi)魏鶴等（2011）對(duì)牛角瓜纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其具有纖維表面光澤度好、中空度大等顯著特點(diǎn)。高靜等（2013）對(duì)牛角瓜纖維的結(jié)構(gòu)、性能進(jìn)行測(cè)試，并與木棉、棉花纖維比較，認(rèn)為牛角瓜纖維中空度高、相對(duì)密度小、色澤光亮、手感柔滑，是制作保暖、高檔紡織品的新型材料。李璇等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，牛角瓜纖維縱向和橫截面形態(tài)特征顯著，且纖維密度較小，紅外吸收光譜圖有特征峰，可區(qū)別于其他纖維。目前，牛角瓜主要采用播種繁殖。高柱等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，水浸催芽可提高牛角瓜種子萌發(fā)率，且秋季播種發(fā)芽率較春季高；劉鵬等（2014）研究表明，各施肥水平對(duì)牛角瓜苗高和地徑生長(zhǎng)作用明顯，各營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)牛角瓜苗高、地徑生長(zhǎng)的影響排序?yàn)镹>P>K。牛角瓜開(kāi)花數(shù)量多，但坐果率低，且產(chǎn)量低（魏靜等，2013），極大制約了牛角瓜纖維的開(kāi)發(fā)與利用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】一般來(lái)說(shuō)，影響植物結(jié)實(shí)率的因素諸多，主要包括外在環(huán)境因素和自身生殖特性因素兩大類。外部環(huán)境因素包含溫度、光照、水分、病蟲(chóng)害等，自身生殖特性又分為有性生殖發(fā)育特性和傳粉生物學(xué)特性（何長(zhǎng)征等，2008；周建梅等，2016）。在特定的外部環(huán)境條件下，了解其生殖生長(zhǎng)情況，有助于找出結(jié)實(shí)率低的原因，為其品種改良、品種質(zhì)量和產(chǎn)量提高提供理論依據(jù)，但至今鮮見(jiàn)有關(guān)牛角瓜生殖生長(zhǎng)方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小的關(guān)系及其發(fā)育特征，為牛角瓜的耕作栽培學(xué)及植物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，也為其遺傳育種研究及品種改良打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

牛角瓜由廣西藥用植物園提供，種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)科研基地。

1. 2 試驗(yàn)方法

于盛花期采集不同發(fā)育時(shí)期的花蕾，去除花冠，用游標(biāo)卡尺按柱頭部位（包含柱頭與副花冠）大小進(jìn)行分級(jí)取樣，圖1為白色花測(cè)量方式。不同分級(jí)各取10朵花蕾，用FAA固定液固定20 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。固定材料?jīng)70%、80%、85%、90%、95%和100%梯度酒精脫水后，TO透明劑透明、透蠟、包埋、切片（厚度10 μm），再以TO透明劑脫蠟、海氏蘇木精染色5 min、樹(shù)膠封片，Olympus BH-2型光學(xué)顯微鏡下觀察與攝影。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雌、雄配子體發(fā)育時(shí)期與花器官外部形態(tài)特征的關(guān)系

牛角瓜花為兩性花，由形狀如小狗的五枚副花冠環(huán)繞柱頭，故又名五狗臥花，花藥繞生于柱頭周邊（圖1箭頭所示處），雄蕊的發(fā)生發(fā)育早于雌蕊，雄蕊發(fā)育的同時(shí)副花冠也在生長(zhǎng)，副花冠與柱頭相對(duì)位置的變化見(jiàn)表1，其顏色發(fā)生變化，由白色漸變?yōu)闇\紫色到紫色（圖1），雄蕊成熟時(shí)花冠未開(kāi)展。花冠開(kāi)展后即成熟胚囊形成。

2. 2 小孢子發(fā)生與雄配子體的發(fā)育規(guī)律

小孢子母細(xì)胞比周圍的花粉囊壁細(xì)胞大，其細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核大，核仁明顯（圖2-a），且不同切面呈不同狀態(tài)（圖2-b），之后小孢子母細(xì)胞體積繼續(xù)增大，進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期，可觀察到二分體、四分體結(jié)構(gòu)分布在整個(gè)花粉囊室內(nèi)（圖2-c），隨后進(jìn)入單核期（圖2-d），絨氈層細(xì)胞有3～4層，其細(xì)胞壁在單核靠邊期開(kāi)始降解，小孢子間存在某種物質(zhì)能促使小孢子聚集成塊（圖2-e），在花粉成熟后絨氈層細(xì)胞自溶（圖2-f），成熟花粉粒排列緊湊，形狀各異，呈明顯的棱角狀（圖2-g）。

牛角瓜一般有4～5個(gè)花藥，每個(gè)花藥有兩個(gè)花粉囊，每個(gè)花粉囊形成1～2個(gè)花粉塊，多為1個(gè)。兩個(gè)相連花粉囊的花粉塊通過(guò)花粉塊柄連在一起（圖2-h），如昆蟲(chóng)翅膀狀（圖2-i）。花藥開(kāi)裂處位于花粉塊柄生成處（圖2-h），花粉塊長(zhǎng)約1.2 mm。

2. 3 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育規(guī)律

2. 3. 1 大孢子的發(fā)生 牛角瓜花有兩枚心皮，離生（圖3-a）。子房腹縫線內(nèi)表皮局部細(xì)胞進(jìn)行平周分裂和垂周分裂，形成突起，即胚珠原基，其胎座類型為邊緣胎座（圖3-b）。胚珠原基細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，朝向胎座的一端發(fā)育為珠柄，另一端發(fā)育為珠心組織。此時(shí)的珠心組織細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，且上端細(xì)胞的分裂速度與下端細(xì)胞分裂速度相同，胚珠直線生長(zhǎng)。同時(shí)，珠心表皮下出現(xiàn)一個(gè)體積與細(xì)胞核皆比周圍珠心組織細(xì)胞大的細(xì)胞，即孢原細(xì)胞（圖3-c），孢原細(xì)胞開(kāi)始分裂形成一個(gè)在縱軸方向明顯伸長(zhǎng)的細(xì)胞，即大孢子母細(xì)胞。珠心表皮細(xì)胞與大孢子母細(xì)胞間含有2～3層細(xì)胞，即牛角瓜大孢子發(fā)育屬于厚珠心型（圖3-d）。隨后大孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期，經(jīng)過(guò)第一次分裂產(chǎn)生二分體細(xì)胞（圖3-e），在此過(guò)程中胚珠各部位珠心組織細(xì)胞分裂速度并不一致，珠柄開(kāi)始出現(xiàn)彎曲，隨后大孢子母細(xì)胞進(jìn)入第二次分裂，產(chǎn)生4個(gè)大孢子，沿胚珠長(zhǎng)軸方向排列形成線性四分體（圖3-f）。

2. 3. 2 雌配子體的發(fā)育 四分體形成后不久，珠孔端的3個(gè)大孢子會(huì)逐漸退化，近珠柄端的大孢子發(fā)育形成功能大孢子（圖4-a）。功能大孢子進(jìn)行一次細(xì)胞內(nèi)核分裂，產(chǎn)生2個(gè)細(xì)胞核，即形成二核胚囊。2個(gè)細(xì)胞核間形成一個(gè)大液泡，使2個(gè)細(xì)胞核分別向胚囊的兩極移動(dòng)（圖4-b）。2個(gè)細(xì)胞核分別在胚囊的兩端進(jìn)行兩次核分裂，形成八核胚囊（圖4-c），之后兩極端各有一個(gè)細(xì)胞核向胚囊中間移動(dòng)，形成中央細(xì)胞的極核，2個(gè)極核再進(jìn)一步融合形成次生核（圖4-d），遠(yuǎn)珠柄端剩余3個(gè)細(xì)胞核分別形成一個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)助細(xì)胞（圖4-d），而近珠柄端的3個(gè)細(xì)胞核形成反足細(xì)胞（圖4-e）。因此，牛角瓜雌配子體發(fā)育屬于蓼型。雌配子體發(fā)育過(guò)程中珠柄繼續(xù)彎曲，最后成熟胚珠為橫生胚珠（圖4-e），整個(gè)胚囊的發(fā)育過(guò)程未見(jiàn)珠被結(jié)構(gòu)。

3 討論

絨氈層是花藥壁的最內(nèi)層，對(duì)花粉的發(fā)育起著重要作用。絨氈層通常為一層，少數(shù)植物為二層或多層，牛角瓜絨氈層為3～4層，與春蘭（Cymbidium goeringii）花藥壁為二層相似（胡適宜和楊堅(jiān)，1989），可能與花粉塊的形成有關(guān)。腺質(zhì)絨氈層或稱分泌絨氈層，在花藥發(fā)育過(guò)程中腺質(zhì)絨氈層細(xì)胞壁自溶后所產(chǎn)生的原生質(zhì)體仍然能不同程度地維持原形，直到花粉成熟后，原生質(zhì)體完全自溶（武阿梅等，2008；肖玉菲等，2014）。原生質(zhì)體完全自溶前，首先是細(xì)胞壁溶解，在不同植物中細(xì)胞壁溶解的時(shí)期并不一致，番茄（Lycopersion esculentum）的細(xì)胞壁溶解是在小孢子母細(xì)胞時(shí)期（陳國(guó)菊等，1999），楸樹(shù)（Catalpa bungei）在四分體后才溶解（樊莉麗等，2011），虎榛子（Ostryopsis davidiana）在單核小孢子時(shí)期開(kāi)始溶解（武阿梅等，2008）。本研究中，牛角瓜絨氈層為腺質(zhì)絨氈層，細(xì)胞壁溶解發(fā)生在單核期。

通常情況下，被子植物的小孢子在四分體形成后胼胝質(zhì)會(huì)消失，小孢子單粒散落，如煙草（Nicotiana rustica）（朱楠等，2014）、柴胡（Bupleurum Chinese）（王艷杰和申家恒，2007）、虎榛子（武阿梅等，2008）等，也有以四分體為單位的四合花粉，如春蘭（胡適宜和楊堅(jiān)，1989）等。本研究中，牛角瓜花粉粒為無(wú)規(guī)則聚集形成花粉塊，且成熟花粉塊內(nèi)花粉粒壁厚度不一，與高斑葉蘭（Goodyera procera）（徐是雄等，1987）、春蘭（胡適宜和楊堅(jiān)，1989）等蘭科植物相似。胡適宜和楊堅(jiān)（1989）研究發(fā)現(xiàn)，在蘭科植物花粉塊形成過(guò)程中，其花粉塊成分含有孢粉素和纖維素，是由于四分體間有胞間連絲，存在聯(lián)結(jié)花粉粒的橋結(jié)構(gòu)，或由花粉粒外壁的纖維狀物質(zhì)黏合作用而形成。至于牛角瓜花粉塊內(nèi)連接小孢子與小孢子間的物質(zhì)成分是什么，以及花粉粒間是如何作用形成花粉塊等問(wèn)題，均需進(jìn)一步探究。

整個(gè)牛角瓜胚囊發(fā)育過(guò)程未見(jiàn)珠被結(jié)構(gòu)，屬于無(wú)珠被胚珠。此外，牛角瓜小孢子與大孢子發(fā)育過(guò)程正常，未發(fā)現(xiàn)敗育現(xiàn)象，說(shuō)明其結(jié)實(shí)率低與雌性或雄性不育無(wú)關(guān)，可能與花粉結(jié)構(gòu)或傳粉生物學(xué)特性有關(guān)，具體機(jī)理有待深入研究。

4 結(jié)論

牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小密切相關(guān)，其結(jié)實(shí)率低并非雌性或雄性敗育所致。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）