汪淼　唐云仙　楊柳　廖芬

摘要：【目的】探討甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中酚類物質(zhì)種類及其含量變化與甘蔗莖尖褐變的關(guān)系，為甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變機(jī)理研究及解決褐變問(wèn)題提供理論依據(jù)。【方法】利用高效液相色譜對(duì)甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中的酚類物質(zhì)（綠原酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素）進(jìn)行定性和定量分析，研究酚類物質(zhì)組成和含量在莖尖組織褐變過(guò)程中的變化規(guī)律及其與褐變的關(guān)系?！窘Y(jié)果】甘蔗莖尖褐變率增加量隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，接種后第3～6 d褐變嚴(yán)重，褐變率增加量在第6 d達(dá)峰值（16%），之后呈下降趨勢(shì)。接種培養(yǎng)后0～12 d，正常生長(zhǎng)和褐變的甘蔗莖尖均檢測(cè)出沒(méi)食子酸、綠原酸、兒茶素和表兒茶素4種酚類物質(zhì)。接種當(dāng)天4種多酚物質(zhì)含量均最高；接種后3～6 d，褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，褐變率迅速增加，沒(méi)食子酸、兒茶素和表兒茶素含量顯著下降（P<0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，褐變率增加量與酚類物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，其中與表兒茶素含量的負(fù)相關(guān)達(dá)極顯著水平（P<0.01），Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.825?！窘Y(jié)論】甘蔗莖尖褐變率增加量與酚類物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，而表兒茶素為甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中的主要酚類物質(zhì)。

關(guān)鍵詞： 甘蔗莖尖；組織培養(yǎng)；酚類物質(zhì)；褐變

中圖分類號(hào)： S566. 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0622-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate contents and types of phenols related to sugarcane stem tip browning during in vitro tissue culture， and analyze relationship between browning and polyphenols， in order to theoretical basis for studying browning mechanism of sugarcane stem tip in vitro culture and its countermeasures.【Method】The types and content of phenols（gallic acid， chlorogenic acid， catechuic acid and epicatechin） in sugarcane stem tips was determined during in vitro tissue culture using high performance liquid chromatography（HPLC）. The relationship between browning and phenolics alternation was analyzed. 【Result】The results showed that， the increment of browning rate first increased and then decreased with extension of time after inoculation， serious browning was found from the 3rd day to 6th day after inoculation， especially on the 6th day， the increment of browning rate was up to the highest value（16%）， and decreased gradually after then. Moreover， four phenols were detected from both browning and normal stem tips within 0-12 d after inoculation， including gallic acid， chlorogenic acid， catechuic acid and epicatechin. On the day of inoculation， four phenols were found to be the highest. And from the 3rd to 6th day after inoculation， the browning rate increased rapidly， while the contents of gallic acid， catechuic acid and epicatechin declined significantly（P<0.05）. The correlation analysis showed that， the increment of browning rate was negatively correlated with contents of phenols， and exteremely significantly negatively correlated with epicatechin（P<0.01）with Pearson correlation coefficient of 0.825. 【Conclusion】The increment of browning rate of sugarcane stem tip is negatively correlated with phenols content， and epicatechin is one of the main phenols during in vitro tissue culture.

Key words： sugarcane stem tip； tissue culture； phenols； browning

0 引言

【研究意義】外植體褐變及污染、玻璃化現(xiàn)象為植物組織培養(yǎng)的三大難題（趙蓬暉等，2001）。褐變（酚害）分為酶促褐變和非酶促褐變兩種，目前普遍認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起，而底物、酶和氧是酶促褐變的3個(gè)必備條件（李海明等，2003）。酚類物質(zhì)普遍存在于正常植物的細(xì)胞內(nèi)，與氧化酶同時(shí)存在，正常情況下并不發(fā)生褐變，當(dāng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞時(shí)，酶和底物的區(qū)域性分布被打破，使酶和底物接觸，便在有氧條件下產(chǎn)生褐變現(xiàn)象（Laukkanen et al.，1999）。甘蔗是無(wú)性繁殖作物，多年連作后極易受病害侵染，利用莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒健康種苗是目前普遍采用的控制病害的方法。但甘蔗是一種多酚類物質(zhì)含量較高的作物，尤其是幼嫩莖尖和嫩葉鞘含量更高（秦廷豪等，1997），在莖尖培養(yǎng)時(shí)，由于接種時(shí)不可避免的切割和繼代培養(yǎng)中細(xì)胞受到破壞，細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)聚集與氧化而導(dǎo)致的酶促褐變是影響甘蔗叢生芽誘導(dǎo)、增殖及組培苗質(zhì)量的重要因素之一。因此，有效解決褐變問(wèn)題是甘蔗莖尖培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵。酚類物質(zhì)作為酶促褐變的底物，是促使愈傷組織褐變的主要原因之一。闡明與甘蔗莖尖組織培養(yǎng)褐變相關(guān)的酚類物質(zhì)種類，探討酚類物質(zhì)與甘蔗莖尖組織培養(yǎng)褐變的關(guān)系，對(duì)深入探索甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變機(jī)理，進(jìn)而從根本上解決褐變問(wèn)題、完善甘蔗組織培養(yǎng)技術(shù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】甘蔗褐變現(xiàn)象的影響因素復(fù)雜多樣，因外植體生長(zhǎng)部位、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等的不同而不同。秦廷豪等（1997）、賢武等（2000）研究表明，外源激素會(huì)加重植物組織培養(yǎng)褐變現(xiàn)象，因此，降低激素含量可提高莖芽成活率和叢芽誘導(dǎo)率，且可極大降低褐變。盧文祥等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗外植體的最佳采集時(shí)期是每年的6～8月，與其他季節(jié)相比，夏季甘蔗生長(zhǎng)處于拔節(jié)期，采芽培養(yǎng)誘導(dǎo)成活率高，而冬季采集的外植體容易褐變且誘導(dǎo)期長(zhǎng)。人為的切割、高溫、高CO2及強(qiáng)光照均會(huì)促使褐變發(fā)生（楊柳等，2007；劉野等，2011）。甘蔗組織培養(yǎng)中抑制褐變產(chǎn)生的常用方法一般有在培養(yǎng)基中添加吸附劑或褐變抑制劑、在最佳季節(jié)采集外植體、選擇幼嫩組織、選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（如暗培養(yǎng)、選擇液體培養(yǎng)基、低鹽培養(yǎng)基）、進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接及接種前在水中或抗氧化劑中浸泡等（李海明等，2003；黃誠(chéng)梅等，2004），這些方法極大地提高了組織培養(yǎng)的成功率，但每種方法均有其適用范圍和局限性，制約了其在大規(guī)模工業(yè)化組培生產(chǎn)中的應(yīng)用。【本研究切入點(diǎn)】前人對(duì)甘蔗組織培養(yǎng)褐變的研究主要集中于影響褐變的因素及如何通過(guò)改變這些影響因素減輕褐變帶來(lái)的危害方面，而有關(guān)甘蔗莖尖組織培養(yǎng)褐變機(jī)理的研究尚未見(jiàn)深入報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中酚類物質(zhì)的定性與定量分析，闡明與甘蔗莖尖組織培養(yǎng)褐變相關(guān)的酚類物質(zhì)種類，并探討酚類物質(zhì)含量變化與莖尖褐變的關(guān)系，以期為甘蔗莖尖離體培養(yǎng)褐變機(jī)理研究及從根本上解決褐變問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用甘蔗品種為ROC22，來(lái)源于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所試驗(yàn)基地。將蔗莖砍成單芽段，單芽蔗莖長(zhǎng)度為5 cm，38 ℃恒溫催芽28 d后用于接種。沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純（美國(guó)Sigma公司），甲醇、醋酸為色譜純?cè)噭绹?guó)Fisher公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

取甘蔗單芽苗，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ジ收崆o尖，然后接種到培養(yǎng)基（MS+3 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂）上，28 ℃下暗培養(yǎng)。

1. 2. 1 甘蔗莖尖褐化率變化 分別于接種后3、6、9和12 d統(tǒng)計(jì)褐化率的變化。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種50個(gè)莖尖。褐化率增加量（%）=新增褐化數(shù)/總接種數(shù)×100。

1. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)品制備 根據(jù)前人的研究結(jié)果（孫曉雪，2007；陳純，2013）選取沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素4種酚類物質(zhì)為研究對(duì)象。分別稱取沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的綠原酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素對(duì)照品母液，另分別取對(duì)照品母液配制混合溶液，混合溶液的質(zhì)量濃度為0.20、0.10、0.05、0.02和0.01 mg/mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，將配好的標(biāo)準(zhǔn)混合液保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 酚類物質(zhì)提取及分析 分別于接種后0、3、6、9和12 d取樣，除0 d外，其余天數(shù)取正常生長(zhǎng)和褐變的材料進(jìn)行對(duì)比。稱取甘蔗樣品0.5 g于10 mL容量瓶中，放入超聲波儀器中超聲波提取60 min，將液體經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到樣品粗溶液。酚類物質(zhì)的定性定量分析采用Waters E2695高效液相色譜儀，色譜柱：C18酚酸柱；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為1%醋酸；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；分析時(shí)間：25 min。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007制圖、采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 甘蔗莖尖褐變率增加量的變化

由圖1可看出，甘蔗莖尖的褐變率增加量隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。從接種后第3 d開(kāi)始，褐變率增加量明顯上升，接種后第6 d達(dá)峰值（16%），說(shuō)明在接種后3～6 d的時(shí)間段內(nèi)褐化比較嚴(yán)重，褐化莖尖個(gè)數(shù)較多。接種后6～12 d，褐變率增加量逐漸降低。

2. 2 褐變過(guò)程中莖尖多酚類物質(zhì)含量變化

2. 2. 1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果 如圖2所示，在1.2.3所述色譜條件下進(jìn)行分析，沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素均能得到良好的分離，說(shuō)明此分離條件能達(dá)到較好的分離效果。

2. 2. 2 酚類物質(zhì)含量變化

2. 2. 2. 1 沒(méi)食子酸含量 由圖3可看出，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，甘蔗莖尖內(nèi)的沒(méi)食子酸含量整體上呈降低趨勢(shì)。接種當(dāng)天（0 d）甘蔗莖尖內(nèi)沒(méi)食子酸的含量高于1.10 μg/g；接種后3 d，正常和褐變材料的沒(méi)食子酸含量均顯著低于接種當(dāng)天的含量（P<0.05，下同），分別為0.43和0.29 μg/g；接種后6 d，褐變材料的沒(méi)食子酸含量繼續(xù)降低，顯著低于接種后3 d的含量，為0.17 μg/g，正常材料的沒(méi)食子酸含量無(wú)顯著變化（P>0.05，下同）；接種后9和12 d，正常材料莖尖的沒(méi)食子酸含量顯著低于前期，褐變材料的沒(méi)食子酸含量則與接種后6 d無(wú)顯著差異。在接種后的第3和6 d，褐變材料的沒(méi)食子酸含量顯著低于正常材料，之后隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量與正常材料無(wú)顯著差異。

2. 2. 2. 2 兒茶素含量 由圖4可看出，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，甘蔗莖尖內(nèi)的兒茶素含量呈先降低后略微升高的變化趨勢(shì)。接種當(dāng)天（0 d）甘蔗莖尖內(nèi)的兒茶素含量高于3.20 μg/g；接種后3～9 d，正常和褐變材料的兒茶素的含量均持續(xù)降低，第9 d時(shí)達(dá)最低值，分別為0.19和0.35 μg/g；接種后第12 d，兩種材料的兒茶素含量均有所回升。接種后的第3 d，褐變材料的兒茶素含量顯著低于正常材料，之后隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者的兒茶素含量無(wú)顯著差異。

2. 2. 2. 3 綠原酸含量 由圖5可看出，甘蔗莖尖內(nèi)的綠原酸含量在接種當(dāng)天（0 d）接近1.00 μg/g；接種后3 d，正常和褐變材料的綠原酸含量均顯著低于接種當(dāng)天，之后隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種材料的綠原酸含量變化不明顯。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，正常生長(zhǎng)甘蔗莖尖內(nèi)的綠原酸含量均顯著高于褐變材料。

2. 2. 2. 4 表兒茶素含量 由圖6可看出，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，甘蔗莖尖內(nèi)的兒茶素含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì)。接種當(dāng)天（0 d）甘蔗莖尖內(nèi)的表兒茶素含量高于3.50 μg/g，接種后3 d，正常和褐變材料的表兒茶素含量均顯著低于接種當(dāng)天；接種后6 d，兩種材料的表兒茶素含量降至最低值，分別為0.77和0.20 μg/g；接種后9～12 d，正常和褐變材料的表兒茶素含量均持續(xù)升高。在接種后的第3、6和12 d，褐變材料的表兒茶素含量顯著低于正常材料，第9 d時(shí)與正常材料差異不顯著。

2. 2. 3 褐變率增加量與酚類物質(zhì)含量的相關(guān)性 由表1可知，褐變率增加量與4種酚類物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，其中與表兒茶素含量的負(fù)相關(guān)達(dá)極顯著水平（P<0.01），Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.825。

3 討論

不同植物所含的酚類物質(zhì)種類及含量不同，參與褐變過(guò)程的主要酚類物質(zhì)也不同。孫曉雪（2007）研究認(rèn)為，甘蔗梢中的酚類物質(zhì)包括表兒茶素、兒茶素、綠原酸和沒(méi)食子酸，其中以表兒茶素含量最高。印芳等（2008）利用高效液相色譜對(duì)3個(gè)褐變程度不同的蝴蝶蘭品種進(jìn)行9種酚酸的定性定量分析，認(rèn)為綠原酸、鄰苯二酚、兒茶酚、咖啡酸、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆酸可能與蝴蝶蘭褐變相關(guān)，苯甲酸對(duì)蝴蝶蘭褐變影響較小。本研究在甘蔗莖尖培養(yǎng)過(guò)程中共檢測(cè)到4種酚類物質(zhì)，包括沒(méi)食子酸、綠原酸、兒茶素和表兒茶素，其中表兒茶素含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均最高，因此推測(cè)表兒茶素可能是甘蔗莖尖內(nèi)主要的酚類物質(zhì)，與孫曉雪（2007）對(duì)甘蔗梢中多酚的研究結(jié)果基本一致。對(duì)甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中酚類物質(zhì)的定性定量分析結(jié)果表明，接種當(dāng)天甘蔗莖尖內(nèi)4種酚類物質(zhì)的含量最高，可能是因?yàn)榻臃N切割刺激甘蔗產(chǎn)生了大量酚類物質(zhì)；接種后第3 d， 4種酚類物質(zhì)含量明顯減少，褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，第3～6 d褐變率迅速增加，沒(méi)食子酸、兒茶素和表兒茶素含量繼續(xù)下降，且在褐變?cè)黾幼羁祀A段正常材料的酚類物質(zhì)含量均顯著高于褐變材料，所檢測(cè)到的酚類物質(zhì)含量與甘蔗莖尖褐變率呈負(fù)相關(guān)，其中表兒茶素含量與莖尖褐變率的負(fù)相關(guān)達(dá)極顯著水平，說(shuō)明甘蔗莖尖組織內(nèi)的酚類物質(zhì)很可能參與了酶促褐變，在氧化酶的作用下被氧化成醌，因此其含量降低。這與及華等（2006）對(duì)梨組織培養(yǎng)中外植體褐變研究表明的酚類物質(zhì)含量與組織培養(yǎng)褐變率有一定相關(guān)性，在梨外植體褐變中起決定性作用的研究結(jié)果相似。印芳等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭組織培養(yǎng)褐變過(guò)程中PPO活性高峰出現(xiàn)在接種后第2 d，第6 d后變化不明顯。甘蔗莖尖培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)到的酚類物質(zhì)含量在培養(yǎng)第3 d顯著下降，第6 d后變化不明顯，甘蔗莖尖中酚類物質(zhì)含量的變化與蝴蝶蘭外植體褐變過(guò)程中PPO活性的變化有一定的相關(guān)性，也進(jìn)一步證明這些酚類物質(zhì)很有可能作為底物參與了甘蔗組織培養(yǎng)酶促褐變反應(yīng)，被氧化酶氧化，從而導(dǎo)致褐變。隨著甘蔗莖尖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表兒茶素和兒茶素含量在培養(yǎng)后期又有所上升，可能是因?yàn)槎卟粌H參與了褐變反應(yīng)，還在其他逆境生理方面起作用，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甘蔗莖尖組織培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)出了沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素4種酚類物質(zhì)，其中以表兒茶素含量最高，為主要的酚類物質(zhì)；褐變率增加量與酚類物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 溫國(guó)泉）