李哲　賀永國　黃綿佳　曾憲海

摘要：【目的】以3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1基因（HbHMGR1）乳管表達(dá)載體pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，獲得抗性轉(zhuǎn)基因材料，為研究HbHMGR1基因的乳管特異性表達(dá)及提高橡膠產(chǎn)量打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坑酶┺r(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1轉(zhuǎn)化橡膠樹品種熱研8-79花藥易碎胚性愈傷組織，經(jīng)卡那霉素篩選數(shù)月后，對(duì)抗性愈傷組織進(jìn)行GUS染色和分子檢測(cè)。【結(jié)果】經(jīng)過對(duì)根癌農(nóng)桿菌侵染的易碎愈傷組織進(jìn)行4～6個(gè)月篩選，得到5個(gè)GUS檢測(cè)呈陽性的抗性愈傷組織系；取其中的2號(hào)和11號(hào)抗性愈傷組織系進(jìn)行PCR鑒定，均能擴(kuò)增出與陽性對(duì)照相同的特異片段，uidA、NPTII和PHEV2.1-

HbHMGR1序列的目的片段大小分別為829、797和3592 bp。2號(hào)和11號(hào)抗性愈傷組織系經(jīng)反向PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)2號(hào)抗性愈傷組織系未擴(kuò)增出目的條帶，而11號(hào)抗性愈傷組織系擴(kuò)增獲得一條約2000 bp的條帶，包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列，其中未知DNA序列是橡膠樹品種熱研8-79基因組的一段連續(xù)序列。【結(jié)論】將植物表達(dá)載體的T-DNA整合到抗性愈傷組織系基因組DNA中，可獲得一個(gè)含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。

關(guān)鍵詞： 橡膠樹；HbHMGR1基因；乳管特異性啟動(dòng)子PHEV2.1；易碎愈傷組織；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)： S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）05-0597-07

Abstract：【Objective】The laticifer expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 containing 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 gene（HbHMGR1） was constructed successfully， and transform friable embryogenic callus of rubber tree clone to obtain transgenic materials， in order to provide basis for studying specific expression of exogenous HbHMGR1 gene in laticifer and increasing rubber yield. 【Method】The expression vector pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1 were transfered into friable embryogenic callus of elite rubber tree clone Reyan 8-79 by mediation of Agrobacterium tumefaciens strain EHA105. Friable calluses were cultivated in subculture medium supplemented with 75 mg/L kanamycin for months. Then the kanamycin-resistant calluses were detected by GUS staining. 【Result】A total of 5 kanamycin-resistant friable embryogenic callus lines were obtained after screening of 4-6 months， and GUS detection showed that， they were positive. In addition， PCR identification results showed that， the specific DNA fragments could be amplified from resistant callus lines 2 and 11 as same as positive control， the target fragments of uidA， NPTII and PHEV2.1-HbHMGR1 were 829， 797 and 3592 bp in length， respectively. The inverse PCR（IPCR） identification results showed that， the positive fragments could not be amplified from line 2， while one band with the length of 2000 bp was amplified from the line 11， which contained T-DNA sequence and an unknown DNA sequence. Then this unknown DNA sequence was identified as a segment of continuous sequence of genome of rubber tree clone Reyan 8-79 by using genome database of rubber tree. 【Conclusion】The T-DNA region of plant expression vector is integrated into genome of resistant callus line， so as to obtain one transgenic callus line with 35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA.

Key words： Hevea brasiliensis； HbHMGR1 gene； laticifer specific promoter PHEV2.1； friable callus； genetic transformation

0 引言

【研究意義】橡膠樹是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)出的天然橡膠是重要戰(zhàn)略物資（張志平等，2014）。近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)和國防事業(yè)的快速發(fā)展，我國天然橡膠的自給率逐年下降，進(jìn)口依賴度不斷攀升（王少明，2011）。然而，橡膠樹適種區(qū)域有限，通過擴(kuò)大種植面積增加橡膠產(chǎn)量的潛力極小，因此開展橡膠樹品種改良、提高橡膠單產(chǎn)的研究迫在眉睫。天然橡膠生物合成是影響橡膠樹膠乳產(chǎn)量的重要因素（吳春太等，2009），改進(jìn)其調(diào)控機(jī)理可能對(duì)提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量產(chǎn)生積極作用。橡膠樹3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1（HbHMGR1）是橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶（Chye et al.，1992；Venkatachalam et al.，2009），在非產(chǎn)膠植物中缺乏此酶，而HEV2.1基因啟動(dòng)子是乳管特異表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008），因此，利用HEV2.1基因啟動(dòng)子構(gòu)建HbHMGR1基因的乳管特異性表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化橡膠樹，對(duì)提高橡膠產(chǎn)量具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】2005年，Pujade-Renaud等成功克隆獲得橡膠蛋白基因HEV2.1啟動(dòng)子（PHEV2.1），并發(fā)現(xiàn)其能驅(qū)動(dòng)uidA基因在轉(zhuǎn)基因水稻的許多組織中高水平表達(dá)。Montoro等（2008）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)PHEV2.1能驅(qū)動(dòng)uidA基因在橡膠樹乳管細(xì)胞中特異性表達(dá)。賀永國等（2016）克隆獲得熱研7-33-97的PHEV2.1，并構(gòu)建了HbHMGR1的植物表達(dá)載體。天然橡膠生物合成是一種典型的類異戊二烯途徑次生代謝（段翠芳等，2004），HbHMGR是該途徑的關(guān)鍵限速酶。在橡膠樹中存在HMGR基因家族，包含hmg1、hmg2和hmg3等3個(gè)基因。其中，hmg1（HbHMGR1）是橡膠樹特有基因，在非產(chǎn)膠植物中缺乏相應(yīng)基因成員，主要在乳管中特異性表達(dá)，且由乙烯誘導(dǎo)，其編碼的酶被認(rèn)為參與了橡膠生物合成；hmg3基因的表達(dá)不受乙烯影響，其作為“看家”基因在組織中呈組成型表達(dá)，無細(xì)胞類型特異性；hmg2和hmg3基因未參與橡膠生物合成，編碼的酶參與類異戊二烯的生物合成（Chye et al.，1991， 1992）。在非產(chǎn)膠植物擬南芥中，HMGR是由2個(gè)差異表達(dá)的基因所編碼，其中HMG2基因的表達(dá)僅限于分生組織（根尖和莖尖）和花組織（Enjuto et al.，1995）。Lynen（1969）曾對(duì)橡膠生物合成途徑所涉及的9種酶進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果表明，HMGR活性遠(yuǎn)低于其他酶，約為其他酶活性的1/1000，是橡膠生物合成的限速酶。Schaller等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)橡膠樹HbHMGR1基因煙草的甾醇含量比對(duì)照提高了6倍。Dong等（2013）也研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)構(gòu)巢曲霉HMGR的部分銀膠菊表現(xiàn)出膠乳產(chǎn)量增加，有力佐證了HMGR是類異戊二烯合成途徑的關(guān)鍵限速酶。馬曉曉等（2014）通過克隆橡膠樹品種熱研7-33-97的HbHMGR1基因，然后與CaMV35S組成型啟動(dòng)子連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織，最終獲得轉(zhuǎn)HbHMGR1基因易碎愈傷組織系，且發(fā)現(xiàn)HbHMGR1基因在愈傷組織階段即開始表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管已有PHEV2.1和HbHMGR1基因的研究報(bào)道，但尚無利用PHEV2.1構(gòu)建HbHMGR1基因乳管特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化橡膠樹的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以橡膠樹花藥易碎愈傷組織為受體材料，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)乳管特異性表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得轉(zhuǎn)基因植株，為研究HbHMGR1基因的乳管特異性表達(dá)及提高橡膠產(chǎn)量打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)化所用植物受體材料為橡膠樹品種熱研8-79的花藥易碎胚性愈傷組織，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供。乳管特異性表達(dá)載體pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1和根癌農(nóng)桿菌EHA105由農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。氨芐青霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素等抗生素購自北京索萊寶公司；DL2000 DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自美國Omega公司；限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化采用凍融法，感受態(tài)細(xì)胞的制備參照魏琦超和暢麗萍（2009）的方法。取1管根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解，向菌液中加入0.5 μg重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，輕輕振蕩混勻，冰浴30 min；液氮中速凍1 min，然后37 ℃溫育5 min；取出樣品，迅速置于冰上冷卻5 min；加入1 mL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃下?lián)u床（100 r/min）培養(yǎng)4 h；再5000 r/min離心5 min，收集菌體，懸浮于300 μL的LB液體培養(yǎng)基中；將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂抹在含有50 mg/L Rif和50 mg/L Str的LA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d；菌落長(zhǎng)出后，用特異引物PHF1/H1R（5'-GCTCTAGAA

TGGACACCACCGGCC-3'和5'-CCCCCCGGGCTAAG

ATGCAGCTTTAGAC-3'）對(duì)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增（賀永國等，2016）。選取PCR檢測(cè)呈陽性的菌株用于制備工程菌。

1. 2. 2 橡膠樹易碎胚性愈傷組織的培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化所用植物受體材料熱研8-79花藥易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)參照李哲等（2010）的方法，將從花藥誘導(dǎo)獲得的緊致愈傷組織置于高鈣離子濃度（11.0 mmol/L）的繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每隔20 d繼代1次，經(jīng)過5次以上的繼代后，篩選出適合長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的易碎胚性愈傷組織。

1. 2. 3 花藥易碎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化及GUS組織化學(xué)染色 參照Blanc等（2006）的方法進(jìn)行易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化。將易碎胚性愈傷組織置于無鈣離子的繼代培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間后（Montoro et al.，2003），對(duì)愈傷組織進(jìn)行侵染、共培養(yǎng)、抑菌和篩選，然后參照馬曉曉等（2014）的方法將篩選獲得的抗性愈傷組織進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，選取呈GUS染色陽性的抗性愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)增殖，形成愈傷組織系，以便用于后續(xù)的分子檢測(cè)和體細(xì)胞胚發(fā)生。

1. 2. 4 抗性愈傷組織的PCR檢測(cè) 以非抗性愈傷組織和篩選6個(gè)月以上的抗性愈傷組織為材料，分別提取基因組DNA；根據(jù)T-DNA上uidA、NPTII和PHEV2.1- HbHMGR1的序列，用Primer 5.0各設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，引物分別命為UF/UR（5'-GCGAAGTCTTTATACCGA

AAGGTTG-3'和5'-ACGATGCCATGTTCATCTGCCC

AG-3'）、NPT-F/NPT-R（5'-TCAGAAGAACTCGTCAA

GAAG-3'和5'-ATGGGGATTGAACAAGATGGAT-3'）、PHHF/PHHR（5'-CTTGTTTGCACATGATGCGTTCAG

GTGACC-3'和5'-TCCCCCCGGGCTAAGATGCAGCT

TTAGAC-3'），3對(duì)引物擴(kuò)增的目的片段大小分別為829、797和3592 bp。

1. 2. 5 反向PCR擴(kuò)增抗性愈傷組織外源基因插入位點(diǎn)的左旁側(cè)序列 根據(jù)植物表達(dá)載體的T-DNA序列，在T-DNA內(nèi)部的EcoRⅠ至左邊界（TL）的序列上設(shè)計(jì)1對(duì)反向引物Eco-F/TL-R（5'-CTGCTCTAGCCAA

TACGCAAACC-3'和5'-GTGAGTAGTTCCCAGATAA

GGGAAT-3'）；抗性愈傷組織的基因組DNA經(jīng)過一系列的酶切、純化和T4 DNA連接酶環(huán)化后，以環(huán)化產(chǎn)物為模板，以Eco-F/TL-R為引物進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，3次重復(fù)；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至橡膠樹品種熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，驗(yàn)證其是否為橡膠樹基因組上的片段。

2 結(jié)果與分析

2. 1 植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

將表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，在含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L鏈霉素的LA培養(yǎng)基上培養(yǎng)36～48 h后，挑取5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果均為陽性（圖1），表明植物表達(dá)載體pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1已成功轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌中。

2. 2 抗性愈傷組織的GUS染色鑒定結(jié)果

以含表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的根癌農(nóng)桿菌侵染橡膠樹品種熱研8-79的花藥易碎胚性愈傷組織，經(jīng)4～6個(gè)月篩選，得到5個(gè)GUS組織化學(xué)染色呈陽性的卡那霉素抗性愈傷組織系。圖2為其中一個(gè)抗性愈傷組織系的GUS染色結(jié)果，表明植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1的T-DNA序列已成功轉(zhuǎn)入易碎愈傷組織細(xì)胞中。

2. 3 抗性愈傷組織PCR檢測(cè)結(jié)果

從篩選獲得的5個(gè)抗性愈傷組織系中挑選增殖較多的2個(gè)組織系，分別提取其基因組DNA，以非轉(zhuǎn)化愈傷組織系基因組DNA為陰性對(duì)照，以植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1為陽性對(duì)照，用uidA、NPTII和PHEV2.1-HbHMGR1的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每系重復(fù)2次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從2個(gè)抗性愈傷組織系均能擴(kuò)增出與陽性對(duì)照相同的特異片段，其目的片段大小分別為829（圖3）、797（圖4）和3592 bp（圖5）。

2. 4 反向PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化愈傷組織T-DNA左旁側(cè)序列

反向PCR鑒定結(jié)果表明，2號(hào)抗性愈傷組織系未擴(kuò)增出目的條帶，而11號(hào)抗性愈傷組織系擴(kuò)增獲得一條約2000 bp的條帶（圖6）。對(duì)從11號(hào)抗性愈傷組織系反向PCR擴(kuò)增所得的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示該片段為1803 bp，其中包含反向引物擴(kuò)增到的T-DNA序列和一段未知的DNA序列（1303 bp）（圖7）。未知DNA序列經(jīng)橡膠樹品種熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在熱研7-33-97基因組中存在一段與未知DNA序列高度同源的連續(xù)序列[scaffold0878（117328-118630）]，二者的同源性為98.7%，證明所獲得的未知片段為橡膠樹基因組的一段連續(xù)序列，植物表達(dá)載體的T-DNA序列已成功整合到橡膠樹品種熱研8-79的染色體上，即11號(hào)抗性愈傷組織系為轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。

3 討論

目前，NCBI上關(guān)于天然橡膠HbHMGR1基因有3條序列，GenBank登錄號(hào)分別為AY706757.1、X54659.1和AB294692.1，其中X54659.1來源于橡膠品種RRIM 600，AY706757.1來源于橡膠品種RRII 105，AB294692.1來源于橡膠品種RRIM 600，彼此間僅有1～2個(gè)堿基差異。X54659.1和AB294692.1的第1031位堿基均為G，為PstⅠ酶切位點(diǎn)[ctgcag（1029…1034）]，而AY706757.1的第1031位堿基為A，非PstⅠ酶切位點(diǎn)[ctacag（1029…1034）]。X54659.1和AY706757.1的DNA序列相似率為99.9%，其編碼蛋白質(zhì)序列差異在第344位氨基酸殘基，X54659.1為半胱氨酸（Cys），而AY706757.1Y為酪氨酸（Tyr），其他氨基酸殘基相同，蛋白質(zhì)序列相似率為99.8%。本課題組曾根據(jù)已報(bào)道的HbHMGR1基因序列（GenBank登錄號(hào)X54659.1）設(shè)計(jì)特異引物，以橡膠優(yōu)良品種熱研7-33-97膠乳為材料，通過反向PCR克隆HbHMGR1基因，并委托深圳華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，目的片段大小為1728 bp，與X54659.1的HbHMGR1基因核苷酸序列相比，同源性達(dá)100%（馬曉曉等2014）；同時(shí)委托生工生物工程（上海）股份有限公司將X54659.1的第1031位堿基由G點(diǎn)突變?yōu)锳，致使PstⅠ酶切位點(diǎn)消失，以利于后續(xù)的植物表達(dá)載體構(gòu)建研究。

在植物轉(zhuǎn)基因研究中，反向PCR已成為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的一種重要手段（張雨麗等，2014），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于煙草（Does et al.，1991）、水稻（章冰和衛(wèi)志明，1999；韓志勇等，2001）和油菜（楊坤等，2010；申愛娟等，2014）等植物，但在橡膠樹中的應(yīng)用尚無報(bào)道。本研究利用該技術(shù)成功從橡膠樹卡那霉素抗性愈傷組織系基因組DNA中克隆獲得外源T-DNA整合位點(diǎn)的左旁側(cè)序列，并證實(shí)篩選得到的抗性愈傷組織系為轉(zhuǎn)基因愈傷組織系，為今后利用該技術(shù)檢測(cè)橡膠樹轉(zhuǎn)基因材料提供新的途徑。另外，在對(duì)反向PCR擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)整合T-DNA的左邊界及靠近左邊界的一段T-DNA序列完全缺失，與Fang等（2000）分析轉(zhuǎn)基因水稻T-DNA左旁側(cè)序列的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)篩選得到的抗性愈傷組織系即為轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，將表達(dá)載體的T-DNA整合到橡膠樹品種熱研8-79的卡那霉素抗性愈傷組織系基因組DNA中，能獲得一個(gè)含35S-NPTII-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）