官玲亮 夏奇峰 石小兵 藍(lán)惠萍 陳振夏 趙致 龐玉新

摘 要 采用RT-PCR和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)，從艾納香（Blumea balsamifera L. DC）的葉片中克隆到單萜化合物合成的關(guān)鍵酶牻牛兒基焦磷酸合成酶（BbGPPS）基因。研究結(jié)果顯示，BbGPPS基因的cDNA全長1 692 bp，包含開放閱讀框（ORF）1 083 bp，編碼361個氨基酸；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位于葉綠體，既非膜蛋白也非分泌性蛋白。疏水性分析顯示，BbGPPS是親水性蛋白。同源性比對結(jié)果顯示，BbGPPS蛋白與其他植物中GPPS蛋白具有高度的相似性，且具有異戊烯基結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有序列被聚為5大類，BbGPPS與其他菊科植物聚類一類，與萬壽菊（Tagetes erecta）TeGPPS親緣關(guān)系最近，其次是甜菊（Stevia rebaudiana）SrGPPS。

關(guān)鍵詞 艾納香；牻牛兒基焦磷酸合成酶；氨基酸序列；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號 S567；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract A geranyl diphosphate synthase gene， designated BbGPPS， was cloned from Blumea balsamifera L. DC using reverse transcription polymerase chain reaction approach（RT-PCR）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）methods. The results showed that The BbGPPS cDNA had a full length of 1 692 bp， and contained an open reading frame predicting a polypeptide of 361 amino acids. Hydropathy and subcellular localization prediction showed that the BbGPPS belonged to hydrophilic protein and located in Chloroplasts. It was neither a membrane protein nor a secretory protein. BbGPPS protein showed a high similarity with other plant GPPS genes， containing isopentenyl domain. Phylogenetic analysis indicated that the amino acid sequence was divided into five categories and BbGPPS grouped with other composite plant GPPS， such as Tagetes erecta TeGPPS and Stevia rebaudiana SrGPPS.

Key words Blumea balsamifera L. DC； Geranyl diphosphate synthase； Amino acid sequence； Phylogenetic analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.009

艾納香（Blumea balsamifera L. DC）為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，最早記載于公元741年（唐開元二十九年）陳藏器所編著《本草拾遺》，此后宋代劉翰等編著《開寶本草》（公元973～974年）也曾記載[1]。艾納香以根、嫩枝、葉入藥，其性微溫，味辛、微苦，具有祛風(fēng)消腫、活血散瘀之功效，可用于治療感冒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后風(fēng)痛、痛經(jīng)、 外用跌打損傷、瘡癤痛腫、濕疹皮炎。另外，艾納香還具有抗氧化、抗癌和抗病毒的作用[2]。主要分布于中國海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺灣等省。在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的藥用歷史，是一種重要的民間藥物。左旋龍腦（L-龍腦）又名艾片，是艾納香中重要的次生代謝產(chǎn)物，是艾納香主要的藥用活性成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，L-龍腦具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)藥物吸收、提神醒腦等作用[3]。田徽等[4]研究發(fā)現(xiàn)，艾片能顯著改善生理和病理狀態(tài)下的腦缺血缺氧從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，可能是其具有“提神醒腦”作用的藥效學(xué)基礎(chǔ)。龍腦能夠迅速透過血腦屏障，分布于腦組織中，改善血腦屏障緊密連接的破壞，能夠抵抗自由基對腦組織的損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，L-龍腦具有顯著的抗小鼠心肌與腦缺血缺氧的作用[5-6]。

L-龍腦屬于雙環(huán)單萜化合物，在高等植物中，萜類生物合成途徑是生物體內(nèi)主要的代謝途徑之一，由該途徑產(chǎn)生的萜類化合物（Terpenoid）數(shù)量龐大，目前已鑒定出的萜類化合物多達(dá)20 000余種，占天然產(chǎn)物總數(shù)的25%～50%，半數(shù)以上的萜類化合物是在植物中被發(fā)現(xiàn)的，對植物的生長、發(fā)育以及植物與生態(tài)環(huán)境之間的聯(lián)系起著極其重要的作用。萜類化合物是由異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建的一類化合物， 異戊烯焦磷酸（IPP）與其異構(gòu)體（DMAPP）被稱為“活性異戊二烯”，是萜類合成真正的前體，牻牛兒基焦磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase， GPPS）催化1分子的IPP與DMAPP形成牻牛兒基焦磷酸（GPP），為單萜合成提供碳骨架[7-13]。

目前已從多種植物中克隆得到GPPS基因，高等植物不同物種之間的GPPS在氨基酸序列具有較高的相似性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明，不同物種間的GPPS具有保守的結(jié)構(gòu)域[14-16]。艾納香在化學(xué)成分、藥理、藥效等方面研究較多，并取得顯著成果。然而關(guān)于艾納香在分子生物學(xué)方面的研究尚未起步，本研究通過對艾納香BbGPPS基因的克隆和信息學(xué)分析，有望從分子水平揭示艾納香活性成分代謝途徑和調(diào)控機(jī)制，為提高艾納香活性成分的含量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 艾納香（Blumea balsamifera L. DC）栽培于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所南藥種質(zhì)資源圃，試驗材料為艾納香長勢良好的花和葉。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、載體連接試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal、多功能DNA純化回收試劑盒均購自廣州飛揚生物工程有限公司。引物合成與測序均由上海美吉（Majorbio）生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及BbGPPS全長cDNA的克隆

按照Plant RNA Kit試劑盒說明書，提取艾納香葉片的總RNA，采用RT-PCR合成cDNA第一鏈。通過從本課題組前期對艾納香花和葉片轉(zhuǎn)錄組的信息，挖掘艾納香中GPPS相關(guān)基因的序列片段，設(shè)計特異引物擴(kuò)增cDNA。正向引物Pf：5′-TCCGATAGATACCCCTCA-3′、反向引物Pr：5′-CATCACTACTCACCCAACTC-3′，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)總體積為50 μL，1.5 mmol/L MgCl2，4種dNTP各200 μmol/L，引物各150 ng，1.5 U Taq plus DNA polymerase（高保真），100 ng cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。并進(jìn)行克隆、測序及序列分析。

1.2.2 BbGPPS基因的測序與分析 BbGPPS PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化，純化后將其連接到pEASY-Blunt cloning vector載體上，轉(zhuǎn)化E. coli Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于添加氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取陽性克隆，使用M13 Pf/Pr引物，經(jīng)PCR檢測后擴(kuò)菌培養(yǎng)，再送樣進(jìn)行測序，獲得重組載體pEASY-Blunt-BbGPPS。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNAMAN軟件分析BbGPPS基因的cDNA序列，找到對應(yīng)的開放閱讀框（ORF）以及對應(yīng)編碼的氨基酸序列；利用DNAMAN軟件的多序列比對功能，將BbGPPS氨基酸序列與NCBI中BLAST檢索到的高同源性序列進(jìn)行比對，對保守區(qū)域進(jìn)行考察；使用BioEdit等軟件對BbGPPS氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并使用Swiss-model工具對BbGPPS的三維結(jié)構(gòu)在線進(jìn)行預(yù)測；最后利用Mega5.0將BbGPPS氨基酸序列與從NCBI中進(jìn)行BLAST比對搜索得到的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BbGPPS cDNA序列分析

本研究從艾納香葉片中克隆得到BbGPPS基因的cDNA序列全長。提取的RNA以及擴(kuò)增的序列片段如圖1所示，本研究在約1 600 bp處，出現(xiàn)單一的目的條帶。該基因全長1 692 bp，開放閱讀框（ORF）在cDNA序列上的區(qū)域為第219～1 302個核苷酸，ORF全長1 083 bp，堿基序列如圖2所示。

2.2 BbGPPS氨基酸序列分析

通過BbGPPS cDNA序列預(yù)測得到其編碼的氨基酸序列，結(jié)果顯示BbGPPS肽鏈包含有361個氨基酸殘基，分子量為39.130 ku，等電點（pI）為5.83（圖3）。氨基酸的種類分布如圖4所示，該肽鏈總共含有19種氨基酸，不含色氨酸。含量最多的氨基酸種類為亮氨酸和丙氨酸，而半胱氨酸、組氨酸以及酪氨酸的含量則相對較少?？傮w而言，極性氨基酸的含量相對較高。

2.3 BbGPPS跨膜區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位分析

使用TMHMM預(yù)測BbGPPS的跨膜區(qū)域，分析結(jié)果表明，BbGPPS無跨膜區(qū)，屬于膜外在蛋白；利用ExPASy SignalP4.0Serve分析BbGPPS蛋白，并沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌蛋白；用WoLFPSORT工具對BbGPPS進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明，BbGPPS最可能定位于葉綠體，定位系數(shù)為8（chlo： 8）（圖5）。

2.4 BbGPPS疏水性分析

使用BioEdit軟件對BbGPPS進(jìn)行疏水性分析，分析結(jié)果表明，BbGPPS親水性略大于疏水性，BbGPPS屬于親水蛋白。在第50～60個氨基酸殘基之間，有一個強(qiáng)親水區(qū)域，大約在第165個氨基酸殘基處，還有一個親水性較強(qiáng)的區(qū)域（圖6）。

2.5 BbGPPS序列比對

使用NCBI的BLAST工具，將BbGPPS序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對搜索。BbGPPS在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比對上不同物種的37條蛋白質(zhì)序列，其中BbGPPS與萬壽菊GPPS（TeGPPS）序列相似性最高，達(dá)到84%。利用DNAMAN將BbGPPS氨基酸序列與從NCBI中挑選的部分同源性較高的已知序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果表明BbGPPS蛋白與其他植物中GPPS蛋白具有高度的同源性，且具有異戊烯基結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步表明BbGPPS為異戊烯基合酶超家族成員（圖7）。根據(jù)王彩云等[16]對滇龍膽GPPS的預(yù)測分析結(jié)果，GPPS基因具有的保守結(jié)構(gòu)域主要是聚丙烯合成酶（Polyprenylsynthetase）多位于 105～354位、286～298位和153～169位；萜類合成酶（Terpenoid synthase）多位于75～366位和77～363位；聚丙烯相關(guān)合成酶（Polyprenyl synthetase-related）多位于61～365位。

2.6 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和三維建模

利用SSpro 4.0（http：//download.igb.uci.edu/sspro4.html）對BbGPPS進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占61.8%，β-折疊（E）占1.7%，無規(guī)則卷曲（C）占36.5%。

使用Swiss-model工具對BbGPPS的三維結(jié)構(gòu)在線進(jìn)行預(yù)測（圖8）。從圖8可以看到，BbGPPS的三維結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，其次是無規(guī)則卷曲。β-折疊只占有很少的一部分，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相吻合。分析結(jié)果表明，BbGPPS屬于α-螺旋型蛋白。其三維結(jié)構(gòu)的“口袋”區(qū)域，可能是BbGPPS起催化作用的活性中心所在。

2.7 BbGPPS與其他物種GPPS間系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Mega5.0將BbGPPS氨基酸序列與從NCBI中BLAST比對搜索得到的序列（表1）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，由結(jié)果可知位于系統(tǒng)發(fā)育樹最下方的川桑（Morus notabilis， MnGPPS）、蘋果（Malus domestica， MdGPPS）、杜仲（Eucommia ulmoides， EuGPPS）、金魚草（Antirrhinum majus， AmGPPS）、野甘草（Scoparia dulcis， SdGPPS）成為一個獨立的初級分支Ⅰ，表明這一個分支的物種與其余物種之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；在初級分支Ⅱ下，可細(xì)分出兩個大的次級分支，艾納香（Blumea balsamifera， BbGPPS）、萬壽菊（Tagetes erecta， TeGPPS）、案頭菊（Chrysanthemum x morifolium， CxmGPPS）、野菊（Chrysanthemum boreale， CbGPPS）、甜菊（Stevia rebaudiana， SrGPPS）同屬于菊科植物，均位于一個大的次級分支上，其中艾納香與萬壽菊、甜菊位于同一條多級進(jìn)化分支上，表明其親緣關(guān)系較近（圖9），這與形態(tài)學(xué)植物分類結(jié)果相似，表明GPPS基因可為植物分類方面的分析或研究提供一定的佐證。

3 討論與結(jié)論

本研究基于艾納香花和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，根據(jù)挖掘到的GPPS基因的序列片段，設(shè)計特異性引物從艾納香總RNA中擴(kuò)增BbGPPS的全長cDNA序列。將擴(kuò)增得到的cDNA通過克隆、測序驗證，證實擴(kuò)增得到的cDNA序列是正確的。

BbGPPS cDNA全長1 692 bp，編碼的BbGPPS蛋白質(zhì)序列包含361個氨基酸殘基，其中不含有色氨酸。BbGPPS為膜外在蛋白，定位在葉綠體發(fā)揮其生物功能，不含有信號肽序列，表明BbGPPS為非分泌蛋白，疏水性分析表明BbGPPS為親水性蛋白，在氨基酸序列中具有兩個較強(qiáng)的親水區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育分析證明，艾納香與萬壽菊等其余4種菊科植物親緣關(guān)系較近，BbGPPS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與艾納香已有的種屬分類相一致，進(jìn)一步說明本次分析的結(jié)果是具有較高真實性和可信度的。

GPPS屬于蛋白超家族，在高等植物不同物種之間具有較高的保守性。高等植物不同物種GPPS研究已有較多的文獻(xiàn)報道，不論是GPPS cDNA序列長度或是編碼的GPPS氨基酸個數(shù)都有較大的相似性。GPPS基因具有的保守結(jié)構(gòu)域主要是聚丙烯合成酶（Polyprenylsynthetase）；萜類合成酶（Terpenoid synthase）；聚丙烯相關(guān)合成酶（Polyprenyl synthetase-related）。使用DNAMAN軟件，將艾納香BbGPPS與同源性較高的多條序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)BbGPPS氨基酸序列存在多個保守結(jié)構(gòu)域，與前人對其他物種的GPPS氨基酸序列研究成果相一致，證明BbGPPS同屬于GPPS蛋白超家族中的一員。于盱等[15]研究發(fā)現(xiàn)，薄荷GPPS大亞基cDNA序列ORF全長1 131 bp，編碼377個氨基酸，GPPS小亞基cDNA序列ORF全長942 bp，編碼313個氨基酸；王彩云等[16]研究發(fā)現(xiàn)，龍膽GPPS cDNA全長1 107 bp，編碼369個氨基酸。本次cDNA測序結(jié)果、BbGPPS氨基酸序列預(yù)測結(jié)果與前人對其他物種GPPS的序列分析結(jié)果相似，進(jìn)一步證明本次克隆的BbGPPS也是異戊烯基合酶超家族成員。

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