王 丹，藍惠萍，張影波，胡 璇，陳曉鷺，陳振夏，龐玉新，于福來

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571101；2. 廣東藥科大學中藥資源學院，廣東 云浮 527500）

0 引言

【研究意義】艾納香為菊科艾納香屬植物艾納香Blumeabalsamifera（L.）DC.的 葉 及 嫩 枝，貴 州省、云南省和海南省是其主產(chǎn)區(qū)。艾納香有祛風除濕、溫中止瀉、活血解毒等功效[1?2]?！吨袊幍洹芬?guī)定艾納香是提取天然冰片（艾片）的唯一來源，主要有效成分為單萜類成分l-龍腦[3]，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，l-龍腦具有抗炎、抗氧化、抗輻射、鎮(zhèn)痛、促進藥物吸收、促進燙傷皮膚恢復、提神醒腦等作用[4?5]，因此，被廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品等領域。鎂元素是植物所必需的營養(yǎng)元素之一，在植物的生理生化過程中起到非常重要的作用。鎂素具有影響植物光合生理過程、調(diào)節(jié)酶活化功能、影響活性氧代謝、碳氮代謝以及植物基因表達等作用[6?7]，并且鎂可以顯著提高藥用植物藥材產(chǎn)量以及促進藥材有效成分的積累[8]。王丹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在海南冬季，外源施加鎂可以顯著增加艾納香葉片生物量，對艾納香有效成分l-龍腦百分含量增加無顯著促進作用，但顯著促進了艾納香l-龍腦單株產(chǎn)量的積累。以此為基礎，本文深入研究不同濃度鎂對生長期艾納香藥材產(chǎn)量和內(nèi)源激素以及l(fā)-龍腦積累變化的影響，確定最適宜的施鎂濃度，為實際栽培生產(chǎn)中艾納香施鎂提供數(shù)據(jù)支持和科學指導，以生產(chǎn)出高產(chǎn)、高質(zhì)的艾納香藥材?！厩叭搜芯窟M展】研究學者發(fā)現(xiàn)，施肥可以顯著提高艾納香藥材產(chǎn)量。何元農(nóng)等[10?11]證實3種農(nóng)家肥、3種一元化肥、復合肥和單獨施用氮肥均對艾納香的產(chǎn)量和有效成分的積累有顯著促進作用。王丹等[9,12,13]研究發(fā)現(xiàn)，在海南冬季，此時艾納香生長進入遲緩期，此時施用鈣、鎂、錳以及植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸、赤霉素和DA-6均有益于艾納香生長發(fā)育，促進艾納香葉、莖和根生物量的增加以及有效成分l-龍腦單株產(chǎn)量的積累。藍惠萍等[14]發(fā)現(xiàn)氮、磷、鉀配施可以顯著促進艾納香藥材產(chǎn)量和有效成分l-龍腦相對含量的積累，對產(chǎn)量積累影響作用依次為氮＞鉀＞磷。王丹等[2]證實10.0 mg·mL?1鎂處理對2年生艾納香藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的提高效果最好，1年生艾納香苗在生長期施加鎂可以促進艾納香生長，提高葉片生物量，顯著促進磷、鉀和鎂元素積累，抑制鈣和鐵的吸收，對氮元素影響不顯著，15.0 mg·mL?1鎂素處理組錳、鋅和銅含量最低[15]。【本研究切入點】鎂對生長期的艾納香苗藥材產(chǎn)量以及內(nèi)源激素含量和l-龍腦積累變化的影響研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗以1年生艾納香為試驗材料，研究不同施鎂水平對艾納香藥材產(chǎn)量和艾納香葉片中內(nèi)源激素赤霉素（GA3）、生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZR）含量的影響變化，以及有效成分l-龍腦百分含量和l-龍腦單株產(chǎn)量的變化情況，以期為合理施肥，提高艾納香藥材產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年7月9日，選擇長勢一致的艾納香種子苗（經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所于福來副研究員鑒定為艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.）為試驗材料，采用水培的方式，基質(zhì)為珍珠巖，以Hoagland營養(yǎng)液為艾納香提供營養(yǎng)成分。Hoagland營養(yǎng)液中各組分的質(zhì)量濃度分別為：KH2PO4136 mg·L?1、H3BO32.86 mg·L?1、CuSO4·5H2O 0.08 mg·L?1、ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L?1、Na2MoO4﹒2H2O 0.52 mg·L?1、MnSO4·H2O 1.81 mg·L?1、Fe-EDTA 2.5 mg·L?1、KNO3510 mg·L?1、Ca（NO3）2945 mg·L?1。每天補充1次水分，每隔7 d補充1次營養(yǎng)液。分別

于當年8月15日和9月1日進行葉面噴施鎂，以MgSO4·7H2O提供鎂素，共設置3個質(zhì)量濃度為1.5、15.0、150.0 mg·mL?1，以 不 含 鎂 的 營 養(yǎng) 液 為 對 照（CK），處理120 d，每30 d取樣1次，共取樣4次。測定艾納香藥材產(chǎn)量以及藥材有效成分l-龍腦百分含量和l-龍腦單株產(chǎn)量，以及艾納香葉片中內(nèi)源激素GA3、IAA、ABA、ZR含量。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥材產(chǎn)量的測定 取艾納香的嫩枝和葉片，陰干后用電子秤測量其藥材產(chǎn)量。

1.2.2 l-龍腦百分含量測定 采用氣相色譜法（GC）測定艾納香中l(wèi)-龍腦百分含量[2]。取艾納香葉，精密稱量3.000 g置于50 mL具塞試管中，加入乙酸乙酯24 mL，封口，超聲處理40 min，靜置并抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至25 mL，搖勻，精密移取2.0 mL到10 mL容量瓶中，水楊酸甲酯作為內(nèi)標液，加入1.0 mL，然后加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。使用HP-5石英毛細管色譜柱（0.32 mm×30 m，0.25 μm），起始溫度50 ℃，保持2 min，先以5 ℃·min?1升溫至100 ℃，然后以20 ℃·min?1升溫至200 ℃，保持3 min；進樣口溫度220 ℃；檢測器溫度240 ℃；進樣量為0.6 μL，不分流。

1.2.3 l-龍腦單株產(chǎn)量的計算 將l-龍腦百分含量與艾納香單株藥材產(chǎn)量相乘，得l-龍腦單株產(chǎn)量。

1.2.4 4種內(nèi)源激素含量測定 取相同部位的艾納香成熟葉片，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定GA3、IAA、ABA、ZT含量。試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)大學作物化學控制研究室。樣品處理方法：取艾納香葉片1.0 g于液氮中速凍，用80%甲醇溶液（含二叔丁基對甲苯酚(BHT) 1 mol·L?1）勻漿，4 ℃提取8 h，離心率為4 000 r·min?1離心15 min沉淀，再用80%甲醇重復提取3次，合并上清液，采用C-18固相萃取柱法去掉艾納香葉片葉綠素，氮氣吹干，PBSTG溶解定容，用于酶聯(lián)免疫檢測儀測定[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel進行數(shù)據(jù)錄入、整理及圖表的繪制，采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計和分析，用One-way ANOVA進行方差分析，并用Duncan檢驗法進行多重比較分析。

2.1 鎂對艾納香葉片內(nèi)源激素GA3含量的影響

由圖1可知，在處理第30 d和第90 d，與CK相比，其他3個施鎂水平對艾納香中GA3含量增加均有顯著的促進作用（P＜0.05）。在處理第30 d，與CK相比，1.5、15.0 和150.0 mg·mL?1鎂處理GA3分別顯著增加了31.82%、36.36%和42.71%。在處理第60 d和第120 d，各處理間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 1 不同施鎂水平對艾納香中赤霉素含量的影響Fig. 1 Effect of Mg applications on GA3 content of B. balsamifera

2.2 鎂對艾納香葉片內(nèi)源激素IAA含量的影響

由圖2可知，在整個處理過程中，鎂元素極顯著的增加了艾納香中IAA含量（P＜0.01）。在處理第30 d，與CK和1.5 mg·mL?1鎂水平相比，15.0 、150.0 mg·mL?1施鎂水平極顯著增加了IAA含量，分別是CK和1.5 mg·mL?1鎂處理組的2.56倍、1.45倍和2.40倍、1.36倍，1.5 mg·mL?1鎂處理組是0.0 mg·mL?1鎂處理組IAA含量的1.77倍（P＜0.01）。

2.3 鎂對艾納香葉片內(nèi)源激素ABA含量的影響

由圖3可知，在處理的第30 d、60 d和第90 d，鎂顯著的增加了艾納香中ABA含量（P＜0.05）。在處理第30 d，與CK和1.5 mg·mL?1鎂水平相比，15.0 mg·mL?1和150.0 mg·mL?1施鎂水平極顯著增加了ABA含量，分別是CK和1.5 mg·mL?1鎂處理的1.4倍、1.25倍和1.32倍、1.18倍，1.5 mg·mL?1鎂處理是CK組ABA含量的1.12倍（P＜0.01）。在處理第120 d，各處理間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 2 不同施鎂水平對艾納香中生長激素含量的影響Fig. 2 Effect of Mg applications on IAA content of B. balsamifera

圖 3 不同施鎂水平對艾納香中脫落酸含量的影響Fig. 3 Effect of Mg applications on ABA content of B. balsamifera

2.4 鎂對艾納香葉片內(nèi)源激素ZR含量的影響

由圖4可知，在處理的第30 d、60 d和第90 d，鎂顯著增加了艾納香中ZR含量（P＜0.05）。在處理第30 d，與CK和1.5 mg·mL?1鎂水平相比，15.0 mg·mL?1和150.0 mg·mL?1施鎂水平極顯著增加了ZR含量，分別是CK和1.5 mg·mL?1鎂處理組的2.46倍、1.39倍和2.42倍、1.37倍，1.5 mg·mL?1鎂處理組是CK處理組ZR含量的1.76倍（P＜0.01）。在處理第120 d，各處理間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 鎂對艾納香藥材產(chǎn)量的影響

由圖5可知，在艾納香的生長期中，隨著時間的延長，不同施鎂水平下艾納香藥材產(chǎn)量整體呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。在處理第30 d，各處理間藥材產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05），1.5 mg·mL?1和15.0 mg·mL?1鎂處理組藥材產(chǎn)量顯著高于CK組，分別增加了25.49%和25.08%。在處理第60 d和第90 d，各處理間藥材產(chǎn)量差異極顯著（P＜0.01）。15.0 mg·mL?1鎂處理組藥材產(chǎn)量最高，顯著高于其他3個處理組。

2.6 鎂對艾納香l-龍腦百分含量的影響

由圖6可知，在艾納香生長期，隨著時間的延長，不同施鎂水平下艾納香有效成分l-龍腦含量整體表現(xiàn)為先升高再下降。根據(jù)方差分析結(jié)果表明，在處理第60 d和第90 d，各處理間差異極顯著（P＜0.01）。在處理第60 d，CK組l-龍腦百分含量最低，較1.5、15.0 和150.0 mg·mL?1鎂處理組分別顯著降低了34.37%、35.48%和25.00%。然而，在處理第90 d，1.5 mg·mL?1鎂處理組l-龍腦百分含量顯著高于其他處理組。在處理第30 d和第120 d，各處理間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 4 不同施鎂水平對艾納香中玉米素含量的影響Fig. 4 Effect of Mg applications on ZT content of B. balsamifera

圖 5 不同施鎂水平對艾納香藥材產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of Mg applications on medicinal material yield of B. balsamifera

圖 6 不同施鎂水平對艾納香中l(wèi)-龍腦百分含量的影響Fig. 6 Effect of Mg applications on l-borneol content of B. balsamifera

2.7 鎂對艾納香l-龍腦單株產(chǎn)量的影響

由圖7可知，在艾納香生長期，隨著時間的延長，不同施鎂水平下艾納香中l(wèi)-龍腦單株產(chǎn)量表現(xiàn)為逐漸上升。根據(jù)方差分析結(jié)果表明，各處理間差異極顯著（P＜0.01）。在處理第30 d、60 d和第120 d，與CK相比，其他3個施鎂水平均顯著提高了l-龍腦單株產(chǎn)量。在處理第90 d，1.5 mg·mL?1和15.0 mg·mL?1鎂處理組l-龍腦單株產(chǎn)量顯著高于0.0 mg·mL?1和150.0 mg·mL?1鎂處理組，分別增加了41.44%、25.00%和44.96%、28.12%。

圖 7 不同施鎂水平對艾納香中l(wèi)-龍腦單株產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of Mg applications on per plant l-borneol yield of B. balsamifera

3 討論與結(jié)論

3.1 鎂對艾納香內(nèi)源激素積累和產(chǎn)量的影響

內(nèi)源激素對植物生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)形成具有重要的調(diào)控作用。在植物生長發(fā)育的不同階段都需要植物激素的參與調(diào)控，例如種子萌發(fā)、營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和運輸、果實發(fā)育成熟、植物衰老等不同階段，氮等營養(yǎng)元素的施用可以對植物內(nèi)源激素的代謝和平衡起到調(diào)節(jié)和促進的作用[17?19]。但是有關(guān)施鎂對植物內(nèi)源激素的影響相關(guān)報道較少。周開兵等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在妃子笑荔枝果實生長發(fā)育中，施鎂對IAA和Eth含量無明顯的增加作用，但是顯著增加了GA3、ABA含量以及ABA/GA3含量比。PeyamiBattal[21]研究發(fā)現(xiàn)，較對照組相比，過量氮、磷和鎂處理的營養(yǎng)期玉米根、莖和葉中GA3含量增加了6%～27%，在開花期，GA3沒有顯著的增加，反而下降了8%～35%。Rehman H U，et al[22]證實玉米籽粒提取物（MGE）結(jié)合葉面噴施鎂可以促進Hysun-336向日葵雜種中氮、磷、鉀、鎂吸收以及增加內(nèi)源性植物激素IAA、GA3和玉米蛋白含量。本文研究結(jié)果證實，在艾納香生長期，對艾納香葉片噴施不同水平的鎂，可以顯著增加艾納香葉片中內(nèi)源激素GA3、IAA、ABA和ZT含量，與上述的研究結(jié)果一致，說明適量的施鎂能促進與艾納香葉片產(chǎn)量形成密切相關(guān)的內(nèi)源激素含量的增加，進而顯著提高艾納香藥材產(chǎn)量。這從內(nèi)源激素生理角度闡述了適宜的鎂處理能提高艾納香藥材產(chǎn)量的原因。

另一方面，由于鎂是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，施鎂有利于植物葉綠素的形成和轉(zhuǎn)化，鎂素還可以參與植物光合作用，調(diào)節(jié)植物碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)的合成和積累[23?25]，可以更好地為植物提供良好的物質(zhì)基礎，以促進植物生長和發(fā)育[26]。這也佐證了本文研究結(jié)果，證實鎂可以顯著提高生長期艾納香藥材產(chǎn)量。在海南，艾納香的生長期較長，從8月至11月生長都比較旺盛，11月到12月為采收期，此時的產(chǎn)量和質(zhì)量均較高。以上結(jié)果與王丹等[9]在海南冬季外源施鎂在艾納香上的效果一致。這說明艾納香生長的任何時期都需要鎂素，促進生長發(fā)育，提高藥材產(chǎn)量。目前，已有眾多研究證實，施加鎂可以促進太子參、檳榔等生長發(fā)育，提高產(chǎn)量[26?28]。

3.2 鎂對艾納香中l(wèi)-龍腦積累的影響

次生代謝是植物生命活動過程中重要的過程，可以通過生物因素和非生物因素的誘導促進其大量形成。l-龍腦是艾納香主要的萜類次生代謝產(chǎn)物，也是艾納香重要的藥用活性成分，提高l-龍腦含量對于艾納香的藥用價值和功效作用有著重要的意義[29]。鎂不僅可以影響植物內(nèi)源激素的變化和植物生長，而且對植物體內(nèi)化學成分積累等次生代謝也有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，不同施鎂水平可以不同程度的提高艾納香中l(wèi)-龍腦百分含量和單株產(chǎn)量，尤其是1.5和15.0 mg·mL?1鎂效果最好。這主要可能由于l-龍腦為單萜類化合物，其催化合成的第一個關(guān)鍵酶為單萜合酶，控制著異戊二烯轉(zhuǎn)化為單萜化合物[2,30]。單萜合酶以單體或同型二聚體的形式催化反應。每個單體C端活性位點的天冬氨酸保守區(qū)DDxxD首先與一個二價金屬陽離子（Mg2+）結(jié)合，然后與氫鍵絡合形成H2O-Mg2+復合物和H2O形成基本空間結(jié)構(gòu)，后續(xù)的焦磷酸基團（diphosphate，PPi）可以與Mg2+絡合，誘導活性位點的α螺旋規(guī)則排列進行催化，并使香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）離子化，才能發(fā)生異構(gòu)、重排和環(huán)化反應[31?34]。由此可見鎂主要通過影響單萜合酶在l-龍腦生物合成過程中的構(gòu)成和催化活性，調(diào)控l-龍腦的次生代謝過程，最終影響l-龍腦的形成和積累。