吳紹華 郝澤蕓 張世鑫 鄧小敏 田維敏

摘 要 DELLA是赤霉素信號傳導途徑中一類重要的阻遏蛋白。本研究通過RT-PCR技術，從橡膠樹優(yōu)良品種‘熱研7-33-97膠乳中克隆了1個DELLA蛋白編碼基因（GenBank登錄號為KT696440）。該基因全長cDNA序列2 135 bp，閱讀框1 905 bp，編碼634個氨基酸，其編碼蛋白含有DELLA和GRAS結構域，分子量為69.89 ku，理論等電點為5.50。HbGAIP-B氨基酸序列與麻瘋樹JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、擬南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分別為82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。進化樹分析表明，HbGAIP-B與JcGAIP-B親緣關系最近。定量PCR分析表明，HbGAIP-B的表達受割膠處理誘導下調。赤霉素和乙烯利處理4 h顯著上調HbGAIP-B的表達，茉莉酸甲酯處理4 h小幅下調HbGAIP-B表達。

關鍵詞 巴西橡膠樹；HbGAIP-B；基因克??；基因表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract DELLA are kind of repressor proteins of GA signaling. In this work，a full length cDNA sequence of HbGAIP-B（GenBank accession no. KT696440）was obtained from the latex of rubber tree clone‘CATAS7-33-97by RT-PCR. HbGAIP-B was 2 135 base pairs（bp）in length and contained an open reading frame（ORF）of 1 642 bp. The ORF encoded 613 amino acid residues， which contained DELLA and GRAS domain， with a predicted molecular mass of 66.476 ku and a pI of 5.19. The deduced amino acid sequences of HbGAIP-B showed high identities of 82.43%， 78.18%， 65.05%， 61.73%， 52.28%， 53.51% and 49.92% to JcGAIP-B， RcGAIP-B， AtRGA， AtGAI， AtRGL1， AtRGL2 and AtRGL3， respectively. Real-time quantitative PCR analysis in the latex showed that， compared with the control， HbGAIP-B transcript levels were significantly down-regulated in latex by consecutive tapping. The transcript levels were significantly up-regulated at 4 hours by gibberellins and ethephon. And methyl jasmonate reduced slightly the expression of HbGAIP-B.

Key words Hevea brasiliensis； HbGAIP-B； Gene clone； Gene expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.006

赤霉素（Gibberellins 或 Gibberellic acid，GA）是一種四環(huán)雙萜類植物激素，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫中起著重要的調控作用。GID1（GIBBERELLIN

INSENSITIVE DWARF 1）和DELLA蛋白是GA信號轉導途徑的兩個重要組分。其中GIDl是GA的受體[1-2]，DELLA蛋白是GA 信號通路中關鍵的負調節(jié)因子[3-5]。GA通過與GID1、DELLA蛋白相互作用形成GA-GID1-DELLA復合體，使得DELLA蛋白被26S泛素蛋白酶體降解[6-8]，解除了DELLA蛋白的阻遏作用，從而啟動了下游基因的表達。DELLA蛋白屬于轉錄因子GRAS（GAI，RGA，SCR）家族，在C端有保守的GRAS結構域，在N端有特異的DELLA結構域。目前，在擬南芥中鑒定了5個DELLA蛋白：GA INSENSITIVE（GAI）：REPRESSOR OF ga1-3 （RGA）：REPRESSOR OF ga7-i-LIKE protein（RGL）l，RGL2和RGL3，遺傳分析表明，這5個蛋白在調節(jié)植物發(fā)育中的功能既有冗余性也有各自獨特的作用[3-4，9-11]。而且，DELLA蛋白在赤霉素、茉莉酸和乙烯三種植物激素介導的信號途徑的交互作用中起著重要的作用[12]。

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是一種多年生木本熱帶經濟作物，通過割膠方式獲得的膠乳是提煉天然橡膠的原料，在保障國民和戰(zhàn)略需求中起著重要的作用。現(xiàn)有的證據表明，膠乳中的橡膠烴是一種重要的防御應答誘導的次生代謝產物[13]，可能主要受乙烯和茉莉酸信號途徑的調控[13-21]。由于DELLA蛋白在乙烯和茉莉酸信號途徑中的重要調控作用。為了進一步研究膠乳中DELLA蛋白的作用機制，本研究從乳管細胞中克隆了一個DELLA蛋白基因HbGAIP-B的全長cDNA，并分析了其在割膠、赤霉素、乙烯利（Ethephon，ET）和茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）處理下的基因表達模式，為深入研究HbGAIP-B基因在膠乳中的作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料橡膠樹‘熱研7-33-97（CATAS 7-33-97）由“國家農作物種質資源平臺-國家橡膠樹種質資源子平臺”提供。割膠處理時，按照1/2螺旋割線，3 d/刀（S/2 d/3）的割制對樹圍一致的8年生未開割樹進行連續(xù)割膠處理，分別采集前3刀的膠乳于RNA提取液中，每處理5棵樹。植物激素赤霉素（gibberellic acid，GA）、乙烯利（Ethephon，ET）及茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）的處理采用的是1年生的萌條，輕輕刮傷萌條第三伸長單位的節(jié)間樹皮，然后分別用100 μmol/L GA3、0.5% ET和0.07% MeJA涂抹刮傷部位后包裹，100 μmol/L GA3和0.5% ET的對照為滅菌水（ddH2O），0.07% MeJA處理的對照為6%的乙醇，分別于處理后的4 h、8 h、1 d、2 d和3 d用刀片割開樹皮取膠乳，每個時間點處理9根萌條，將混合的膠乳采集于RNA提取液中用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 采用RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）提取橡膠樹的膠乳RNA，DNaseⅠ柱上消化RNA樣品中殘留的微量DNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher）逆轉錄合成cDNA。

1.2.2 HbGAIP-B基因的全長cDNA擴增 從巴西橡膠樹膠乳轉錄組數據庫中獲得了一段注釋為DELLA蛋白的Unigene序列，序列分析顯示該Unigene具有完整的編碼框。因此，根據Unigene序列設計該基因的全長cDNA的擴增引物FL-CDNA-F（5′-CCTTACCCATTCGCAGCAG-3′）和FL-CDNA-R（5′-ACCCATTACCAGCTCAGC-3′）對基因序列進行驗證，擴增體系為Takara PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，F(xiàn)L-CDNA-F（10 μmol/L）2.5 μL，F(xiàn)L-CDNA-R（10 μmol/L）2.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水補足50 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN）純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（TransGen），委托Invitrogen公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 采用ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框（ORF）預測，同時翻譯成蛋白序列。DNAMAN軟件對氨基酸進行同源比對分析。ProtParam軟件（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html/）在線分析該蛋白的分子量與等電點。ProtScale軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白親水性。TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白的跨膜結構域分析。SOPMA在線軟件（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）預測蛋白的二級結構。從NCBI數據庫下載不同植物的DELLA蛋白序列，利用軟件MEGA 4.0采用Neighbor-Joining（NJ）模型，并進行1 000次Bootstrap統(tǒng)計學檢驗構建包括HbGAIP-B蛋白序列在內的植物DELLA蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 以橡膠樹HbActin（GenBank HQ260674.1）基因為內參，用real-time RT-PCR分析割膠、GA、ET和MeJA處理對HbGAIP-B基因表達的影響。內參基因引物為Actin-F（5′-G

ATTCCGTTGCCCAGAAGTC-3′）和Actin-R（5′-CACC

ACTCAGCACAATGTTACC-3′）；HbGAIP-B定量引物為GAIP-B-F（5′-ACTCGTTCTCAACTCAGGCA-3′）和GAIP-B-R（5′-ACCAGCTCAGCAATTCACAT-3′）。

反應體系：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）5 μL和10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，ddH2O補足10 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；循環(huán)完成后進行溶解曲線分析。利用CFX manager 3.0軟件，以HbActin作為內參基因，采用2-ΔΔCq算法分析基因的相對表達量。

1.3 數據處理

采用one-way ANOVA（Newman-Keuls Multiple Comparison Test）比較割膠處理3個刀次樣品間基因表達量的差異顯著性（p<0.05）；采用one-way ANOVA（Dunnett's Multiple Comparison Test）比較GA、ET和MeJA處理與對照樣品間相對表達量的差異顯著性，p<0.05和p<0.01分別表示每個時間點處理與對照之間在0.05和0.01水平存在的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 HbGAIP-B基因全長cDNA的克隆及生物信息學分析

通過全長cDNA序列的擴增測序，獲得HbGAIP-B基因全長cDNA序列2 135 bp，含有1 905 bp閱讀框，編碼634個氨基酸，5′非編碼區(qū)序列（Untranslated region，UTR）長118 bp，3′-UTR長112 bp（圖1）。生物信息學分析結果顯示，HbGAIP-B蛋白的分子式為C3 073H4 793N857O957S26，分子量為69.89 ku，理論等電點為5.50，不穩(wěn)定系數為48.08，為不穩(wěn)定類蛋白，無跨膜結構域，屬于親水性蛋白。結構域分析顯示HbGAIP-B蛋白具有GRAS家族的典型結構域，屬于GRAS轉錄因子家族，N末端同源性不高，但具有GA的信號感知區(qū)的DELLA和TVHYNP酸性結構域，中心區(qū)具有VHVID、核定位區(qū)域NLS，起調節(jié)作用的LZ（亮氨酸重復序列）和PolyS/T/V（絲氨酸 蘇氨酸 纈氨酸富集區(qū)）區(qū)域，C末端具有發(fā)揮阻遏作用的阻遏區(qū)域RVER和SAW（圖2）。二級結構分析顯示HbGAIP-B蛋白由44.79% α-螺旋、15.30%延伸鏈、7.26% β-轉角和32.65%無規(guī)則卷曲組成。

2.2 HbGAIP-B推導的氨基酸序列比對及進化樹構建

將橡膠樹HbGAIP-B氨基酸序列與其它植物DELLA蛋白氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)HbGAIP-B與與麻瘋樹（Jatropha curcas）JcGAIP-B（XP_

012072251.1）、蓖麻（Ricinus communis）RcGAIP-B （XP_002527794.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana） AtRGA（NP_178266.1）、AtGAI（NP_172945.1）、AtRGL1（NP_176809.1）、AtRGL2（AEE73945.1）和AtRGL3（AED92433.1）的相似性分別為82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%（圖2）。構建的進化樹表明，橡膠樹HbGAIP-B氨基酸序列與麻瘋樹JcGAIP-B歸為一類，親緣關系最近（圖3）。

2.3 HbGAIP-B基因表達分析

采用qRT-PCR技術，以HbActin基因為內參，檢測了連續(xù)割膠（Tapping）、赤霉素（GA）、乙烯利（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）對膠乳中的HbGAIP-B基因表達的影響（圖4）。結果表明，HbGAIP-B基因的表達受割膠處理誘導下調，前3刀間的基因表達達顯著水平（圖4-A）。同時，HbGAIP-B基因的表達也受植物激素的調節(jié)，表現(xiàn)為GA處理4 h極顯著上調HbGAIP-B基因表達（圖4-B）；ET處理4 h后顯著上調HbGAIP-B基因的表達量，8 h表達量達到最高（圖4-C）；MeJA處理4 h后顯著下調HbGAIP-B基因的表達，2 d后極顯著上調HbGAIP-B基因的表達（圖4-D）。

3 討論

橡膠樹乳管數量、兩次割膠間的膠乳再生與排膠時間是決定橡膠產量的關鍵因素。乙烯利是廣泛使用的橡膠增產刺激劑，其效應主要是通過提高橡膠樹乳管細胞的基礎代謝和延長膠乳的排膠時間來實現(xiàn)的[22-24]。在乙烯信號響應中，ET通過促進ETHYLENE INSENSITIVE3（EIN3）和EIN3-like（EIL）的積累來促進其下游的級聯(lián)反應。DELLA蛋白能與EIN3結合抑制其功能。施加GA處理，可以引起DELLA蛋白的降解，釋放出EIN3促進乙烯信號的響應[12]。據此推測，施加ET和GA可能具有相似的效應，這與本研究中GA處理和ET處理樣品中HbGAIP-B基因的表達均為先升高后降低的模式是吻合的。而且ET處理HbGAIP-B基因表達模式與RhGAI1相似，在玫瑰花研究中發(fā)現(xiàn)，RhEIN3-3能直接結合RhGAI1基因啟動子進而調控花瓣發(fā)育[25]。另外，DELLA蛋白RGL3可通過競爭性結合JAZ蛋白來增強EIN3的活性[26]。

茉莉酸是調控橡膠生物合成的關鍵因子，目前已發(fā)表的橡膠樹茉莉酸信號途徑的核心組件包括SCF[27]、COI1[28]、JAZs[15，29]、MYCs[17，30]，這些基因的表達受到傷害、割膠或者MeJA的誘導。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥DELLAs可競爭性的阻止阻遏蛋白JAZ與轉錄激活因子MYC2的結合，從而提高MYC2調控其靶基因的能力[31]。Wild等[32]證實MYC2能直接與RGL3啟動子結合，而RGL3也能與JAZ蛋白互作，表明RGL3蛋白對于JA介導的響應是必不可少的。而且擬南芥DELLA蛋白RGA通過結合MYC2抑制次生代謝產物倍半萜烯合成酶基因TPS21和TPS11的表達[33]。本研究中HbGAIP-B基因表達受割膠處理誘導下調，且HbGAIP-B基因的表達也受植物激素的調節(jié)。結合割膠、ET、MeJA處理對HbGAIP-B基因表達的影響，推測HbGAIP-B可能通過茉莉酸或乙烯信號途徑參與橡膠樹的膠乳代謝，具體作用機制還有待于深入的研究。

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