楊家大 任瓊 吳聲榕

摘要：【目的】評(píng)估從江香豬CYP2A19基因的純合度及遺傳變異，為開發(fā)從江香豬藥物代謝模型積累基礎(chǔ)資料?！痉椒ā繎?yīng)用SNaPshot檢測(cè)方法對(duì)141份從江香豬樣本CYP2A19基因編碼區(qū)rs323914689、rs81217981、rs333289891、rs343272409位點(diǎn)及3'端非翻譯區(qū)rs338584662和rs321736682位點(diǎn)進(jìn)行分型分析，并計(jì)算從江香豬種群的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（He）、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)百分比。【結(jié)果】除rs333289891位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)外，其余5個(gè)位點(diǎn)均檢測(cè)到2種或3種基因型，多態(tài)位點(diǎn)百分比為83.33%。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057。【結(jié)論】不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，其藥物代謝特性也因此存在差異。從江香豬群體純合度高、遺傳穩(wěn)定性好、變異程度低，是其作為藥物代謝動(dòng)物模型的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 從江香豬；CYP2A19基因；多態(tài)位點(diǎn)；遺傳學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S828.89 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1209-07

0 引言

【研究意義】從江香豬產(chǎn)于貴州省從江縣，是我國稀有的優(yōu)良地方微型豬種，其個(gè)體矮小，早熟易肥，肉肥而不膩，經(jīng)白水煮熟后味香、湯清甜、肉質(zhì)細(xì)嫩，是制作高檔肉制品的理想材料。同時(shí)，因其體型矮小，解剖學(xué)特性、生理學(xué)生化學(xué)指標(biāo)與人類相似，基因純合，近交不退化，是較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（楊秀江，2002），在藥物評(píng)價(jià)中具有廣闊的應(yīng)用前景。細(xì)胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450 enzymes，CYP）是一類含亞鐵血紅素的超基因家族酶系，參與機(jī)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的I相代謝反應(yīng)，通過氧化方式可將水溶性差的內(nèi)、外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄詮?qiáng)的物質(zhì)，而進(jìn)入II相代謝反應(yīng)，在藥物及異源物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮重要作用（張慧鋒等，2005；華梓婷等，2007；商海濤等，2008）。因此，研究從江香豬細(xì)胞色素氧化酶的基因純合度及催化特性，對(duì)評(píng)估其在藥物代謝動(dòng)物模型中應(yīng)用的可能性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在人體中，CYP1、CYP2、CYP3這3個(gè)家族參與了95%的外源物代謝活動(dòng)（趙春等，2014）。CYP2A6是CYP2A亞家族的主要酶，存在于成人的肝臟中，其含量占人體CYP總蛋白的4%（張小梅等，2011），代謝的藥物占人體CYP代謝藥物總量的3%（于敏等，2013），特征性反應(yīng)為香豆素-7'-羥基化反應(yīng)。CYP2A6還參與黃曲霉素B1、亞硝胺鹽、環(huán)境化合物汽油醚及煙草中尼古丁等結(jié)構(gòu)非相關(guān)前致癌物的激活（蔣卉和陳一岳，2007）。在豬體內(nèi)，早在1985年Kaipainen等就檢測(cè)到高水平的香豆素-7'-羥基化酶活性。1999年，Skaanild和Friis發(fā)現(xiàn)G ttingen小型豬CYP2A活性與Western blotting的蛋白水平相關(guān)，且mRNA水平與CYP2A活性呈弱相關(guān)，據(jù)此推測(cè)小型豬CYP2A表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。此后，Soucek等（2001）對(duì)布爾諾白品種G ttingen小型豬肝臟微粒體的研究表明，G ttingen小型豬具有與人體CYP2A6類似的香豆素-7'-羥基化酶活性，以抗人類CYP2A6抗體進(jìn)行免疫雜交可得到相應(yīng)的條帶，且測(cè)序發(fā)現(xiàn)小型豬肝臟CYP2A蛋白N-末端前20個(gè)氨基酸與人類CYP2A6的相似度達(dá)70%，即小型豬CYP2A具有與人體CYP2A類似的特性。李健等（2006）研究表明，貴州小型香豬肝臟微粒體雖然具有香豆素-7'-羥基化反應(yīng)（CYP2A）活性，但其活性與人體相應(yīng)反應(yīng)的活性存在顯著差異。人體CYP2A選擇性抑制劑——甲氧補(bǔ)骨脂素在低濃度（2.5 μmol/L）下能抑制90%的巴馬香豬香豆素-7'-羥基化反應(yīng)活性（Li et al.，2006）。此外，有研究資料表明，豬體內(nèi)存在人體CYP2A6的同源酶（Zamaratskaia et al.，2009；Liu et al.，2011；Rasmussen et al.，2011；Brunius et al.，2012），且根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫及有關(guān)文獻(xiàn)（Matal et al.，2009a，2009b；楊家大等，2011）判定，該酶為CYP2A19。【本研究切入點(diǎn)】P450基因多態(tài)性是造成不同個(gè)體藥物代謝差異的重要基礎(chǔ)（張慧鋒等，2005），也是制定個(gè)體化用藥方案的重要理論依據(jù)（王一珂等，2016），但至今未見有關(guān)從江香豬CYP2A19基因多態(tài)性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用基于單堿基延伸的SNaPshot檢測(cè)方法分析從江香豬CYP2A19基因單核苷酸多態(tài)性，評(píng)估其基因純合度及遺傳變異，為開發(fā)從江香豬藥物代謝模型積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 從江香豬來源

141頭健康從江香豬分別來自貴州省從江縣宰便、加鳩、加勉、光輝、加榜、剛邊等鄉(xiāng)（鎮(zhèn)），年齡2～3月齡，體重8～11 kg，性別及閹割狀況不限。屠宰后立即剪下一小塊肝臟組織，經(jīng)生理鹽水沖洗血污后置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)各SNP位點(diǎn)上、下游250 bp以內(nèi)的DNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物及延伸反應(yīng)引物（表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，rs343272409位點(diǎn)檢測(cè)的是互補(bǔ)鏈堿基類型。

1. 3 肝臟DNA提取

取5～20 mg肝臟組織樣品，加液氮研磨成粉末，然后按照離心柱型細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司，GK0122）說明進(jìn)行提取，稀釋至5～10 ng/μL用于PCR。

1. 4 多重PCR及擴(kuò)增產(chǎn)物純化

反應(yīng)體系為15.00 μL，包括10×Buffer 1.50 μL，25 mmol/L MgCl2 1.50 μL，10 mmol/L dNTP 0.30 μL，10 μmol/L引物各0.15 μL，基因組DNA 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.30 μL，ddH2O補(bǔ)足至15.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行多重PCR。rs323914689、rs81217981、rs333289891和rs343272409位點(diǎn)在一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增，rs338584662和rs321736682位點(diǎn)在另一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增。

純化體系7.0 μL，其中擴(kuò)增產(chǎn)物3.0 μL、20 U/μL Exonuclease I（Thermo Scientific公司）0.2 μL、1 U/μL FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.8 μL、10×Buffer 0.7 μL。純化程序：37 ℃反應(yīng)15 min，然后80 ℃滅活15 min。

1. 5 多重延伸反應(yīng)及延伸產(chǎn)物純化

延伸反應(yīng)體系6.0 μL，包括純化PCR產(chǎn)物2.0 μL、含不同熒光標(biāo)記ddNTP的SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix（Applied Biosystems公司）1.0 μL、10 μmol/L延伸引物各0.2 μL。反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后向反應(yīng)產(chǎn)物中加入FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase（Thermo Scientific公司）0.2 μL，37 ℃處理15 min，再80 ℃滅活15 min。

1. 6 毛細(xì)管電泳及基因型判讀

取1.0 μL純化延伸產(chǎn)物，加9.0 μL上樣Formamide deionized（Amresco公司），95 ℃變性3 min后立即冰水浴5 min，在ABI 3730XL型DNA序列檢測(cè)儀（Applied Biosystems公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳約1 h。然后以Peak ScannerTM Software v1.0（Applied Biosystems公司）打開毛細(xì)管電泳生成后綴為fsa的文件，再根據(jù)延伸產(chǎn)物片段大小、峰圖顏色、突變位置的核苷酸種類等綜合判定各SNP位點(diǎn)在圖譜中的位置及基因型。峰圖中紅、黑、藍(lán)、綠波峰分別代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T）、胞嘧啶脫氧核苷酸（C）、鳥嘌呤核糖核苷酸（G）和腺嘌呤核糖核苷酸（A）；只有一個(gè)峰為純合子，出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上峰則為雜合子。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算種群的基因型頻率，PopGen 32統(tǒng)計(jì)等位基因頻率、Hardy-Heinberg平衡的χ2和P、有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（He）、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)百分比。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致，且無非特異性擴(kuò)增條帶（圖1），說明PCR產(chǎn)物可用作下一步延伸反應(yīng)的模板。

2. 2 SNP位點(diǎn)的分型峰圖

141份從江香豬樣品CYP2A19基因rs333289891、rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點(diǎn)的延伸反應(yīng)產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI 3730XL型DNA序列檢測(cè)儀毛細(xì)管電泳，并由Peak ScannerTM Software v1.0讀取后，得到各位點(diǎn)的分型圖譜。其中，rs333289891位點(diǎn)僅檢測(cè)到1種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型為CC（圖2）；rs323914689位點(diǎn)檢測(cè)到2種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型分別為CC（圖3-A）和CG（圖3-B）；rs343272409位點(diǎn)檢測(cè)到2種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型分別為AA（圖4-A）和AC（圖4-B）；rs321736682位點(diǎn)檢測(cè)到2種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型分別為CC（圖5-A）和CT（圖5-B）；rs81217981位點(diǎn)檢測(cè)到3種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型分別為AA（圖6-A）、AG（圖6-B）和GG（圖6-C）；rs338584662位點(diǎn)檢測(cè)到3種峰型，對(duì)應(yīng)的基因型分別為CC（圖7-A）、CG（圖7-B）和GG（圖7-C）。

2. 3 群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

在6個(gè)SNP位點(diǎn)中，除rs333289891位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)外，其余5個(gè)位點(diǎn)均檢測(cè)到2種或3種基因型，多態(tài)位點(diǎn)百分比為83.33%。其中，rs323914689位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，共138份，基因型頻率為0.9787；rs343272409位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，共140份，基因型頻率為0.9929；rs321736682位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，共140份，基因型頻率為0.9929；rs81217981位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，共107份，基因型頻率為0.7589；rs338584662位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，共108份，基因型頻率為0.7660。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均處于Hardy- Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的Ne介于1.0071～1.3129，He介于0.0071～0.2057。各位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、Ne、He等群體遺傳學(xué)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

3 討論

CYP多態(tài)性包括酶（表型）多態(tài)性和基因多態(tài)性。其中，表型多態(tài)性可將個(gè)體按代謝速度分為強(qiáng)代謝型、弱代謝型、中等代謝型和超強(qiáng)代謝型（于敏等，2013）；而基因多態(tài)性是導(dǎo)致個(gè)體差異明顯表型多態(tài)性的原因（華梓婷等，2007）。根據(jù)UCSC Genome Browser和NCBI數(shù)據(jù)庫信息可知，豬CYP2A19基因登錄號(hào)為NM_214417，其DNA序列全長(zhǎng)為5387 bp，包含5個(gè)外顯子，共有33個(gè)已知SNP位點(diǎn)，其中4個(gè)位于編碼區(qū)，2個(gè)位于3'端非翻譯區(qū)，其余均位于內(nèi)含子中。在這2個(gè)數(shù)據(jù)庫中，并未登記有CYP2A19基因SNP位點(diǎn)的等位基因頻率，也未見有關(guān)這些等位基因頻率的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用基于單堿基延伸的SNaPshot檢測(cè)方法，參考豬CYP2A19基因編碼區(qū)及3'端非翻譯區(qū)已知的6個(gè)SNP位點(diǎn)信息，對(duì)從江香豬進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，結(jié)果表明，rs333289891位點(diǎn)表現(xiàn)為單態(tài)，而數(shù)據(jù)庫登記該位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)。由于rs333289891位點(diǎn)突變屬于錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)?46R→W，即由精氨酸突變?yōu)樯彼幔叩姆肿哟笮?、極性及電荷性均不一樣。因此，若排除檢測(cè)樣本數(shù)量的原因，可推測(cè)從江香豬CYP2A19基因rs333289891位點(diǎn)具有不同于其他豬種（或品系）的核苷酸，核苷酸組成不同可能導(dǎo)致對(duì)CYP2A19底物代謝能力不同，因此從江香豬與其他豬種間的藥物代謝數(shù)據(jù)不能共享。商海濤等（2008）對(duì)原始種群來源于從江香豬的貴州小型豬CYP3A29編碼區(qū)基因序列進(jìn)行克隆測(cè)序及比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)貴州小型豬CYP3A29編碼區(qū)存在CYP3A29*1C和CYP3A29*1D共2個(gè)SNP位點(diǎn)及1個(gè)缺失89 bp并產(chǎn)生移碼的可變剪接。與巴馬香豬及日本學(xué)者提交NCBI的AB052260序列相比，CYP3A29*1C位點(diǎn)僅存在于貴州小型豬，在巴馬香豬及AB052260序列中均不存在。據(jù)此推測(cè)，豬CYP3A29編碼區(qū)的單核苷酸變異與其遺傳背景相關(guān)，不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，不同品系間的藥物代謝特性也因此存在差異，作為藥物代謝模型予以研究時(shí)就必須考慮序列變異引起的品系代謝特性差異。

從江香豬CYP2A19基因rs323914689、rs343272409、rs321736682、rs81217981和rs338584662位點(diǎn)雖然均具有多態(tài)性，但雜合子頻率非常低，rs323914689、rs343272409 和rs321736682位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)突變型純合子，各多態(tài)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的頻率非常高，2種等位基因的基因頻率差異明顯，說明從江香豬CYP2A19基因純合度高，即驗(yàn)證了其基因純合的優(yōu)良特性。5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的Ne與等位基因?qū)嶋H觀察值間的差值較明顯，表明等位基因在群體中分布不均勻、變異小。此外，從江香豬群體He均低于0.2500，也表明其遺傳變異程度低，遺傳穩(wěn)定性好。在從江香豬產(chǎn)區(qū)多行自繁自養(yǎng)制度，由于長(zhǎng)期高度近親繁殖最終形成了高度純合、近親交配不退化、不變異及性成熟早的優(yōu)良品質(zhì)（申學(xué)林，2005），而這些特性恰好奠定了從江香豬作為藥物代謝動(dòng)物模型的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

不同品系豬種由于遺傳背景差異而具有不同的單核苷酸變異，其藥物代謝特性也因此存在差異。從江香豬群體純合度高、遺傳穩(wěn)定性好、變異程度低，是其作為藥物代謝動(dòng)物模型的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）