王曉曄 石博妹 王英群 劉德玉 李銘 李芳芳 李珣 胡傳活

摘要：【目的】原核表達(dá)Bcl-xL蛋白的突變體PTD-FNK蛋白，為揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡機(jī)制及加快其在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。【方法】根據(jù)FNK蛋白核苷酸序列設(shè)計兩對突變引物，以pET-28a（+）-

PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增兩段突變序列；回收PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行Dpn I消化，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，探索IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的適宜溫度，最后以SDS-PAGE電泳和Western bloting對純化蛋白進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】兩個突變片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為462和5616 bp，經(jīng)Dpn I消化后進(jìn)行重組反應(yīng)，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α能成功構(gòu)建pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒。在30 ℃下以IPTG誘導(dǎo)7 h可獲得可溶性的PTD-FNK蛋白，以NI-NTA Argrose純化后的融合蛋白經(jīng)Western blotting鑒定為PTD-FNK蛋白?！窘Y(jié)論】通過調(diào)控IPTG誘導(dǎo)溫度可成功以可溶性形式表達(dá)出PTD-FNK蛋白，且誘導(dǎo)時間短，無須復(fù)性，有利于蛋白純化及加快其在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： PTD-FNK蛋白；點(diǎn)突變；原核表達(dá)；純化鑒定

中圖分類號： TQ936.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1019-06

0 引言

【研究意義】PTD-FNK蛋白是人工構(gòu)建的抗凋亡蛋白。目前，PTD-FNK蛋白主要通過復(fù)性PTD-FNK蛋白的包涵體獲得（Asoh et al.，2002），但由于包涵體蛋白復(fù)性耗時長、產(chǎn)率低（張颋等，2009），而影響 PTD-FNK蛋白功能的研究與應(yīng)用。因此，如何有效純化獲得大量可溶性PTD-FNK蛋白，對深入研究PTD- FNK蛋白生理功能及加快其在家畜精液保存中的應(yīng)用進(jìn)程具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Bcl-xL蛋白最早是從禽類的互補(bǔ)DNA（cDNA）文庫中篩選獲得，是Bcl-2蛋白家族抗凋亡亞家族的重要成員，發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-x基因通過選擇性剪接產(chǎn)生兩個剪接變體，長mRNA編碼的Bcl-xL蛋白具有抗凋亡作用，而短mRNA編碼的Bcl-xS具有促凋亡作用（Boise et al.，1993）。Bcl-xL蛋白是Bcl-2蛋白家族中第一個被闡明空間結(jié)構(gòu)的成員，Muchmore等（1996）利用X射線晶體衍射與核磁共振分光術(shù)相結(jié)合的方法分析Bcl-xL蛋白的結(jié)構(gòu)，確認(rèn)其分子結(jié)構(gòu)中包含8個α螺旋，其中α5螺旋和α6螺旋結(jié)構(gòu)在調(diào)控Bcl-2家族蛋白的抗凋亡功能中發(fā)揮重要作用。FNK蛋白是一個人工構(gòu)建的細(xì)胞保護(hù)蛋白，來源于大鼠Bcl-xL蛋白。Asoh等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，通過突變大鼠Bcl-xL蛋白的3個氨基酸（22Y→F、26Q→N和156R→K），構(gòu)建了超級抗凋亡因子FNK（最初命名為bcl-xFNK），成為哺乳類動物凋亡因子中首個也是唯一的功能增強(qiáng)型突變體，且過表達(dá)FNK蛋白的細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激、多種類型凋亡誘導(dǎo)劑等不利因素的能力顯著增強(qiáng)。PTD是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，由11個氨基酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR，自身具有跨膜活性，能將與其通過化學(xué)交聯(lián)或基因工程連接外源物質(zhì)包括大分子、藥物等帶入細(xì)胞（Brooks et al.，2005；Gullotti et al.，2013），甚至能透過血腦屏障和眼睛障礙，并保持外源物質(zhì)的活性（Rapoort and Lorberboum-Galski，2009；Wang et al.，2010；Zhang et al.，2012；Batool et al.，2013）。因此，將PTD蛋白與FNK蛋白融合獲得的PTD-FNK蛋白，能快速進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)各種異常刺激引起的細(xì)胞凋亡與壞死，尤其在豬精液冷凍稀釋液中添加300 nmol/L PTD- FNK蛋白能顯著提高冷凍豬精子活力、線粒體完整性及存活時間（Shimokawa et al.，2012）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國外關(guān)于PTD-FNK蛋白的獲取主要是通過大腸桿菌原核表達(dá)，表達(dá)形式為包涵體，但包涵體必須經(jīng)過復(fù)性后才能發(fā)揮其功能；國內(nèi)尚無有關(guān)PTD- FNK蛋白的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建PTD-FNK蛋白的原核表達(dá)載體，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件使其呈可溶性表達(dá)，以期為揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡機(jī)制及加快其在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21（DE3）、pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院解剖實驗室保存提供。2×Taq Plus Master Mix、DNA Marker、T4連接酶、點(diǎn)突變試劑盒、His標(biāo)簽抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG等購自南京諾唯贊生物科技有限公司，限制性內(nèi)切酶Sal I和EcoR I、蛋白Marker購自Thermo公司；TMB顯色購自生工生物工程（上海）股份有限公司，卡那霉素、IPTG（異丙基-

β-D-硫代半乳糖苷）、咪唑購自北京索萊寶科技有限公司，Gel Extration Kit和Plasimid Mini Kit購自Biomiga公司，NI-NTA購自QIAGEN公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)FNK蛋白氨基酸序列（表1）及Mut Express II不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變試劑盒說明，設(shè)計突變Bcl-xL基因堿基擴(kuò)增引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 突變序列PCR擴(kuò)增

以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板、P1/P4為引物，對P1P4突變序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 8 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。同時，以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板、P2/P3為引物，對P2P3突變序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1. 4 PTD-FNK蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

將純化回收的P1P4片段（35.0 μL）和P2P3片段（35.0 μL）加入0.8 μL Dpn I進(jìn)行消化（37 ℃，2 h）。P1P4片段和P2P3片段進(jìn)行重組反應(yīng)，重組反應(yīng)體系：5×CE II Buffer 4.0 μL，P1P4片段Dpn I消化產(chǎn)物10.0 μL，P2P3片段Dpn I消化產(chǎn)物4.0 μL，ExnaseTM II 2.0 μL，混勻，37 ℃反應(yīng)30 min后立即冰浴5 min。以20.0 μL反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，然后將菌液涂布于含50 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，挑取菌落進(jìn)行酶切鑒定及測序，突變后質(zhì)粒命名為pET-28a（+）-

PTD-FNK質(zhì)粒。

1. 5 pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)

挑取pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒的新鮮菌落，接種至含50 mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100比例接種于4支含50 mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基（3 mL）中，37 ℃下振蕩（220 r/min）培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6（約3 h）。取其中一支作陰性對照，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別經(jīng)20 ℃誘導(dǎo)過夜、37 ℃誘導(dǎo)4 h和30 ℃誘導(dǎo)7 h后，4000 r/min離心10 min，收集菌體（棄上清液），用500.0 μL的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）懸浮，超聲波破碎6 min，再4000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀用500.0 μL的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）懸浮，同時設(shè)立空的BL21菌株為空白對照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1. 6 融合蛋白純化

將陽性菌按1∶50比例接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基（1 L）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)7 h，離心收集菌體。收集的菌體用Buffer溶解后在冰浴中超聲波破碎菌體，4 ℃下12000 r/min離心20 min，收集上清液進(jìn)行純化。純化步驟：取5 mL Ni-NTA，用10倍柱床體積的Binding Buffer（20 mmol/L咪唑）清洗平衡柱，流速5 mL/min；將收集的裂解上清液上柱，流速2 mL/min，收集過柱液；以60倍柱床體積的Binding Buffer（20 mmol/L咪唑）清洗平衡柱，流速5 mL/min；用Wash Buffer（50、100、150 mmol/L咪唑）洗雜，流速2 mL/min，收集洗脫液；再以Elution Buffe（500 mmol/L咪唑）洗2次，流速2 mL/min，收集洗脫液。將收集到的組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳以檢測純化效果，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 7 Western bloting檢測純化產(chǎn)物

制備12%的SDS-PAGE電泳膠，取純度高的融合蛋白上樣（10.0 μL），具體步驟：濃縮膠80 V 20 min，分離膠120 V 60 min；將蛋白250 mA濕轉(zhuǎn)90 min至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉緩慢振蕩封閉2 h，洗膜；加入His標(biāo)簽抗體（一抗），1∶5000稀釋，37 ℃下緩慢振蕩2 h，洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（二抗），1∶10000稀釋，37 ℃下緩慢振蕩40 min，洗膜；DAB顯色，在天能凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PTD-FNK蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板、P1/P4為引物進(jìn)行P1P4突變序列PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小462 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。相同方法，以pET-28a（+）-

PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板、P2/P3為引物進(jìn)行P2P3突變片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小5616 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。P1P4片段和P2P3片段經(jīng)Dpn I消化后進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α并提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I酶切后以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，重組質(zhì)粒大小744 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。將陽性質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果（圖4）在NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果證實已成功構(gòu)建PTD-FNK蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-PTD-FNK。

2. 2 pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），分別在20 ℃誘導(dǎo)過夜、30 ℃誘導(dǎo)7 h和37 ℃誘導(dǎo)4 h等條件下進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖5）顯示，與未誘導(dǎo)的BL21全菌液相比，IPTG誘導(dǎo)后的上清液和沉淀中均出現(xiàn)特異性條帶（36 kD）。其中，37 ℃誘導(dǎo)4 h的融合蛋白主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，上清液中融合蛋白表達(dá)量較少；在20 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，其上清液中的融合蛋白表達(dá)量比37 ℃下誘導(dǎo)的量增多；在30 ℃下誘導(dǎo)的上清液融合蛋白表達(dá)量與20 ℃下誘導(dǎo)的差異不明顯，但誘導(dǎo)時間短，且有利于蛋白純化，因此確定IPTG誘導(dǎo)條件為30 ℃誘導(dǎo)7 h。

2. 3 PTD-FNK蛋白的純化

經(jīng)NI-NTA Argrose純化發(fā)現(xiàn)，與裂解上清液相比，高濃度（500 mmol/L）咪唑洗脫組分里只含有單一的蛋白條帶（圖6），即純化得到純度較高的融合蛋白（36 kD）。

2. 4 純化融合蛋白的Western bloting檢測

Western bloting檢測結(jié)果顯示，純化融合蛋白在36 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖7），說明純化所得融合蛋白即為PTD-FNK蛋白。

3 討論

Bcl-xL蛋白是Bcl-2蛋白家族中的一員，在機(jī)體中發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-xL蛋白結(jié)構(gòu)中的8個α螺旋與其功能密切相關(guān)，因此通過改變穩(wěn)固α螺旋結(jié)構(gòu)可獲得對應(yīng)的突變體。本研究以pET-28a（+）-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒為模板，通過定點(diǎn)突變Bcl-xL蛋白的3個氨基酸，分別是22Tyr→Phe、26Gln→Asn和165Arg→Lys。為了將FNK蛋白導(dǎo)入細(xì)胞和組織內(nèi)部，須先將PTD與FNK融合在一起，制備PTD-FNK融合蛋白。PTD-FNK蛋白已被證實具有跨膜活性，添加在細(xì)胞培養(yǎng)基中能快速進(jìn)入人工培養(yǎng)細(xì)胞或軟骨細(xì)胞內(nèi)（Asoh et al.，2002，2005； Ozaki et al.，2004）。PTD-FNK蛋白的功能研究還發(fā)現(xiàn)，其能保護(hù)各種病理條件刺激下的細(xì)胞死亡、病理模型中的腦缺血性損傷（Katsura et al.，2008）、心缺血性損傷（Arakawa et al.，2007）、肝缺血性損傷（Ozaki et al.，2004）、四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷（Asoh et al.，2005）、脂多糖引起的急性肺損傷（Chen et al.，2007）、氨基糖苷類耳中毒（Kashio et al.，2007）、化療引起的禿頭癥（Kashio et al.，2007）及骨髓移植中的細(xì)胞死亡（Tara et al.，2007），且具有冷凍保護(hù)劑的作用，能有效抑制冷凍解凍引起的軟骨細(xì)胞死亡（Sudo et al.，2005），提高冷凍解凍后豬精液的品質(zhì)（Shimokawa et al.，2012）。

至今，國內(nèi)尚無有關(guān)人工構(gòu)建PTD-FNK蛋白的研究報道。本研究將構(gòu)建的pET-28a（+）-PTD-FNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，融合蛋白主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。劉爽和胡保成（2005）研究表明，降低大腸桿菌的培養(yǎng)溫度能夠降低蛋白合成速度，提高蛋白的可溶性表達(dá)，減少包涵體形成。本研究結(jié)果也表明，經(jīng)20 ℃誘導(dǎo)過夜，其上清液中可溶性表達(dá)蛋白量比37 ℃下誘導(dǎo)4 h的量增多，進(jìn)一步佐證降低溫度能抑制包涵體形成。由于20 ℃誘導(dǎo)過夜耗時長，本研究同時進(jìn)行30 ℃誘導(dǎo)7 h的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ℃下誘導(dǎo)的可溶性蛋白表達(dá)量明顯高于37 ℃下的誘導(dǎo)量，與20 ℃下誘導(dǎo)的差異不明顯，但誘導(dǎo)時間短，且有利于蛋白純化，因此確定IPTG誘導(dǎo)條件為30 ℃誘導(dǎo)7 h。

本研究采用NI-NTA Argrose純化目的蛋白，是利用咪唑可與組氨酸競爭性結(jié)合鎳離子的原理，即低濃度咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白。純化后的融合蛋白經(jīng)Western blotting鑒定為PTD-FNK蛋白。已有研究表明，PTD-FNK蛋白是以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)（Asoh et al.，2002，2005；Chen et al.，2007），但包涵體中的多肽鏈折疊錯誤，無活性，必須通過復(fù)雜的變性復(fù)性過程才能獲得具有功能活性的蛋白（劉爽和胡保成，2005），且產(chǎn)量很低。本研究成功以可溶性形式表達(dá)出PTD-FNK蛋白，對今后加強(qiáng)其功能研究有重要意義。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過調(diào)控IPTG誘導(dǎo)溫度可成功以可溶性形式表達(dá)出PTD-FNK蛋白，且誘導(dǎo)時間短，無須復(fù)性，有利于蛋白純化及加快其在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 溫國泉）