孫艷 楊志偉

摘要：【目的】優(yōu)化火龍果總黃酮提取工藝條件，為火龍果的綜合開發(fā)與利用提供參考依據?！痉椒ā恳约t皮紅肉種火龍果為試驗材料，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗設計優(yōu)化火龍果總黃酮的乙醇回流提取工藝，并通過響應面法優(yōu)化其超聲波輔助提取工藝，確定最佳提取工藝條件?！窘Y果】乙醇回流提取火龍果總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數80%、提取溫度80 ℃、料液比1∶25、提取時間2 h，在此條件下火龍果總黃酮提取量為18.07 mg/g；超聲波輔助提取火龍果總黃酮的最佳工藝條件為：超聲波功率250 W、乙醇體積分數80%、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、超聲波時間20 min，在此條件下火龍果總黃酮提取量為19.58 mg/g?！窘Y論】超聲波輔助提取法操作簡單、耗時短、提取效率高，效果優(yōu)于乙醇回流提取法，可用于火龍果總黃酮的工業(yè)化提取。

關鍵詞： 火龍果；總黃酮；提取工藝；正交試驗設計；響應面法

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1001-08

0 引言

【研究意義】火龍果又稱紅龍果、青龍果、仙蜜果等，為仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus undatus）植物，原產于墨西哥及美洲中南部的熱帶森林地區(qū)，是一種熱帶亞熱帶新型水果（Nerd et al.，2002），目前在我國海南、廣西、廣東、貴州、福建等地已有一定規(guī)模種植?；瘕埞缓鞍踪|、氨基酸、糖類、有機酸、維生素及水溶性膳食纖維等，礦物質元素含量也較豐富，尤其是鉀、鈣、鎂、磷、鐵含量較高（陳杰等，2004；Villalobos-Gutiérrez et al.，2012），具有很高的營養(yǎng)價值。已有研究表明，火龍果果肉及果皮中含有的多酚類和黃酮類物質具有抗氧化、清除自由基等作用，并可抑制BF16黑色素瘤細胞的生長（Wu et al.，2006）。因此，研究火龍果中總黃酮的提取工藝，對火龍果的深入開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內外關于火龍果中黃酮類化合物的研究主要集中在其含量測定及抗氧化活性分析方面。郭璇華等（2010）優(yōu)化火龍果莖中黃酮類化合物的分光光度法測定條件及其分離提取條件，結果表明，最佳分離提取條件為：乙醇體積分數70%、料液比1∶40、提取溫度75 ℃、提取時間3 h；火龍果莖干品中黃酮類化合物的含量為0.49%。王曉波等（2011）通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化乙醇回流提取火龍果皮總黃酮的工藝條件，并評價火龍果皮乙醇提取物的抗氧化活性，結果表明，在最佳提取工藝條件（乙醇體積分數80%、料液比1∶30、溫度80 ℃、時間0.5 h）下提取兩次，火龍果皮總黃酮的提取率為10.9 mg/g；火龍果皮中總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。Kim等（2011）研究表明，火龍果果肉和果皮中均分布有不同含量的酚類物質及黃酮類化合物，其中果皮提取物具有更高的清除自由基活性。王曉波等（2012）的研究結果表明，火龍果皮總黃酮對羥基自由基有一定的清除效果，對菜籽油有明顯的抗氧化作用，且呈量效關系。羅小艷和郭璇華（2014）采用紫外—可見分光光度法測得火龍果花中總黃酮含量為0.747%?！颈狙芯壳腥朦c】黃酮類化合物具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗?jié)兊茸饔?，還有抑菌抗病毒、擴張冠狀動脈、降血脂活性等功效（Porfírio et al.，2014；段浩平等，2014），但目前對火龍果總黃酮提取多采用乙醇回流法，尚未見利用超聲波輔助提取的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以紅皮紅肉種火龍果為試驗材料，分別采用正交試驗設計和響應面法優(yōu)化火龍果總黃酮的乙醇回流提取工藝和超聲波輔助提取工藝，確定火龍果總黃酮的最佳提取工藝條件，為火龍果的綜合開發(fā)與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗選用廣西產的紅皮紅肉種火龍果，購自南寧市五里亭綜合批發(fā)市場，于4 ℃下貯藏備用。蘆丁標準品購自中國食品藥品檢定研究院，乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為國產分析純，購自廣東光華科技股份有限公司。主要儀器設備：紫外分光光度計（UV-2102PC，上海尤尼柯公司）、水浴鍋（HH-S2，金壇市醫(yī)療儀器廠）、智能溫控雙頻超聲波合成萃取儀（XH-2008DE，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）、粉碎機（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）、電子天平（FA2204，上海市安亭電子儀器廠）。

1. 2 火龍果總黃酮提取工藝流程

火龍果→清洗去皮→真空冷凍干燥、粉碎→乙醇回流提取（超聲波提?。闉V→定容→火龍果總黃酮提取液。

1. 3 蘆丁標準曲線繪制

參考鄭義等（2014）的方法，試驗重復操作3次，取其平均值，以蘆丁質量濃度為橫坐標（C）、吸光值為縱坐標（A），繪制蘆丁標準曲線，回歸方程為A=0.0120C-

0.0032（R2=0.9997）。

1. 4 總黃酮含量測定

取2.0 mL火龍果提取液置于25.0 mL容量瓶中，按照蘆丁標準曲線方法操作。根據蘆丁標準曲線回歸方程計算火龍果總黃酮含量，計算公式如下：

總黃酮提取量（mg/g）=C×V×n/m

式中，C為從回歸方程計算得到的火龍果黃酮類化合物質量濃度（mg/mL）；V為提取液定容體積（mL）；n為稀釋倍數；m為火龍果粉質量（g）。

1. 5 乙醇回流提取火龍果總黃酮最佳工藝條件確定

1. 5. 1 單因素試驗 選取乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間4個因素進行單因素試驗，水平梯度分別設置為：乙醇體積分數50%、60%、70%、80%和90%，提取溫度50、60、70、80和 90 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和4.0 h。

1. 5. 2 正交試驗 根據單因素試驗結果，提取時間2.0 h后對總黃酮提取量影響不明顯，故選取乙醇體積分數、提取溫度、料液比3個影響總黃酮提取量的主要因素進行L9（33）正交試驗設計，優(yōu)化火龍果總黃酮的乙醇回流提取工藝。試驗設計見表1。

1. 6 超聲波輔助提取火龍果總黃酮最佳工藝條件確定

1. 6. 1 單因素試驗 超聲波提取試驗各單因素水平梯度分別為：提取溫度50、60、70、80和90 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，超聲波時間5、10、15、20、25和30 min，乙醇體積分數50%、60%、70%、80%和90%。

1. 6. 2 響應面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，利用Design-Expert 8.0.6軟件，選擇影響火龍果總黃酮提取效果的料液比、乙醇體積分數、提取溫度3個因素為自變量，以總黃酮提取量為響應值進行響應面優(yōu)化試驗。響應面因素水平如表2所示。

1. 7 統計分析

采用SPSS 17.0、Design-Expert 8.0.6及Excel 2007對試驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 乙醇回流提取火龍果總黃酮單因素試驗結果

2. 1. 1 提取溫度對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖1可知，提取溫度為50～80 ℃時，隨著提取溫度的不斷升高，分子的擴散及滲透速度加快，火龍果總黃酮提取量也不斷增加；當提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取量達最大值，顯著高于其他提取溫度的總黃酮提取量（P<0.05，下同），之后隨著提取溫度的繼續(xù)升高，其總黃酮提取量反而降低。這是因為提取溫度過高時，破壞了黃酮類物質結構，同時提取溶劑乙醇嚴重揮發(fā)。因此，提取溫度選擇80 ℃較合適。

2. 1. 2 提取時間對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖2可以看出，提取時間為0.5～2.0 h時，火龍果總黃酮提取量隨提取時間的延長而逐漸增加，且存在顯著性差異；超過2.0 h后，總黃酮提取量增加不顯著（P>0.05，下同），可能是黃酮類化合物基本提取完全。綜合考慮，乙醇回流提取2.0 h較合適。

2. 1. 3 乙醇體積分數對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖3可知，乙醇體積分數對火龍果總黃酮提取量有顯著影響，當乙醇體積分數為50%～80%時，總黃酮提取量隨乙醇體積分數的增大而不斷增加，乙醇體積分數為80%時，總黃酮提取量達最大值，超過80%后，提取量有所下降。這可能是乙醇體積分數為80%時，溶劑極性與火龍果黃酮類物質極性相似，根據相似相溶原理，黃酮類物質溶出較多（董雯雯，2008）；之后乙醇體積分數繼續(xù)增大，一些糖類、色素、脂溶性物質等大量溶出，導致黃酮類物質溶解度下降，從而總黃酮提取量明顯降低（林珊等，2012）。因此，選擇80%乙醇為提取溶劑較合適。

2. 1. 4 料液比對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖4可知，料液比為1∶10～1∶25時，隨著料液比的不斷減小，黃酮類化合物逐漸增加，不同料液比的總黃酮提取量之間有顯著差異，料液比為1∶25時，總黃酮提取量達最大值；之后隨著料液比的繼續(xù)減小，總黃酮提取量反而下降，且會給后續(xù)處理帶來不利，同時造成資源浪費。綜合考慮，料液比以1∶25為宜。

2. 2 乙醇回流提取火龍果總黃酮工藝條件的正交試驗設計優(yōu)化分析

從表3可以看出，3個因素對火龍果總黃酮提取量的影響為：乙醇體積分數（A）>料液比（C）>提取溫度（B）。正交試驗設計優(yōu)化得到乙醇回流提取火龍果總黃酮的最佳工藝條件為A2B2C2，即乙醇體積分數80%、提取溫度80 ℃、料液比1∶25。由于優(yōu)化得到A2B2C2在L9（33）試驗組中未出現，因此在最佳條件下進行3次平行驗證試驗，測得火龍果總黃酮平均提取量為18.07 mg/g，高于正交試驗組合中任意一組。正交試驗設計確定的條件為乙醇回流提取火龍果總黃酮的最佳工藝。

2. 3 超聲波輔助提取火龍果總黃酮單因素試驗結果

2. 3. 1 超聲波時間對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖5可知，超聲波20 min，火龍果總黃酮提取量不斷增大，繼續(xù)延長超聲波時間，總黃酮提取量無明顯變化，同時超聲波時間延長，提取溶劑揮發(fā)越嚴重。因此，超聲波時間以20 min為宜。

2. 3. 2 提取溫度對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖6可知，不同提取溫度的火龍果總黃酮提取量有顯著性差異。當低于80 ℃時，隨著提取溫度不斷升高，總黃酮提取量顯著增大；提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取量達最大值，之后提取溫度升高，提取量降低。因此，提取溫度選擇80 ℃為宜。

2. 3. 3 料液比對火龍果總黃酮提取量的影響 由圖7可知，料液比高于1∶20時，不同料液比的火龍果總黃酮提取量有顯著性差異，降低料液比，總黃酮提取量不斷增大；料液比為1∶20時，總黃酮提取量達到峰值，此后隨著料液比的繼續(xù)降低，總黃酮提取量無顯著變化。因此，確定最佳料液比為1∶20。

2. 3. 4 乙醇體積分數對火龍果總黃酮提取量的影響 從圖8可以看出，乙醇體積分數過高或過低均不利于火龍果黃酮類物質的提取，乙醇體積分數低于80%時，總黃酮提取量隨乙醇體積分數的增大而顯著提高，乙醇體積分數為80%時，總黃酮提取量達到峰值；繼續(xù)增大提取溶劑體積分數，由于沸點降低，乙醇嚴重揮發(fā)，黃酮類物質不能徹底提取，而導致提取量降低。因此，以80%乙醇為提取溶劑較好。

2. 4 響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取火龍果總黃酮的工藝條件分析

2. 4. 1 回歸方程模型的建立和顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken進行試驗設計，優(yōu)化出的17組試驗安排及試驗結果見表4，得到總黃酮提取量（Y）與乙醇體積分數（X1）、提取溫度（X2）、料液比（X3）的二次多元回歸方程模型為：Y=-169.802+

2.4419X1+1.9231X2+1.5387X3+0.0106X1X2-0.0129X1X3+

5.9630×10-3X2X3-0.0190X12-0.0183X22-0.0214X32。

從圖11可以看出，固定乙醇體積分數不變，最優(yōu)點在料液比1∶20、提取溫度80 ℃附近。圖中等高線為橢圓形，表明料液比與提取溫度的交互影響顯著，對火龍果總黃酮提取量的影響較大。提取溫度的坡度比料液比更陡峭，沿提取溫度軸向等高線也更為密集，說明提取溫度對總黃酮提取量的影響較料液比更明顯。

對上述數學模型進行方差分析，結果見表5。由表5中P可以看出：模型<0.0001，表明該模型極顯著；失擬項0.2451>0.05，不顯著。決定系數R2=0.9895，校正后的R2=0.9759，表明模型對試驗擬合度高，能夠較準確地反映出各因素與響應值間的關系（Sin et al.，2006）。因此，可用此模型對火龍果總黃酮提取量進行預測。由表5回歸模型的方差分析可以看出，一次項X2和X3、二次項X12和X22、交互項X1X2、X1X3和X2X3對總黃酮提取量的影響均達極顯著水平（P<0.01）；一次項X1和二次項X32的影響不顯著。

2. 4. 2 響應面優(yōu)化結果分析 由圖9可知，固定料液比不變，提高乙醇體積分數和提取溫度，火龍果總黃酮提取量先升高后降低，當乙醇體積分數為80%、提取溫度為80 ℃時，總黃酮提取量最大。響應曲面為開口向下的凸形曲線，提取溫度與乙醇體積分數交互作用的等高線為橢圓，表明二者對總黃酮提取量的交互作用明顯。等高線在沿提取溫度軸向上分布比較密集，表明提取溫度對總黃酮提取量的影響較乙醇體積分數影響更顯著。

如圖10所示，固定提取溫度不變，火龍果總黃酮提取量隨料液比的減小而升高，隨乙醇體積分數的增大呈先升高后降低趨勢，在料液比1∶20、乙醇體積分數80%附近達響應值的最高點。圖中等高線呈橢圓，表明二者交互作用較明顯，對總黃酮提取量的影響顯著。沿乙醇體積分數軸向等高線變化密集，沿料液比軸向等高線較稀疏；響應曲面上，乙醇體積分數坡度比料液比坡度陡峭，說明乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響相對料液比更明顯。

2. 4. 3 提取工藝條件的確定及可靠性驗證 通過回歸方程模型，以響應值最大為指標進行提取條件的最優(yōu)化，可得到超聲波輔助提取火龍果總黃酮的最佳理論工藝參數：料液比1∶23、提取溫度79 ℃、乙醇體積分數78%，在最佳工藝條件下模型預測的最大總黃酮提取量為19.73 mg/g。為操作方便，確定最佳提取工藝為：超聲波功率250 W、乙醇體積分數80%、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、超聲波時間20 min，在此條件下進行3次平行試驗，總黃酮平均提取量為19.58 mg/g，與預測值的相對誤差為0.73%，偏差較小。表明該模型可用于優(yōu)化火龍果總黃酮的超聲波輔助提取工藝。

3 討論

目前，國內外對于植物中黃酮類物質的提取工藝研究較成熟，提取方法也很多，如水提法、有機溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、加壓流體萃取法、生物酶提取法等（Ganzler et al.，1990；郭雪峰和岳永德，2007；龐玉新等，2014）。有機溶劑提取法常選用乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿和乙醚等有機溶劑（尹芹等，2012），其中乙醇具有無刺激性氣味、成本低、無毒、不會造成環(huán)境污染等優(yōu)點，常用作黃酮類物質的提取溶劑。

本研究分別采用乙醇回流提取法和超聲波輔助提取法提取火龍果總黃酮，結果表明，以80%乙醇為提取溶劑，在提取溫度80 ℃、料液比1∶25的條件下回流提取2 h，火龍果總黃酮提取量為18.07 mg/g；以80%乙醇為提取溶劑，在超聲波功率250 W、料液比1∶25、提取溫度80 ℃的條件下超聲波提取20 min，火龍果總黃酮提取量為19.58 mg/g。對比這兩種方法發(fā)現，雖然提取溶劑乙醇的體積分數、提取溫度、料液比3個因素水平均相同，但超聲波輔助提取法所需時間明顯縮短，且得到的火龍果總黃酮提取量稍高于乙醇回流提取法。高溫條件下過長時間的提取不僅造成溶劑揮發(fā)、浪費資源、增加耗能，還可能破壞火龍果中黃酮類物質的結構。超聲波輔助提取的作用機理主要是利用超聲波的熱效應、機械粉碎作用及空化作用，對火龍果進行超聲處理，可以使其內部組織的溫度迅速升高，加快活性物質的溶出；超聲波的機械粉碎作用主要破壞火龍果的組織結構，引起細胞結構的損傷，從而加強組織細胞內活性物質的釋放、擴散及溶解，以提高火龍果黃酮類化合物的提取量（李欣和王步軍，2010）。此外，超聲波輔助提取法操作簡單，容易控制。可見，超聲波輔助提取法在實用性及經濟性上均明顯優(yōu)于乙醇回流提取法，適用于工業(yè)化生產，不僅符合綠色生產的工業(yè)要求，還能夠提高生產效率及生產效益，故對于火龍果總黃酮的提取宜采用超聲波輔助提取法。

本研究對比分析傳統的乙醇回流提取法和超聲波輔助提取法提取火龍果總黃酮的效果，確定了總黃酮提取的最佳工藝條件，可為火龍果資源的進一步研發(fā)和利用提供一定的參考依據；但目前有關其黃酮類物質的分離純化及結構分析的研究尚未見文獻報道，故下一步可對火龍果中總黃酮的結構鑒定等問題進行深入探究。

4 結論

超聲波輔助提取法操作簡單、耗時短、提取效率高，效果優(yōu)于乙醇回流提取法，可用于火龍果總黃酮的工業(yè)化提取。

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（責任編輯 羅 麗）