張迪 吉薇 吉宏武 高靜 豐險

摘要：【目的】利用響應(yīng)面法對南極磷蝦酶解液的脫氟工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為南極磷蝦在食品工業(yè)中開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)?！痉椒ā吭趩我蛩卦囼灥幕A(chǔ)上，以脫氟率（Y）為響應(yīng)值，選擇醋酸鈣添加量（A）、初始pH（B）、反應(yīng)溫度（C）為自變量，采用Box-Bohnken試驗設(shè)計方法，研究各自變量及其相互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響，并分析酶解液中主要營養(yǎng)成分的變化?！窘Y(jié)果】建立二次回歸方程：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2；醋酸鈣添加量、初始pH及醋酸鈣添加量與反應(yīng)溫度的交互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響極顯著（P<0.01）。南極磷蝦酶解液脫氟工藝的最佳條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應(yīng)時間140 min、反應(yīng)溫度30.24 ℃，在此條件下的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論預(yù)測值（85.37%）的相對誤差較小。在最佳條件下脫氟后，酶解液中總氮和氨基態(tài)氮含量分別損失3.11%和2.52%，反應(yīng)前后含量變化不顯著（P>0.05）?！窘Y(jié)論】采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的南極磷蝦酶解液脫氟工藝具有操作簡單、對酶解液的營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點，有較高的可行性；建立的回歸模型可用于實際預(yù)測。

關(guān)鍵詞： 南極磷蝦；酶解液；脫氟；醋酸鈣；響應(yīng)面法

中圖分類號： TS254.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1187-06

0 引言

【研究意義】南極磷蝦（Euphausia superba）是重要的蛋白質(zhì)資源之一，全球總儲量達(dá)3.79億t（Atkinson et al.，2011）。南極磷蝦營養(yǎng)豐富，含有鈉、鈣、鐵、鉀、磷等多種礦物質(zhì)元素及人體必需的全部氨基酸，且不飽和脂肪酸、磷脂和類胡蘿卜素的含量豐富，具有很高的食用價值（Yoshitomi，2004；孫雷等，2008）。氟是人類必需的微量元素之一，每日攝入量不能超過4～5 mg，少量的氟有助于牙齒和骨骼正常發(fā)育，但攝入量過高會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，甚至出現(xiàn)無法站立、癱瘓等癥狀（Meenakshi and Maheshwari，2006；Wang et al.，2011）。南極磷蝦具有富集氟的特性（Tou et al.，2007），其酶解液存在氟含量過高的問題，限制了其開發(fā)利用，因此有必要先對磷蝦酶解液中的氟進(jìn)行脫除，才能被用于食品開發(fā)。【前人研究進(jìn)展】目前，已有不少降低南極磷蝦制品中氟含量的方法，包括酸洗法、化學(xué)沉淀法（Yang et al.，2001）、電解法（Tahir，2005）、吸附法（Tripathy et al.，2006）等。酸洗法和化學(xué)沉淀法簡單方便，是南極磷蝦較常用的處理方法。酸洗法是利用酸對整只磷蝦、磷蝦勻漿物或煮熟的粉碎磷蝦肉進(jìn)行處理，將磷蝦中無機(jī)氟轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)的氟離子除去；此法能除去磷蝦中的部分氟，但會破壞產(chǎn)品的組織特性和風(fēng)味，使磷蝦中的營養(yǎng)物質(zhì)大量損失（Jung et al.，2013）?；瘜W(xué)沉淀法主要采用可溶性鈣鹽，使F-和Ca2+生成CaF2沉淀除去，該方法操作簡單、成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。已有研究以氯化鈣（李紅艷等，2011）、生石灰（呂傳萍等，2012）等無機(jī)鈣作為脫氟劑處理南極磷蝦酶解液，可去除酶解液中大部分的氟。但無機(jī)鈣在食品加工中作為食品添加劑不宜大量使用，反應(yīng)后會使酶解液產(chǎn)生苦味和酸澀味，影響其在食品工業(yè)中推廣應(yīng)用（李春發(fā)，2012）?！颈狙芯壳腥朦c】醋酸鈣是常用的食品添加劑，在食品工業(yè)中一直作為螯合劑、增香劑、穩(wěn)定劑等（鄭海鵬和董全，2008）。但目前鮮見利用響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液醋酸鈣法脫氟工藝的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以醋酸鈣為鈣源，脫氟率為考察指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液的脫氟工藝，為南極磷蝦在食品工業(yè)中開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

南極磷蝦由湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司提供，冷凍方式運(yùn)到實驗室，貯藏于-70 ℃冰箱。醋酸鈣、高氯酸、氟化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、冰乙酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：PF-1氟選擇電極（上海雷磁精密儀器有限公司）、232-01型甘汞參比電極（上海雷磁精密儀器有限公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（常州國華電器有限公司）、MS300磁力攪拌器（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、WFO-700型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、PHST-3F酸度計（上海雷磁精密儀器有限公司）、GL-10LND型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 南極磷蝦酶解液制備 南極磷蝦切碎，用分散均質(zhì)機(jī)以10000 r/min均質(zhì)5 min，均質(zhì)后的漿液加入900 U/g混合酶（150000 U/g動物蛋白水解酶∶140000 U/g風(fēng)味酶=1∶1），于50 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)完全的酶解液在離心力4000 g的條件下離心5 min，取離心后的上清液于4 ℃存放備用。

1. 2. 2 脫氟率計算 采用氟離子選擇電極法（GB/T 5009.18-2003）測定氟離子含量，并計算脫氟率。

脫氟率（%）=1-脫氟后酶解液氟含量/脫氟前酶解液氟含量×100

1. 2. 3 單因素試驗

1. 2. 3. 1 醋酸鈣添加量的選擇 在南極磷蝦酶解液中分別添加1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/mL的醋酸鈣，pH調(diào)至10.0，25 ℃攪拌反應(yīng)1 h，測定反應(yīng)后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 2 初始pH的選擇 將酶解液pH分別調(diào)至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，添加20.0 mg/mL醋酸鈣，25 ℃攪拌反應(yīng)1 h，測定反應(yīng)后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 3 反應(yīng)溫度的選擇 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸鈣，pH調(diào)至10.0，分別于4、10、20、30、40、50和60 ℃下攪拌反應(yīng)1 h，測定反應(yīng)后酶解液脫氟率。

1. 2. 3. 4 反應(yīng)時間的選擇 在酶解液中添加20.0 mg/mL醋酸鈣，pH調(diào)至10.0，25 ℃攪拌分別反應(yīng)20、40、60、80、100、120、140、180、220和260 min，測定反應(yīng)后酶解液脫氟率。

1. 2. 4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Bohnken設(shè)計方法，選擇對南極磷蝦酶解液脫氟率影響較大的3個因素（醋酸鈣添加量、初始pH、反應(yīng)溫度），取-1、0、1代表變量的3個水平，以脫氟率為響應(yīng)值建立二次響應(yīng)面分析模型。共進(jìn)行17個試驗，其中12個為析因點，5個為零點用于估算誤差。每個試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果表示為測定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。響應(yīng)面因素與水平見表1。

1. 2. 5 酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化分析 取少量脫氟前后的酶解液，分析脫氟過程中營養(yǎng)物質(zhì)的變化。采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）測定總氮，甲醛滴定法（GB 18186-2000）測定氨基態(tài)氮，分別計算總氮和氨基態(tài)氮損失率。

總氮損失率（%）=1-脫氟后酶解液總氮含量/脫氟前酶解液總氮含量×100

氨基態(tài)氮損失率（%）=1-脫氟后酶解液氨基態(tài)氮含量/脫氟前酶解液氨基態(tài)氮含量×100

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.5、Origin 7.0和Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.18-2003中的氟離子選擇電極法繪制氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-46.115x+240.46（其中y為電位值，x為氟離子濃度的對數(shù)值）。在氟濃度為0.04～1.00 μg/mL線性范圍內(nèi)，該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的相關(guān)性，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可測定南極磷蝦酶解液中的氟濃度。

2. 2 單因素試驗結(jié)果

2. 2. 1 醋酸鈣添加量對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 由圖1可知，隨著醋酸鈣添加量的增加，南極磷蝦酶解液脫氟率逐漸上升，添加量為20.0～25.0 mg/mL時達(dá)最大值范圍，繼續(xù)添加醋酸鈣，脫氟率變化不明顯。考慮到成本和實際生產(chǎn)的需要，選擇醋酸鈣最佳添加量為20.0 mg/mL。

2. 2. 2 初始pH對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 如圖2所示，當(dāng)南極磷蝦酶解液pH在7.0～10.0范圍時，脫氟率由61.25%增至89.76%；酶解液pH超過10.0后，脫氟率略有下降，其中pH在10.0～11.0范圍時，脫氟率由89.76%降至84.47%。這是由于醋酸鈣屬于強(qiáng)堿弱酸鹽，當(dāng)pH>10.0時，Ca2+與OH-形成Ca（OH）2，使Ca2+濃度降低。因此，選擇南極磷蝦酶解液脫氟反應(yīng)的最佳初始pH為10.0。

2. 2. 3 反應(yīng)溫度對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 由圖3可知，南極磷蝦酶解液脫氟率隨著反應(yīng)溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢。反應(yīng)溫度由4 ℃升至30 ℃，脫氟率平緩上升；超過30 ℃后，脫氟率隨反應(yīng)溫度的升高持續(xù)下降。隨溫度升高，蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象改變會導(dǎo)致其生物活性喪失，次級鍵遭到破壞使帶電基團(tuán)也被破壞，其帶電性能發(fā)生變化可能影響了溶液中的離子反應(yīng)，從而使脫氟率降低。因此，選擇南極磷蝦酶解液脫氟工藝的最佳反應(yīng)溫度為30 ℃。

2. 2. 4 反應(yīng)時間對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響 如圖4所示，隨著反應(yīng)時間的延長，南極磷蝦酶解液脫氟率逐漸上升，140 min時脫氟率達(dá)最大值，繼續(xù)反應(yīng)，脫氟率變化不明顯。醋酸鈣是強(qiáng)堿弱酸鹽，在反應(yīng)過程中需要一定時間Ca2+才能達(dá)到平衡狀態(tài)，因而CaF2的沉降速度慢，達(dá)到最大的脫氟率所需時間較長。考慮到食品工業(yè)生產(chǎn)中的效率和能耗等問題，選擇酶解液最佳反應(yīng)時間為140 min。

2. 3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2. 3. 1 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5對響應(yīng)面試驗結(jié)果（表2）進(jìn)行二次多元回歸分析，除去不顯著項得到模型的二次多項回歸方程為：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2。

由表3可知，模型P<0.0001，而失擬項不顯著（P=

0.2213>0.05），表明模型極顯著。因素一次項A和B、交互項AC及二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），一次項C、交互項AB和BC對結(jié)果影響不顯著（P>0.05，下同）。同時，軟件分析的復(fù)相關(guān)系數(shù)R的R2Adj為97.93%，表明模型中殘差相互獨立，擬合程度良好，試驗誤差小，可用于對南極磷蝦酶解液的脫氟率進(jìn)行分析和預(yù)測。

2. 3. 2 響應(yīng)曲面圖分析 醋酸鈣添加量、初始pH和反應(yīng)溫度3個因素間交互作用對南極磷蝦酶解液脫氟率的影響如圖6～8所示。反應(yīng)溫度與醋酸鈣添加量的交互作用對脫氟率的影響最大，其曲線圖最陡峭，隨著反應(yīng)溫度的升高和醋酸鈣添加量的增加，脫氟率呈先升高后降低的趨勢；而初始pH與反應(yīng)溫度、初始pH與醋酸鈣添加量間的交互作用對脫氟率的影響不明顯，曲線較平滑。響應(yīng)面分析結(jié)果與表3的結(jié)果一致。

2. 3. 3 驗證試驗結(jié)果 通過Design-Expert 8.0.5得到二次多項回歸方程，在試驗因素水平范圍內(nèi)預(yù)測南極磷蝦酶解液脫氟的最佳工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應(yīng)溫度30.24 ℃，此時的酶解液脫氟率理論預(yù)測值為85.37%。為檢驗回歸方程預(yù)測結(jié)果的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗證試驗，實際測得的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論值的平均誤差為1.42%。試驗結(jié)果充分驗證了該模型的正確性，得到的二次多項回歸方程可較準(zhǔn)確預(yù)測醋酸鈣法制備南極磷蝦酶解液的脫氟率。

2. 4 酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況

南極磷蝦酶解液在脫氟的過程中其營養(yǎng)成分可能會發(fā)生變化，因此以總氮和氨基態(tài)氮為指標(biāo)反映酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況，在最佳工藝條件下，檢測脫氟反應(yīng)對南極磷蝦酶解液中營養(yǎng)物質(zhì)的影響。由表4可知，酶解液反應(yīng)后，其總氮損失3.11%，氨基態(tài)氮損失2.52%。利用醋酸鈣脫氟對酶解液的營養(yǎng)成分影響不顯著，說明脫氟反應(yīng)對南極磷蝦酶解液的主要營養(yǎng)成分影響不明顯，醋酸鈣法是一種比較理想的脫氟方法。

3 討論

南極磷蝦營養(yǎng)豐富且儲量巨大，有廣闊的應(yīng)用前景，但其酶解液中的氟含量過高限制其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。在保留營養(yǎng)物質(zhì)和原有風(fēng)味的前提下，將酶解液中過量的氟除去，對于南極磷蝦的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。有關(guān)南極磷蝦的脫氟工藝，已有學(xué)者對其進(jìn)行研究。李紅艷等（2011）利用氯化鈣脫氟，反應(yīng)得到酶解液的脫氟率為89.43%。F-和Ca2+形成的CaF2顆粒較小，根據(jù)斯托克斯原理，顆粒粒徑的平方與微粒的沉降速度呈正比，因此CaF2的沉降速度很慢，達(dá)到平衡需較長時間；在反應(yīng)過程中為了加快反應(yīng)速率，需加大氯化鈣用量，但用氯化鈣反應(yīng)后酶解液有苦澀味，影響南極磷蝦酶解液進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。呂傳萍等（2012）以生石灰作為鈣源，得到酶解液脫氟率為88.25%。生石灰價廉易得，但其溶解度較小，需形成乳濁液才能參與反應(yīng)。由于F-和Ca2+反應(yīng)生成的CaF2沉淀會附著在Ca（OH）2顆粒的表面，影響反應(yīng)速率，因此在反應(yīng)過程中一般也需加入較多的生石灰。生石灰參與反應(yīng)釋放出大量熱，致使蛋白變性，同時使酶解液產(chǎn)生苦澀味和石灰味。本研究以醋酸鈣為脫氟劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦酶解液脫氟工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最佳條件下酶解液脫氟率為（84.15±1.37）%。雖然與無機(jī)鈣相比，醋酸鈣的脫氟率略低，但醋酸鈣作為常用的食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑，能有效降低酶解液中氟含量，同時對酶解液的風(fēng)味和營養(yǎng)成分影響較小，是一種理想的脫氟劑，適用于食品工業(yè)大規(guī)模推廣使用。

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對醋酸鈣法制備南極磷蝦低氟酶解液的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立以醋酸鈣添加量（A）、初始pH（B）和反應(yīng)溫度（C）3個因素對南極磷蝦酶解液脫氟率（Y）的回歸模型：Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-

3.20C2。經(jīng)過驗證試驗證明，該模型可預(yù)測南極磷蝦酶解液脫氟率的變化規(guī)律，適用于實際生產(chǎn)中的預(yù)測。在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中，單因素和雙因素交互作用對脫氟率的影響為：醋酸鈣添加量、初始pH及醋酸鈣添加量與反應(yīng)溫度的交互作用對脫氟率的影響極顯著，與呂傳萍等（2012）的研究結(jié)果不完全一致。優(yōu)化得出的脫氟工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應(yīng)時間140 min、反應(yīng)溫度30.24 ℃，在此條件下反應(yīng)后的酶解液營養(yǎng)成分總氮和氨基態(tài)氮的含量變化小。在實際生產(chǎn)中采用該工藝參數(shù)，可除去酶解液中的過量氟，同時最大限度保留南極磷蝦的原有風(fēng)味和營養(yǎng)成分，有利于南極磷蝦酶解液進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用，為南極磷蝦的食品工業(yè)化發(fā)展打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到南極磷蝦酶解液的最佳脫氟工藝條件為：醋酸鈣添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反應(yīng)時間140 min、反應(yīng)溫度30.24 ℃，在此條件下的脫氟率為（84.15±1.37）%，與理論預(yù)測值的相對誤差小。該工藝具有操作簡單、對酶解液的營養(yǎng)成分影響較小等優(yōu)點，有較高的可行性；建立的回歸模型可用于實際預(yù)測。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）