趙玳琳 卯婷婷 趙興麗 劉杏忠 蔡磊 陶剛

摘要：【目的】明確草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）在侵染草莓葉片過程中病原菌的侵染致病過程，為防控草莓炭疽病提供理論依據(jù)。【方法】用草莓炭疽菌綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株LC0220-7GFP的分生孢子懸浮液接種離體健康草莓葉片，在熒光顯微鏡下觀察病原菌的侵染過程及侵染結(jié)構(gòu)。【結(jié)果】接種6～9 h為病原菌分生孢子萌發(fā)高峰期，接種9 h約90.00%的分生孢子已萌發(fā)；接種12～24 h為侵染結(jié)構(gòu)形成高峰期，接種24 h約70.00%的芽管頂端產(chǎn)生附著胞并形成侵染釘開始侵染草莓葉片表皮細(xì)胞，有少量的菌絲開始直接侵染葉片表皮細(xì)胞，同時在寄主上表皮上有少量的附著枝形成；接種48 h為菌絲形成高峰期，菌絲大量形成并沿著表皮細(xì)胞延伸成網(wǎng)絡(luò)狀，葉片開始出現(xiàn)零星病斑；接種72～96 h為分生孢子盤形成高峰期；接種96～120 h為產(chǎn)孢高峰期，接種96 h產(chǎn)生新的分生孢子，大部分病原菌完成一個侵染循環(huán)；接種144 h形成典型的炭疽病斑?！窘Y(jié)論】草莓炭疽菌通過產(chǎn)生附著胞侵入或直接侵入草莓葉片表皮細(xì)胞，使草莓葉片發(fā)病，形成典型的炭疽病斑。

關(guān)鍵詞： 草莓炭疽菌；附著胞；熒光顯微鏡；侵染釘；侵染過程

中圖分類號： S436.639 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1140-06

0 引言

【研究意義】草莓炭疽病是草莓種植業(yè)的重要病害之一，其發(fā)生普遍，分布廣泛，已成為繼灰霉病和白粉病后制約我國草莓生產(chǎn)的第三大病害（陳宏州等，2014），近年來草莓炭疽病的發(fā)生呈上升趨勢（楊敬輝等，2015）。據(jù)法國Denoyes和Baudry（1995）報(bào)道，適宜條件下草莓炭疽病最高可造成草莓減產(chǎn)80%；在我國，隨著草莓種植面積的擴(kuò)大，設(shè)施密閉及高溫高濕環(huán)境等導(dǎo)致草莓炭疽病發(fā)生日益嚴(yán)重，造成草莓減產(chǎn)25%～30%，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)（胡德玉等， 2014）。因此，盡快明確草莓炭疽病病原菌的侵染致病特征，對于尋求新的炭疽病病害防治策略，開發(fā)新的病害安全控制體系等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】草莓炭疽病由多種炭疽菌（Colletotrichum Corda）復(fù)合侵染引起，已有文獻(xiàn)報(bào)道的病原菌包括尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmonds）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz）、草莓炭疽菌（C. fragariae Brooks）和黑線炭疽菌（C. dematiu Simmonds）（Gunnell and Gubler， 1992； Denoyes-Rothan et al.， 2003）。1931年Brooks在美國佛羅里達(dá)州首次報(bào)道由草莓炭疽菌引起的草莓炭疽病。草莓炭疽菌一般情況下習(xí)慣性侵染草莓莖稈，引起草莓炭疽冠腐?。–urry et al.， 2002）。多年來，草莓炭疽菌雖然在病原菌種類鑒定、病原菌生物學(xué)特性、為害癥狀及檢測技術(shù)等方面有較多研究報(bào)道，但關(guān)于草莓炭疽病菌致病機(jī)制及其調(diào)控的研究僅限于零散報(bào)道（Howard and Albregts， 1983； Bonde et al.，1991；Sreenivasaprasad et al.，1992； Freeman et al.， 1993；Curry et al.，2002；Martinez-Culebras et al.，2002， 2003；Fang et al.，2012），僅Curry等（2002）首次應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡在細(xì)胞組織水平上觀察草莓炭疽菌侵染草莓莖稈的過程和Fang等（2012）對草莓炭疽菌侵染草莓莖稈過程中蛋白質(zhì)組學(xué)變化進(jìn)行了相關(guān)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】相對于傳統(tǒng)的電鏡技術(shù)，綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）標(biāo)記系統(tǒng)由于熒光性能穩(wěn)定、檢測方便、靈敏度高及表達(dá)不受種屬限制等特性而越來越為人們重視，并被成功地用于研究細(xì)菌、真菌在植物根部、體內(nèi)的定殖觀察（Ramos et al.， 2002； 陳孝仁等， 2009；趙鳳軒， 2010）及工程菌向環(huán)境的釋放（Scott et al.，1998；Halfhill et al.， 2001）等研究，應(yīng)用GFP標(biāo)記菌株觀察病原菌在寄主體內(nèi)的侵染過程，對病害過程進(jìn)行實(shí)時動態(tài)追蹤，將是未來重要的研究方向之一。目前，尚無應(yīng)用GFP標(biāo)記體系觀察草莓炭疽菌侵染過程的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】用草莓炭疽菌（C. fragariae）綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株LC0220-7GFP的分生孢子液離體接種草莓葉片，在熒光顯微鏡下對其侵染致病過程及侵染結(jié)構(gòu)等進(jìn)行初步觀察，旨在明確該病原菌在侵染草莓葉片過程中病原菌的侵染致病過程，為進(jìn)一步揭示草莓炭疽病病害的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律打下理論基礎(chǔ)，同時為有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 草莓炭疽GFP標(biāo)記菌株：LC0220- 7GFP，野生型菌株由中國科學(xué)院微生物研究所饋贈，熒光菌株通過ATMT遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得，于PDA斜面培養(yǎng)基上4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 1. 2 供試草莓品種 黔莓2號，草莓葉片采集于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所大棚，用滅菌剪刀剪取大小均勻、生長周期較一致的健康草莓葉片若干備用。

1. 1. 3 供試培養(yǎng)基 培養(yǎng)基參考方中達(dá)（1998）的方法。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯 200 g切片，放入1000 mL水煮沸，約30 min后用4層紗布過濾得濾液，加葡萄糖20 g、瓊脂15 g，用玻璃棒混勻，加水定容至1000 mL。

1. 1. 4 分生孢子懸浮液制備 將于PDA斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存的菌株LC0220-7GFP轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗條件下培養(yǎng)5 d，用滅菌打孔器于菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅若干，將菌餅再次移至PDA培養(yǎng)基中，再次放入25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗條件下培養(yǎng)7 d，病原菌在PDA培養(yǎng)基上大量產(chǎn)孢，然后在每個培養(yǎng)皿中加入5 mL無菌水，用滅菌玻璃棒刮取表面菌絲，經(jīng)4層滅菌過濾紙過濾得到分生孢子濾液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分生孢子液濃度，通過離心濃縮或加入無菌水稀釋等方法將溶液調(diào)整成濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液。為提高分生孢子液在葉片上的黏著性，在接種前加入數(shù)滴Tween-20原液，Tween-20最終濃度為0.1%。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 葉片接種方法 于大棚內(nèi)用滅菌剪刀剪取大小均勻、生長周期較一致的健康草莓葉片100片，用無菌水沖洗3遍，75%酒精表面消毒，消毒后的葉片整齊放置于鋪有濕潤吸水紙的搪瓷盤中（搪瓷盤先用75%酒精噴灑消毒，鋪4層吸水紙，然后噴灑無菌水使吸水紙保持濕潤），用無菌水濕潤后的濕棉花壓住葉柄，確保葉片能長時間保持新鮮。用滅菌槍頭吸取制備好的濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液接種于草莓葉片上，每片葉片接種500 μL，用滅菌后的小刷子均勻地涂抹于草莓葉片上，以噴灑無菌水為空白對照。接種后用保鮮膜封口，置于28 ℃、濕度90%、14 h光照/10 h黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 2 取樣和顯微觀察方法 在接種不同時間點(diǎn)（接種后3、6、9、12、24、48、72、96、120、144 h）取樣，每時間點(diǎn)隨機(jī)取樣6片葉片。用滅菌刀片將葉片切成若干小薄塊制作成臨時水裝片，臨時水裝片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照，并統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的時間點(diǎn)和百分率，孢子萌發(fā)和附著胞產(chǎn)生每次隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個孢子，3次重復(fù)。顯微鏡設(shè)置：Diode/Argon/HeNe1- HeNe2激發(fā)光，綠色熒光通過488 nm濾鏡觀察。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

參照萬三連等（2014）的方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。孢子萌發(fā)、附著胞形成比率計(jì)算公式：形成比率（%）=形成各結(jié)構(gòu)孢子數(shù)/孢子統(tǒng)計(jì)總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分生孢子在草莓葉片上的侵染過程及致病性

接種后3～24 h LC0220-7GFP分生孢子萌發(fā)及附著胞形成情況見表1。接種后分生孢子首先附著于葉片表面，接種6 h，25.00%的病原菌分生孢子開始從端部或近端部萌發(fā)出棒狀芽管（圖1-1），1個分生孢子能產(chǎn)生1～3根牙管（圖1-2）；接種9 h，約90.00%的分生孢子萌發(fā)；接種12 h，分生孢子萌發(fā)率為100.00%，約16.00%的芽管頂端開始膨大，分化成特異的侵染結(jié)構(gòu)附著胞，此時的附著胞顏色較淺，尚未黑化，胞質(zhì)較稀疏（圖1-3），部分芽管分化形成初生菌絲和次生菌絲（圖1-4）；接種24 h，可觀察到有少量的侵染菌絲直接侵染葉片表皮細(xì)胞（圖1-5），同時約70.00%的芽管產(chǎn)生大量的黑化附著胞，在一些附著胞基部觀察到有一黑色邊緣的小圓點(diǎn)，是附著胞分化形成的侵染釘，即黑化附著胞分化形成侵染釘開始穿透寄主表皮細(xì)胞進(jìn)行侵染（圖1-6），且侵染菌絲已侵入葉片皮層細(xì)胞（圖1-7），同時有少量的菌絲分化形成附著枝（圖2-7～9）；接種48 h，菌絲呈網(wǎng)絡(luò)狀覆蓋于葉片表面，侵染菌絲在寄主皮層細(xì)胞間大量擴(kuò)增（圖1-8），同時通過葉片腺毛組織細(xì)胞進(jìn)行侵染（圖1-9），在葉片上出現(xiàn)肉眼可見的針尖大小病斑（圖1-13），發(fā)病率為100.00%，但空白對照葉片無病斑（圖1-14）；接種72 h，侵染菌絲迅速擴(kuò)增，從1個細(xì)胞侵染擴(kuò)散到周圍其他細(xì)胞，分生孢子盤開始萌發(fā)（圖1-10）；接種96 h，在葉片表面形成大量的分生孢子盤，分生孢子盤上的分生孢子梗產(chǎn)生新的分生孢子，大多數(shù)病原菌完成一個侵染循環(huán)（圖1-11）；接種144 h，葉片上許多小病斑相互連成大病斑或成一片，形成典型的炭疽病斑（圖1-15），葉片細(xì)胞開始大量腐爛崩解（圖1-12），而空白對照仍無癥狀（圖1-16）。

經(jīng)過觀察可將草莓炭疽菌初期侵染草莓葉片過程分為幾個關(guān)鍵時期：6～9 h為分生孢子萌發(fā)高峰期；12～24 h為侵染結(jié)構(gòu)形成高峰期；48 h為菌絲形成高峰期；72～96 h為分生孢子盤形成高峰期；96～120 h為產(chǎn)孢高峰期。

2. 2 病原菌侵染結(jié)構(gòu)的超微觀察

當(dāng)病原菌識別寄主后，在寄主表面開始萌發(fā)形成芽管并產(chǎn)生一系列的侵染結(jié)構(gòu)：附著胞、附著枝、侵染釘、初生菌絲、次生菌絲等。在熒光顯微鏡下觀察，接種12 h開始形成附著胞，此時的附著胞顏色較淺，胞質(zhì)較稀疏。24 h后附著胞分化成熟，胞壁逐漸黑色素化，胞質(zhì)稠密，在附著胞基部形成1個圓形小點(diǎn)，即侵染釘，侵染釘穿透寄主角質(zhì)層和細(xì)胞壁侵染寄主。接種24 h后在寄主上表皮上還可觀察到少量爪狀附著枝，附著枝尚未黑色素化（圖2-7～9）。

侵染結(jié)構(gòu)有兩種形成方式：一是分生孢子端部產(chǎn)生芽管，芽管膨大產(chǎn)生附著胞或附著枝等；二是從菌絲上分化出側(cè)枝產(chǎn)生附著胞或附著枝等。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LC0220-7GFP侵染草莓葉片能形成多種形態(tài)各異的附著胞，如圓形、姜瓣形、卵圓形、梨形、馬蹄形和不規(guī)則形等（圖2-1～6），同時，附著胞有多種著生方式，可以著生于芽管頂端（圖2-1、圖2-3），也可著生于菌絲分化的側(cè)枝頂端（圖2-2、圖2-5）。在觀察到的附著枝中，可以單個著生（圖2-7），也可形成多個爪狀的附著枝（圖2-8、圖2-9）。

3 討論

炭疽菌屬（C. Corda）是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均很廣泛，能嚴(yán)重危害多種瓜果蔬菜、苗木果樹等。該病菌分生孢子侵染途徑有兩種，一是通過自然孔口（氣孔、皮孔）或傷口入侵；另一種是必須依賴于病原菌獨(dú)特的侵染結(jié)構(gòu)——附著胞（Appressorium）的直接侵入（王葵娣等，2007），在整個侵染過程中，附著胞的形成起著重要的致病作用。本研究觀察到草莓炭疽菌通過產(chǎn)生附著胞侵入寄主的同時，后期還能產(chǎn)生附著枝。一般情況下，一些土傳病原菌也能通過產(chǎn)生特殊的侵染結(jié)構(gòu)——附著枝侵染寄主，如小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）（Mendgen et al.， 1996；Freeman and Ward， 2004；Sesma and Osbourn， 2004）。在前人的研究中尚未見草莓炭疽菌通過產(chǎn)生附著枝侵染寄主的報(bào)道。附著枝和附著胞在形成和結(jié)構(gòu)上有許多相似之處，它們通常形成于相同的有機(jī)體上，但在特定條件下一般只有附著胞或附著枝單獨(dú)形成（Howard， 1997；Money et al.， 1998）。植物病原菌通常在進(jìn)行腐生生活或被掩埋在土壤中時能形成附著枝，有學(xué)者認(rèn)為此時附著枝扮演著附著胞入侵寄主的角色（Howard， 1997），也有人認(rèn)為此時附著枝的形成可能是為了度過惡劣的生存環(huán)境，作為一種生存結(jié)構(gòu)存在（Epstein， 1994）。Curry等（2002）報(bào)道， 草莓炭疽菌在經(jīng)歷一個短暫的活體營養(yǎng)階段（小于12 h）后立即進(jìn)入死體營養(yǎng)階段。本研究中，接種24 h后，草莓葉片上的病原菌菌絲能形成附著枝，病原菌可從已死亡的植物有機(jī)物中吸取養(yǎng)分進(jìn)行腐生生活，此時附著枝可能是作為一種生存結(jié)構(gòu)，成為下一個侵染循環(huán)或下一個生長季節(jié)再次侵染的侵染源。

炭疽菌屬真菌主要采用兩種侵染策略，即細(xì)胞內(nèi)定殖和角質(zhì)層下內(nèi)部定殖（Perfect et al.， 1999），大多數(shù)炭疽菌屬于前者類型。草莓炭疽菌的侵染方式以胞內(nèi)半活體營養(yǎng)寄生為主，與寄主建立了兩種營養(yǎng)關(guān)系：活體營養(yǎng)和死體營養(yǎng)（Connell et al.， 1985；張敬澤和徐同， 2005），即侵染初期無癥狀階段（或活體營養(yǎng)階段）和最后有明顯癥狀的危害階段。OConnell等（1985）和Leach（1922）描述區(qū)別無癥狀階段和危害階段的侵染菌絲為初生菌絲和次生菌絲，炭疽菌活體營養(yǎng)階段持續(xù)一段時間后，隨著初生菌絲上產(chǎn)生次生菌絲，活體侵染菌絲轉(zhuǎn)向死體營養(yǎng)階段，死體營養(yǎng)階段引起典型的炭疽病癥狀和枯萎癥狀。前人研究表明，草莓炭疽菌活體營養(yǎng)階段較短，一般少于12 h，之后次生菌絲產(chǎn)生比其更具有破壞性的次生菌絲，次生菌絲的產(chǎn)生標(biāo)志著侵染進(jìn)入死體營養(yǎng)階段（Curry et al.，2002）。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相符，說明接種草莓炭疽菌12 h前該菌進(jìn)行活體營養(yǎng)生長。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，草莓炭疽菌能在草莓葉片表面萌發(fā)形成一系列的侵染結(jié)構(gòu)，如芽管、附著胞等，草莓炭疽菌通過侵染草莓葉片，使草莓葉片發(fā)病形成典型的炭疽病斑。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）