李玉華 鄧培淵 劉宇邈 雷志華

摘要：【目的】研究小菜蛾性信息素與性信息素結(jié)合蛋白、受體蛋白之間作用的關(guān)鍵氨基酸殘基和作用力類型，揭示小菜蛾識別性信息素的分子機(jī)制，為開發(fā)新型性誘劑和小菜蛾的無害化防治提供新思路。【方法】運用Discovery Studio 2.5對小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白PxylPBP2和受體蛋白PxylOR4進(jìn)行同源建模，運用程序包中LibDock模塊進(jìn)行分子對接，運用Calculate Energy模塊計算復(fù)合物結(jié)合自由能，分析性信息素Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4的結(jié)合模式及相互作用力?！窘Y(jié)果】Thr9是PxylPBP2與Z9-14∶AC形成氫鍵的關(guān)鍵氨基酸殘基，Z9-14∶AC易與PxylOR4中的Leu殘基產(chǎn)生疏水作用力；PxylPBP2與Z9-14∶AC結(jié)合的主要驅(qū)動力是靜電力，PxylOR4與Z9-14∶AC結(jié)合的主要驅(qū)動力是范德華力，溶劑化能均抑制Z9-14∶AC與PxylPBP2和Z9-14∶AC與PxylOR4的結(jié)合?！窘Y(jié)論】小菜蛾性信息素受體蛋白和性信息素結(jié)合蛋白在識別和結(jié)合性信息素分子方面存在明顯差異，性信息素受體蛋白與性信息素反應(yīng)更靈敏、形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞： 小菜蛾；性信息素；分子對接；結(jié)合自由能

中圖分類號： S433.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0928-06

0 引言

【研究意義】小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），對十字花科蔬菜危害極大，已取代菜青蟲成為十字花科蔬菜上的第一大害蟲（陳瓊等，2015；尹飛等，2015）。目前對小菜蛾的防治仍以化學(xué)防治為主，但大量使用化學(xué)殺蟲劑造成小菜蛾抗藥性迅速提高，致使防治效果逐漸下降（程英等，2014）。性信息素具有無污染、專一性強(qiáng)、對環(huán)境安全等優(yōu)點，使用性信息素防治小菜蛾是無害化防治的重要途徑之一。而研究小菜蛾對性信息素識別的分子機(jī)制，可為設(shè)計新型、高效、廉價的性誘劑替代物提供理論參考。【前人研究進(jìn)展】在昆蟲識別性信息素過程中需要有昆蟲性信息素結(jié)合蛋白（Pheromone binding proteins，PBPs）及性信息素受體（Pheromone receptors，ORs）蛋白的參與，首先由水溶性的性信息素結(jié)合蛋白與性信息素特異結(jié)合形成聚合物啟動昆蟲的覓食、求偶、交配和產(chǎn)卵等行為（修偉明等，2005），形成聚合物穿過淋巴液后與在神經(jīng)細(xì)胞樹突膜上的性信息素受體結(jié)合，進(jìn)而刺激嗅覺神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，再將攜帶的化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺罱K電信號經(jīng)整合后被傳入昆蟲大腦并產(chǎn)生相應(yīng)的行為（鄭凱迪和杜永均，2012）。已有研究發(fā)現(xiàn)，順-11-十六碳烯酸酯（Z11-16∶Ac）、順-11-十六碳烯醛（Z11-16∶Ald）（Tamaki et al.，1977）和順-9-十四碳烯酸酯（Z9-14∶AC）（Chisholm et al.，1983）是小菜蛾性信息素的主要成分，自昆蟲的PBPs和ORs基因被克隆后，與昆蟲性信息素有密切關(guān)系的PBPs蛋白和ORs蛋白研究也越來越廣泛和深入。起初，一些學(xué)者用同位素示蹤法標(biāo)記氣味分子，研究其與PBPs的作用機(jī)理，僅確定了PBPs與氣味分子具有結(jié)合特性（Vogt et al.， 1988；Ma■b■che-Coisne et al.， 1997），這種實驗方法代價較高，放射易衰變，且使用范圍有限。隨后，Sun等（2012， 2013）克隆出小菜蛾3個基因PxylPBP1、PxylPBP2和PxylPBP3，繼而分析其組織表達(dá)譜，并用熒光競爭結(jié)合實驗法證明了小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白（PxylPBP2）與Z9-14∶AC能特異性結(jié)合，氣味受體蛋白（PxylOR4）能靈敏地感應(yīng)Z9-14∶AC，但這種實驗方法不能精確知道PxylPBP2、Z9-14∶AC和PxylOR4相互作用的分子機(jī)制。由此可知，PxylPBP2、Z9-14∶AC和PxylOR4三者存在一定的對應(yīng)關(guān)系，但目前對昆蟲性信息素結(jié)合蛋白和受體蛋白的研究主要集中于對氣味分子的特異性識別方面（Wanner et al.，2007，2010；Carey et al.，2010）?！颈狙芯壳腥朦c】目前缺乏對小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白、性信息素、受體蛋白三者間相互作用的分子機(jī)制研究，對其結(jié)合理論的分析是研究三者間作用機(jī)制的有效手段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對小菜蛾性信息結(jié)合蛋白PxylPBP2和受體蛋白PxylOR4同源建模，運用分子對接和計算自由能（MM-PBSA）的方法分析PxylPBP2和PxylOR4與性信息素Z9-14∶AC間的作用力類型、結(jié)合的關(guān)鍵位點及自由能，為闡明小菜蛾感受性信息素的分子機(jī)制提供參考，也為進(jìn)一步開發(fā)高效、廣適的小菜蛾性誘劑并控制小菜蛾種群數(shù)量打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 PxylPBP2和PxylOR4三維模型建立及Z9-14∶AC分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建

從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中下載甜菜夜蛾P(guān)xylPBP2和PxylOR4序列，登錄號為AGH13203.1和AGK43826.1，三維結(jié)構(gòu)模型運用Discovery Studio 2.5中同源建模模塊進(jìn)行，主要包括從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）搜索同源蛋白，將目標(biāo)蛋白序列與模板蛋白序列對比，建立模型及模型的優(yōu)化和評估等。

Z9-14∶AC分子結(jié)構(gòu)運用ChemBioOffice 10.0程序包中ChemBioDraw模塊構(gòu)建配基初始結(jié)構(gòu)，再運用ChemBio3D模塊構(gòu)建其空間結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化優(yōu)化。

1. 2 分子對接

分別以PxylPBP2和PxylOR4為受體、Z9-14∶AC為配體，運用Discovery Studio 2.5軟件對其進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)對接，確定活性區(qū)域球的半徑，可能的構(gòu)象Pose（LibDock score>100），采用LibDock模塊收集，對接前對受體和配體進(jìn)行去水、加氫和計算電荷。對接復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行兩次優(yōu)化，先用最陡下降法優(yōu)化500步，再用共軛梯度法優(yōu)化1000步。

1. 3 對接復(fù)合物的統(tǒng)計分析

運用Ligplot+軟件分析對接復(fù)合物的分子間相互作用，統(tǒng)計受體和其相應(yīng)配體產(chǎn)生疏水作用力的關(guān)鍵氨基酸殘基。

1. 4 計算對接復(fù)合物自由能

運用分子力學(xué)泊松—波爾茲曼表面積法（Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area， MM- PBSA）計算本研究對象中對接復(fù)合物的結(jié)合自由能（Binding free energy，ΔGbind）（王棐等，2015）。ΔGbind與受體及其相應(yīng)配體的親和力呈負(fù)相關(guān)，MM-PBSA將對接復(fù)合物的自由能分解為溶劑化能、真空分子內(nèi)能及構(gòu)象變化引起的熵變值，計算公式如下：

ΔGbind=Gcomplex-Greceptor-Gligand

G=Gsolv+EMM-TSMM

Gsolv=GPB+GSUR

EMM=Eelec+EvdW

自由能分為氣相和液相兩部分，液相自由能即溶劑化能（Solvation energy，Gsolv），包括非極性溶劑化能（Non-polar solvation energy，GSUR）和極性溶劑化能（Polar solvation energy，GPB），由DS 2.5軟件的Calculate Energy（計算能量）模塊計算，Implicit Solvent Model（隱性溶劑模型）參數(shù)設(shè)置為Poisson-Boltzmann surface area（PBSA，波爾茲曼表面積），其他參數(shù)均為默認(rèn)值；氣相部分的自由能分解為熵變能（Entropy energy，TSMM）和分子力學(xué)能（Molecular mechanical energy，EMM），EMM為分子靜電相互作用力能（Electrostatic energy，Eelec）和范德華力能（Van der waals energy，EvdW）之和，把Implicit Solvent Model的參數(shù)設(shè)置為None（無），其他參數(shù)均為默認(rèn)值，TSMM的變化對自由能影響很小，計算中可忽略。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PxylPBP2和PxylOR4同源建模及Z9-14∶AC的分子結(jié)構(gòu)

經(jīng)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)兩個與PxylPBP2序列有較高相似性的模板（相似性高于30%），登錄號為1QWV和1DQE；兩個與PxylOR4序列有較高相似性的模板（相似性高于30%），登錄號為2IV2和3D7N。以上述模板為基礎(chǔ)進(jìn)行多源建模，構(gòu)建后結(jié)果顯示PxylPBP2結(jié)構(gòu)Verify Score為27.30，高于Verify Expected High Score（24.25）；PxylOR4結(jié)構(gòu)Verify Score為41.21，接近Verify Expected High Score（44.14），表明兩模型具有較高的可信度，Ramachandran Plot圖顯示氨基酸均在最適區(qū)域，經(jīng)動力學(xué)優(yōu)化后保存模型。Z9-14∶AC分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2. 2 分子對接和自由能計算

運用Lidock程序，Z9-14∶AC分別與PxylPBP2和PxylOR4對接。在PxylPBP2與Z9-14∶AC對接中，以X=

0.80、Y=-5.86、Z=0.05為活性位點中心，半徑為1.42 nm內(nèi)所有的子結(jié)構(gòu)作為活性口袋部分；在PxylOR4與Z9-14∶AC對接中，以X=80.65、Y=45.65、Z=33.98為活性位點中心，半徑為2.28 nm內(nèi)所有的子結(jié)構(gòu)作為活性口袋。Z9-14∶AC與PxylPBP2對接LibDockscore最高分為132.55，Z9-14∶AC與PxylOR4對接LibDockscore最高分為108.05，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2-A和圖3-A可以看出，Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4均在其袋狀腔內(nèi)結(jié)合，圖2-B和圖3-B為PxylPBP2和PxylOR4與Z9-14∶AC作用的二維圖，展示了與Z9-14∶AC發(fā)生作用的氨基酸殘基。由此可知，PxylPBP2與Z9-14∶AC作用有1個氫鍵形成（虛線），受體為O3，配體為Thr9∶HG1，鍵長為0.24 nm，而PxylOR4與Z9-14∶AC作用無氫鍵形成。

2. 3 Ligplot+分析對接復(fù)合物的疏水性氨基酸

將Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4對接復(fù)合物導(dǎo)入Ligplot+軟件，運算結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，PxylPBP2與Z9-14∶AC產(chǎn)生疏水作用氨基酸殘基14個，分別為Phe33、Phe12、Phe76、Ile94、Leu61、Leu8、Met114、His69、Val62、Met53、Ala56、Met68、Leu66和Thr111；PxylOR4與Z9-14∶AC產(chǎn)生疏水作用氨基酸殘基17個，分別為Leu135、Glu304、Leu320、Phe286、Ser290、Pro303、Arg300、Cys298、Val218、Leu192、Ala159、Gly160、Leu- 306、Val207、Gln158、Cys190和Ile272。分析這些氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)Z9-14∶AC更易與受體中的Leu產(chǎn)生疏水作用力，同時表明疏水作用力能有效促進(jìn)Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4結(jié)合。

2. 4 Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4對接復(fù)合物結(jié)合自由能計算結(jié)果

在對接過程中，配體和受體的結(jié)合穩(wěn)定程度由復(fù)合物的自由結(jié)合能決定，自由結(jié)合能越低，對接后的復(fù)合物越穩(wěn)定（Guang et al.，2012）。運用1.4中的方法計算Z9-14∶AC與PxylPBP2和PxylOR4對接復(fù)合物的自由能，結(jié)果顯示，Z9-14∶AC與PxylPBP2對接復(fù)合物自由能為-2.88 kcal/mol，Z9-14∶AC與PxylOR4對接自由能為-48.31 kcal/mol（表1），表明Z9-14∶AC與PxylOR4比與PxylPBP2的結(jié)合更加穩(wěn)定。

通過對兩種復(fù)合物自由能（表1）各組分拆解分析，發(fā)現(xiàn)Z9-14∶AC與PxylPBP2和與PxylOR4結(jié)合的驅(qū)動力有明顯差別，Z9-14∶AC與PxylPBP2結(jié)合過程中ΔEelec、ΔEvdW和ΔGSUR均為負(fù)值，表明靜電作用力、范德華力和非極性溶劑化能對受體和相應(yīng)配體的結(jié)合具有促進(jìn)作用，但靜電力是主要驅(qū)動力，極性溶劑化能對配體和受體的結(jié)合具有較強(qiáng)的抑制作用；Z9-14∶AC與PxylOR4的結(jié)合過程中ΔEvdW和ΔGSUR為負(fù)值，ΔEelec和ΔGPB為正值，表明范德華力和非極性溶劑化能為兩者結(jié)合的正驅(qū)動力，其中范德華力為主要作用力，靜電力和極性溶劑化能具有抑制兩者結(jié)合的功能，其中極性溶劑化能起主要作用。

3 討論

在昆蟲的信息感受機(jī)制中，首先通過氣味結(jié)合蛋白（包括性信息素結(jié)合蛋白）與氣味分子相互作用從而與外界進(jìn)行信息交流（Schulz，2005），疏水性的氣味分子與親水性的氣味結(jié)合蛋白結(jié)合后，穿過昆蟲感受器淋巴液，并將其運送至感覺神經(jīng)元膜上的氣味受體（Nakagawa et al.，2005）。在這個過程中，氣味結(jié)合蛋白很可能對氣味分子進(jìn)行初步篩選后再進(jìn)行運輸，而特異性識別氣味分子主要由氣味受體蛋白完成（Vosshall et al.，1999；Zwiebel and Takken，2004）。目前，對昆蟲感受氣味分子、刺激氣味受體主要存在兩種預(yù)測方式：一是氣味結(jié)合蛋白和氣味分子形成復(fù)合體刺激，二是氣味結(jié)合蛋白將氣味分子釋放后再由氣味分子單獨刺激，但這些理論均建立在間接證據(jù)之上，沒有確鑿的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果支撐。本研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾性信息素Z9-14∶AC與性信息素結(jié)合蛋白PxylPBP2結(jié)合的自由能（-2.88 kcal/mol）遠(yuǎn)高于Z9-14∶AC與受體蛋白PxylOR4結(jié)合的自由能（-48.31 kcal/mol），說明前者的結(jié)合能力遠(yuǎn)低于后者，即性信息素結(jié)合蛋白對性信息素結(jié)合能力遠(yuǎn)低于受體蛋白對性信息素的結(jié)合能力。這為證明識別氣味分子主要是由氣味受體蛋白完成的推測提供了直接證據(jù)。

信息素分子與信息素結(jié)合蛋白結(jié)合位點上的氨基酸發(fā)生相互作用，氨基酸親水性和帶電性間的相互作用可能是導(dǎo)致配基特異結(jié)合的原因（Sandler et al.，2000）。本研究分析了PxylPBP2和PxylOR4中與Z9-14∶AC產(chǎn)生疏水作用的氨基酸殘基和氫鍵，PxylPBP2與Z9-14∶AC作用產(chǎn)生1個氫鍵，PxylOR4與Z9-14∶AC無氫鍵產(chǎn)生。氫鍵具有穩(wěn)定性、方向性和飽和性，可以增強(qiáng)化合物穩(wěn)定性（王海燕等，2005），但結(jié)果顯示含有氫鍵復(fù)合物的結(jié)合能力遠(yuǎn)低于不含有氫鍵的復(fù)合物，說明氫鍵的作用具有局限性，配體與受體的結(jié)合可能是受結(jié)合腔內(nèi)多種作用力共同作用的結(jié)果（李紅亮等，2013）。從結(jié)合自由能的各組分拆解分析可知，PxylPBP2和PxylOR4與Z9-14∶AC的機(jī)制存在差異，首先兩者的主要驅(qū)動力不同，靜電力為PxylPBP2與Z9-14∶AC結(jié)合的主要驅(qū)動力，但對PxylOR4與Z9-14∶AC的結(jié)合有一定的抑制作用；范德華力是PxylOR4與Z9-14∶AC結(jié)合的主要驅(qū)動力，且對PxylPBP2和Z9-14∶AC的結(jié)合也有一定的促進(jìn)作用，與眾多文獻(xiàn)的報道一致（Novotny et al.，1997；Chong et al.，1999），分析還發(fā)現(xiàn)溶劑化能對兩者均有較強(qiáng)的抑制作用，這些因素可能是形成兩種蛋白均能結(jié)合性信息素的依據(jù)，但結(jié)合能力存在差異。其他更精細(xì)的研究如蛋白中單個氨基酸殘基在結(jié)合過程中的作用還需通過分子動力學(xué)分析來完成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，小菜蛾性信息素受體蛋白和性信息素結(jié)合蛋白對性信息素的識別和結(jié)合力存在明顯差異，性信息素受體蛋白對性信息素反應(yīng)更靈敏、形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。性信息素結(jié)合蛋白與性信息素結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸是Thr9，主要驅(qū)動力是靜電力能；性信息素受體蛋白與性信息素結(jié)合的主要驅(qū)動力是范德華力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）