李憶 尹全 劉勇

摘要：【目的】建立多重PCR檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45的方法，為其轉(zhuǎn)基因檢測提供技術(shù)支持?！痉椒ā窟x擇油菜內(nèi)源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作為四重PCR檢測基因，特異性引物序列參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)，通過對多重PCR退火溫度和引物濃度的優(yōu)化、靈敏度測試及已知樣品驗(yàn)證，建立抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45多重PCR檢測體系。【結(jié)果】多重PCR的適宜退火溫度為58 ℃，適宜引物終濃度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat為0.1∶0.2∶0.2∶0.2，方法靈敏度為0.01 ng/μL，所有已知樣品的擴(kuò)增條帶與其分子特征顯示的外源基因元件完全一致?！窘Y(jié)論】建立的抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45品系四重PCR檢測方法可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45內(nèi)源參照基因和多個(gè)外源基因成分，為轉(zhuǎn)基因油菜T45提供了一種有效的檢測手段。

關(guān)鍵詞： 油菜；多重PCR；毛細(xì)管電泳；分子檢測

中圖分類號： S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0883-06

0 引言

【研究意義】抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45由德國拜耳公司研發(fā)，其轉(zhuǎn)入基因表達(dá)抗草銨膦除草劑的活性成分。T45品系已先后在澳大利亞、加拿大、日本和美國被批準(zhǔn)環(huán)境釋放，并在我國、歐盟、韓國等8個(gè)國家和地區(qū)被批準(zhǔn)用于食品或飼料加工原料。油菜籽是我國重要的食用植物油原料和飼料蛋白源，但由于供給長期處于短缺狀態(tài)，我國每年進(jìn)口油菜籽達(dá)千萬噸，其中60%以上為轉(zhuǎn)基因油菜籽（張麗等，2012）。除抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45外，我國還允許抗蟲轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS1等9個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品系進(jìn)口用作加工原料。隨著轉(zhuǎn)基因商業(yè)化產(chǎn)品不斷增多，其安全性問題受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注，許多國家和地區(qū)制定并實(shí)施了相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度（金蕪軍等，2004），而轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的科學(xué)執(zhí)行就必須依托快速、有效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。因此，建立快速、有效的轉(zhuǎn)基因檢測體系對提高檢測效率和降低檢測成本及加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全管理均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，轉(zhuǎn)基因特異PCR檢測有4個(gè)不同的策略，包括篩選檢測、基因特異檢測、結(jié)構(gòu)特異檢測和轉(zhuǎn)化事件特異檢測。Yang等（2006）通過TAIL-PCR克隆找到了T45油菜5'端寄主植物的DNA與轉(zhuǎn)化載體間的連接序列，再利用轉(zhuǎn)化事件特異檢測策略分別建立了定性和定量檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45方法。聶淑晶（2008）通過基因組步移文庫建立，分離T45油菜左邊界（3'端）及右邊界（5'端）寄主植物的DNA與轉(zhuǎn)化載體間的連接序列，再利用轉(zhuǎn)化事件特異檢測策略分別建立了左邊界和右邊界的定性和定量檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45方法。申愛娟等（2014）應(yīng)用溫度不對稱PCR（TAIL-PCR）擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因油菜W-4 T-DNA插入位點(diǎn)的左、右旁側(cè)序列，依據(jù)左、右邊界旁側(cè)序列和轉(zhuǎn)基因載體的T-DNA左右邊界序列設(shè)計(jì)2對特異性引物TLF/TLR和TRF/TRR，從W-4基因組DNA中擴(kuò)增出大小分別為485和405 bp的預(yù)期產(chǎn)物，據(jù)此建立了W-4的轉(zhuǎn)基因事件特異性PCR檢測技術(shù)。多重PCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的應(yīng)用也非常廣泛，白月等（2011）用復(fù)合PCR結(jié)合DHPLC檢測了番茄中的轉(zhuǎn)基因成分，建立的多重PCR-DHPLC操作簡便，快速準(zhǔn)確，能夠同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因番茄4個(gè)內(nèi)、外源基因，檢測限達(dá)0.5 ng/μL；何瑋玲等（2012）利用多重 PCR建立了食品中 4種肉類成分的快速鑒別方法；崔學(xué)強(qiáng)等（2015）建立了多重PCR鑒定傷口中3種致病菌的方法。【本研究切入點(diǎn)】目前，多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)在轉(zhuǎn)基因玉米及食品轉(zhuǎn)基因成分檢測中已有相關(guān)研究，但在轉(zhuǎn)基因油菜T45檢測方面未見報(bào)道。雖然相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和國家標(biāo)準(zhǔn)中已有抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45轉(zhuǎn)化事件特異檢測方法，但尚未見針對轉(zhuǎn)化事件中的多個(gè)外源基因進(jìn)行多重PCR并結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測的技術(shù)方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45插入的基因元件，擬建立一種包括油菜內(nèi)源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat的四重PCR檢測技術(shù)體系，通過對多重PCR體系的退火溫度、4對引物終濃度配比及方法靈敏度進(jìn)行優(yōu)化，并利用已知樣品對檢測體系進(jìn)行驗(yàn)證，為抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因油菜籽T45粉末（含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2種子粉末（含P-CaMV 35S基因，不含CruA、T-CaMV 35S和pat基因）、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11種子粉末（含P-CaMV 35S和pat基因，不含CruA和T-CaMV 35S基因）、轉(zhuǎn)基因油菜籽GT73粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉(zhuǎn)基因油菜籽MS8粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1種子粉末（不含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所保存并提供。植物基因組提取試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量（M）購自天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購自日本東洋紡（TOYOBO）株式會(huì)社；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1. 2 引物序列

依據(jù)抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45的分子特征信息，選擇油菜內(nèi)源參照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作為四重PCR技術(shù)體系的檢測基因，特異性引物序列參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。將各條引物濃度稀釋至10 μmol/L備用。

1. 3 樣品DNA提取

樣品DNA提取按照天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作，測定樣品DNA濃度并判斷質(zhì)量。

1. 4 四重PCR的建立

1. 4. 1 單基因特異性 反應(yīng)體系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，上、下游引物各1.00 μL，樣品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸3 min，4 ℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對結(jié)果進(jìn)行分析。

1. 4. 2 四重PCR條件優(yōu)化 利用以下體系和程序?qū)λ闹豍CR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，4組上、下游引物各0.25 μL，樣品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度設(shè)置6個(gè)梯度，分別為50、54、56、58、60和64 ℃，時(shí)間均為30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對結(jié)果進(jìn)行分析，選擇適合的退火溫度。

利用以下體系和程序?qū)λ闹豍CR引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系25.00 μL，包括東洋紡2×Master Mix 12.50 μL，4對引物終濃度按照表2設(shè)置引物濃度梯度，模板DNA 2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。擴(kuò)增程序選擇退火溫度優(yōu)化后確定的程序。反應(yīng)產(chǎn)物采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對結(jié)果進(jìn)行分析，選擇適合的引物濃度配比。

1. 5 四重PCR方法靈敏度檢測

將基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，使每個(gè)反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)基因油菜T45基因組DNA的濃度分別為0.02、0.01、0.005、0.003、0.001和0.0005 ng/μL，利用四重PCR試驗(yàn)優(yōu)化后的檢測體系進(jìn)行方法靈敏度檢測試驗(yàn)。

1. 6 已知樣品驗(yàn)證

利用四重PCR試驗(yàn)優(yōu)化后的檢測體系，對已知樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 樣品DNA提取

樣品總DNA濃度和質(zhì)量通過NanoDrop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度計(jì)測定，所有樣品OD260/OD280范圍在1.8～2.0，OD260/OD230大于2.0，濃度均大于25 ng/μL，說明樣品DNA的質(zhì)量和濃度能滿足PCR擴(kuò)增要求。最后將樣品DNA的濃度稀釋至25 ng/μL備用。

2. 2 四重PCR單基因特異性驗(yàn)證

單基因特異性驗(yàn)證結(jié)果（圖1）表明，引物序列分別對4個(gè)目的基因片段的擴(kuò)增具有特異性，無非特異性條帶出現(xiàn)。選擇的引物可用于4個(gè)目的基因片段的多重PCR檢測體系研究。

2. 3 四重PCR條件的優(yōu)化

退火溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，選擇的50～60 ℃溫度梯度均可擴(kuò)增到目的條帶，在64 ℃條件下，T-CaMV 35S基因片段未能擴(kuò)增出條帶。其中，在50 ℃條件下出現(xiàn)了多條非特異性條帶；在60 ℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的片段擴(kuò)增效率明顯低于其他3個(gè)基因片段，基因片段間擴(kuò)增效率不一致。在其他3個(gè)退火溫度條件下均可擴(kuò)增到目的基因條帶，盡管均出現(xiàn)一條540 bp大小的非特異條帶，但并不影響對其他目的基因片段的識(shí)別，在考慮所有目的基因片段擴(kuò)增效率和單基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度等情況下，最終確定四重PCR反應(yīng)的退火溫度為58 ℃。

引物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，各引物終濃度按照方案④配比時(shí)，各目的基因片段的擴(kuò)增效率相對一致；而其他幾種引物濃度配比方案結(jié)果均不理想，目的基因片段存在無擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不一致等現(xiàn)象。最終確定最優(yōu)化的引物終濃度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat為0.1∶0.2∶0.2∶0.2。

2. 4 四重PCR靈敏度

通過四重PCR靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果（圖4）顯示，在模板總量不低于0.01 ng/μL時(shí)，均可有效擴(kuò)增出4個(gè)目標(biāo)片段。當(dāng)模板總量低至0.005 ng/μL時(shí)，雖然幾個(gè)基因片段均能得到擴(kuò)增，但外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat片段擴(kuò)增量太小，條帶模糊。因此，確定四重PCR檢測體系的靈敏度為0.01 ng/μL。

2. 5 已知樣品驗(yàn)證

采用建立的四重PCR對已知樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖5）表明，T45檢出CruA（151 bp）、P-CaMV 35S（195 bp）、T-CaMV 35S（134 bp）和pat（262 bp）基因片段，GTS40-3-2檢出P-CaMV 35S（195 bp）基因片段，Bt11檢出P-CaMV 35S（195 bp）和pat（262 bp）基因片段， GT73檢出CruA（151 bp）基因片段，MS8檢出CruA（151 bp）基因片段，TT51-1無任何基因片段，所有樣品擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期的基因元件分子特征一致。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的四重PCR檢測方法具有可靠性。

3 討論

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)主要有蛋白質(zhì)和核酸檢測兩類，核酸檢測技術(shù)中運(yùn)用較多的是普通PCR，其具有敏感、快速、簡便的特點(diǎn)，主要用于檢測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中的單個(gè)外源基因（張富麗等，2009；尹全等，2010）。在產(chǎn)品檢測時(shí)，通常需要檢測多個(gè)外源基因以確認(rèn)其所含轉(zhuǎn)基因成分及是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，采用普通PCR分別對這些外源基因進(jìn)行檢測時(shí)存在時(shí)間和試劑耗費(fèi)大、操作繁瑣等缺點(diǎn)（鄭景生和呂蓓，2003）；多重PCR只需一個(gè)反應(yīng)和一次電泳即可同時(shí)檢出多個(gè)目的基因片段，可極大地節(jié)約試劑并節(jié)省時(shí)間（邵碧英和陳文炳，2005）。在毛細(xì)管電泳結(jié)合多重PCR檢測分析研究方面，周穎等（2007）采用無膠篩分毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)對三重PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測，建立了多重PCR-毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)熒光快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米的新方法；張春嬌等（2011）采用毛細(xì)管電泳—紫外檢測方法分析了轉(zhuǎn)基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特異性基因多重PCR產(chǎn)物，建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系特異毛細(xì)管電泳—紫外檢測方法。本研究利用毛細(xì)管瓊脂糖預(yù)制膠電泳技術(shù)對多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，建立了四重PCR毛細(xì)管電泳檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45方法，節(jié)約了模板和試劑，并縮短了檢測時(shí)間，具有高效、快速、靈敏且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。

在建立體系的過程中，考慮到不同引物序列對PCR結(jié)果存在較多影響，本研究優(yōu)先選擇現(xiàn)有國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的引物，這些引物均經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)及多方驗(yàn)證，至少單基因PCR可得到保障，有利于多重PCR試驗(yàn)的進(jìn)一步開展。引物濃度配比及退火溫度依據(jù)目的條帶特異、引物二聚體少，各基因片段擴(kuò)增效率相對一致的要求（Henegariu et al.，1997），最終確定了四重PCR檢測體系的適宜引物濃度配比和退火溫度。利用建立的四重PCR檢測體系進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，最終確定本體系的檢測靈敏度為0.01 ng/μL，略高于Yang等（2006）建立的轉(zhuǎn)化體檢測方法和農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心牽頭制定的國家標(biāo)準(zhǔn)，其原因可能是多對引物在反應(yīng)體系中對模板產(chǎn)生競爭而導(dǎo)致檢測靈敏度有所下降。

本研究在綜合考慮擴(kuò)增效率和簡化試驗(yàn)優(yōu)化步驟等前提下，選擇Master Mix PCR試劑，而未選擇DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+單獨(dú)包裝的PCR試劑。但從檢測方法實(shí)用性考慮，下一步可利用DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+單獨(dú)包裝的PCR試劑對檢測體系進(jìn)行優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究建立的抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45品系四重PCR檢測方法可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜T45內(nèi)源參照基因和多個(gè)外源基因成分，有效簡化了操作步驟，縮短了檢測時(shí)間并提高了檢測效率，為轉(zhuǎn)基因油菜T45提供了一種有效的檢測手段。

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The Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China. 2012b. The MOA Announcement No.1782-6-2012：Detection of Genetically Modified Plants and Derived Products—Qualitative PCR Method of bar or pat Gene[S]. Beijing：China Standard Publishing House.

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（責(zé)任編輯 王 暉）