代燕麗 沈維治 廖森泰 劉凡 王思遠(yuǎn) 胡根騰 鄒宇曉

摘 要 以‘粵椹大10品種的桑葉粉為原料，選擇乙醇濃度、料液質(zhì)量濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲次數(shù)等5個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)，在這個(gè)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平的實(shí)驗(yàn)，得到桑葉多酚提取的最佳工藝參數(shù)。最終得出的最佳提取工藝條件為：提取次數(shù)1次、超聲功率400 W、乙醇濃度70%（V/V）、料液質(zhì)量濃度0.030 g/mL、超聲時(shí)間60 min，在此條件下桑葉多酚含量為8.33 mg/g。此結(jié)果的模型適合桑葉多酚超聲波提取，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 桑葉多酚；超聲波；提?。豁憫?yīng)面；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào) TQ461；S888 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The leaf powder of the mulberry variety‘Yueshen Da 10was used as the material. The box Behnken design was used to establish a quadric regression equation for predicting the yield of total polyphenols based on five factors including ethanol concentration， solid to solution ratio， ultrasonic treatment time， ultrasonic treatment power and ultrasonic treatment times. The optimized extraction conditions with a polyphenol yield of 8.33 mg/g were ethanol concentration 70%（V/V）， solid to solution ratio 0.030 g/mL， ultrasonic treatment time 60 min under ultrasonic treatment power 400 W for one time. The results of the model is fit for mulberry leaf polyphenol extraction and can be used in actual production.

Key words Mulberry leaf polyphenol； Ultrasonic； Extraction； Response surface methodology； Process optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.023

桑葉，為桑屬（Morus L.）?？浦参锏娜~，在全國大部分地區(qū)都有生產(chǎn)，品種資源極其豐富?，F(xiàn)在研究證明，桑葉除了可用于蠶屬養(yǎng)殖外，在眾多領(lǐng)域都具有價(jià)值。而桑葉本身具有抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、及抗癌等藥理活性，其中最主要的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]就是含有豐富的植物多酚，像綠原酸、蘆丁、安息香酸等單體酚類化合物的含量最為突出。沈維治等[2]已經(jīng)做過有關(guān)桑葉多酚的含量與體外抗氧化能力的研究，研究證明桑葉多酚的抗氧化能力的生物活性與總多酚含量的相關(guān)性都達(dá)到極顯著水平（p<0.01），表明桑葉總多酚是桑葉抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。由此，提高桑葉多酚的提取含量，對(duì)獲得更高生物活性的物質(zhì)具有一定意義。超聲波輔助提取技術(shù)具有強(qiáng)大的超聲波能量，可以破碎植物細(xì)胞，改變?cè)系奈锘匦?，加速目?biāo)物質(zhì)的溶出[3]，是一種便捷、高效的提取方法，有研究報(bào)道超聲設(shè)備的功率和時(shí)間與提取產(chǎn)物的組成和數(shù)量密切相關(guān)[4-5]。目前，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取桑葉多酚的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將研究超聲波輔助法提取桑葉多酚工藝條件中料液質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲功率等因素對(duì)桑葉多酚提取含量的影響，并通過響應(yīng)面方法進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果能為桑葉資源的高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 ‘粵椹大10品種，于2015年3月中旬在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地桑園采收?？刂茻犸L(fēng)干燥箱溫度為60 ℃，將樣品烘干至恒定重量，中藥粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，-20 ℃陰暗環(huán)境貯藏備用。

1.1.2 試劑 Folin-Ciocalteu 試劑購自廣州市齊蕓生物技術(shù)有限公司，無水碳酸鈉、無水乙醇、沒食子酸等試劑都為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.1.3 儀器 永康市敏業(yè)工貿(mào)有限公司的百麗福-150中藥粉碎機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，寧波新芝生物科技股份有限公司的SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)，蘇州賽恩斯儀器有限公司的Thermo賽默飛世爾冷凍高速離心機(jī)Sorvall Strato，日本島津的UV-1800紫外分光光度計(jì)，上海愛朗儀器有限公司的EYELA-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用Folin-Ciocalteu[6]法以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，去離子水定容至100 mL，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品母液。將母液進(jìn)行稀釋，配成濃度為4、6、8、10、12、14、16 μg/mL濃度的10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液、2 mL的10% Na2CO3溶液、1 mL福林-酚試劑振蕩混勻[7]，避光常溫反應(yīng)1 h，在765 nm波長(zhǎng)處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定混合反應(yīng)液的吸光度，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，取其平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）、吸光度（OD）為X軸和Y軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程和回歸系數(shù)。

1.2.2 桑葉多酚提取方法 準(zhǔn)確稱取貯藏備用的‘粵椹大10桑葉粉加入不同濃度的乙醇，混合均勻后置入超聲環(huán)境（SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)）下提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，用容量瓶定容到一定體積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的檢測(cè)方法檢測(cè)其中的多酚含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 分別研究乙醇濃度[50%、60%、70%、80%、90%（V/V），固定料液質(zhì)量濃度為0.025 g/mL、超聲時(shí)間45 min、超聲功率400 W、提取1次]、料液質(zhì)量濃度（0.020、0.025、0.030、0.035、0.04 g/mL，固定乙醇濃度70%、超聲時(shí)間45 min、超聲功率400 W、提取1次）、超聲時(shí)間（15、30、45、60、75 min，固定乙醇濃度70%、料液質(zhì)量濃度0.03 g/mL、超聲功率400 W、提取1次）、超聲功率（100、200、300、400、500 W，固定乙醇濃度70%、料液質(zhì)量濃度0.03 g/mL、超聲時(shí)間60 min、提取1次）、提取次數(shù)（1、2、3次，固定乙醇濃度70%、料液質(zhì)量濃度0.03 g/mL、超聲時(shí)間60 min、超聲功率400 W）對(duì)桑葉多酚提取率的影響。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5個(gè)單因素試驗(yàn)，為后面響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 經(jīng)過單因素試驗(yàn)研究，選出對(duì)桑葉多酚含量影響合適的因素和水平，根據(jù)Box-Benhnken原理，用軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化，獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到最佳提取條件后并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Tukey HSD差異顯著性分析（p<0.05表示差異顯著）。采用Expert-Design8.0.6分析響應(yīng)面優(yōu)化的數(shù)據(jù)建立回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）吸光度（765 nm）為橫縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程與回歸系數(shù)（圖1）?；貧w方程為：y=0.053 1x+0.024 7，R2=0.999 3，表明沒食子酸濃度與吸光度在0～20 μg/mL范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)桑葉多酚提取含量的影響 由圖2可知，乙醇濃度對(duì)桑葉多酚提取含量的影響是呈規(guī)律性變化的，在乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，桑葉提取物多酚含量最高。在70%濃度以后，桑葉多酚提取含量逐漸降低，可能是因?yàn)槿軇]發(fā)量增大，使桑葉粉得不到充分溶解，還有就是有部分醇溶性雜質(zhì)溶出增加，干擾多酚化合物浸出。因此，乙醇濃度過低或過高均不利于桑葉多酚的提取，綜合生產(chǎn)成本和提取得率，選擇60%、70%、80% 這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 料液質(zhì)量濃度對(duì)桑葉多酚提取含量的影響

從圖3可知，料液質(zhì)量濃度對(duì)桑葉多酚含量的影響在0.030 g/mL時(shí)達(dá)到峰值，之后再增加料液質(zhì)量濃度桑葉多酚含量逐漸降低，可能是溶劑體積一旦增大，其他一些可溶性的雜質(zhì)溶解的量也逐漸增大，使得多酚提取含量減少。因此，選擇料液質(zhì)量濃度0.025、0.030、0.035 g/mL 這3個(gè)水平進(jìn)行進(jìn)一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)桑葉多酚提取的影響 從圖4可以看出，在超聲時(shí)間60 min之前，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，桑葉多酚含量增加，當(dāng)超聲時(shí)間到60 min以后再延長(zhǎng)時(shí)間，多酚含量基本不變或有所降低，可能是因?yàn)槌暡◤?qiáng)大的機(jī)械剪切作用對(duì)多酚類物質(zhì)造成破壞所致[8]，還有隨著超聲時(shí)間越來越長(zhǎng)，更多其他非多酚類雜質(zhì)的溶出影響了多酚的提取。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取45、60、75 min 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.4 超聲功率對(duì)桑葉多酚提取的影響 從圖5可以看出，超聲波功率對(duì)桑葉多酚含量的影響從100 W到400 W是逐漸上升的，之后再增加超聲波功率，桑葉多酚含量基本保持不變。從節(jié)省能源的角度選擇400 W的超聲功率進(jìn)行提取。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)桑葉多酚提取的影響 從圖6可以看出，提取次數(shù)對(duì)桑葉多酚提取含量影響不大，基本上沒有影響。提取1次后桑葉多酚含量已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定，提取次數(shù)再增加，桑葉多酚含量也不會(huì)有太大增加。因此選擇1次提取次數(shù)，這個(gè)因素不應(yīng)用于響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)選擇的三因素三水平 綜合以上單因素試驗(yàn)，采用Expert-Design8.0.6軟件將料液質(zhì)量濃度、乙醇濃度、超聲時(shí)間3個(gè)對(duì)桑葉多酚提取含量影響較大的因素做響應(yīng)面優(yōu)化，確定相應(yīng)的3水平（表1）并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，得到最優(yōu)提取方法。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，得到桑葉多酚最優(yōu)提取方案及結(jié)果（表2），回歸方程和方差分析結(jié)果（表3）。桑葉多酚超聲提取的回歸方程為：

y=8.33-0.17x1+0.045x2+0.056x3-0.28x1x2-0.22x1x3-0.11x2x3-0.62x12-0.4x22-0.23x32

式中x1為乙醇濃度，x2為料液質(zhì)量濃度，x3為超聲時(shí)間，y為多酚含量。

由表3可知，失擬項(xiàng)P=0.241 2不顯著，模型p<0.0001，說明模型方程回歸顯著，擬合程度較好。料液質(zhì)量濃度、超聲時(shí)間、料液質(zhì)量濃度超聲時(shí)間的交互作用不顯著，但其他相均顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.960 5，表明自變量與相應(yīng)值之間的關(guān)系顯著。綜合上述分析，3個(gè)因素對(duì)桑葉總酚提取都是極顯著的影響（p<0.01）。

2.3.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)回歸方程的結(jié)果，可以繪制出對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面分析圖，直觀反映各因子的交互作用。從圖7立體圖中可以看出，乙醇濃度的變化曲面較陡，說明乙醇濃度對(duì)桑葉多酚含量影響大，與回歸方程得到的結(jié)果一致。從圖7的等高線圖可以看出，軸向乙醇濃度相對(duì)于料液質(zhì)量濃度等高線密集，表明乙醇濃度對(duì)桑葉多酚含量影響較大，而料液質(zhì)量濃度對(duì)桑葉多酚含量影響小。兩者交互作用圍成的等高線呈橢圓形，且等高線最小橢圓的中心在所選范圍之內(nèi)，表明響應(yīng)值（桑葉多酚提取含量）在3個(gè)因子設(shè)計(jì)的范圍存在最大值[9]。圖8中的乙醇濃度和超聲時(shí)間的交互作用顯示，隨著乙醇濃度增大和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，桑葉多酚提取含量先升高后降低，在乙醇濃度接近70%，超聲時(shí)間60 min時(shí)的橢圓中心達(dá)到最大值，從而可以得出，保持適宜的乙醇濃度和超聲時(shí)間有利于促進(jìn)桑葉多酚的提?。欢偷雀呔€密集程度來看，超聲時(shí)間比乙醇濃度對(duì)桑葉多酚提取含量的影響小。圖9中的料液質(zhì)量濃度和超聲時(shí)間的交互作用顯示，隨著料液質(zhì)量濃度增加和超聲時(shí)間延長(zhǎng)，桑葉多酚的提取含量先升高后降低，在橢圓的中心位置料液質(zhì)量濃度為0.030 g/mL、超聲時(shí)間60 min時(shí)，提取含量達(dá)到最大，而料液質(zhì)量濃度和超聲時(shí)間的變化曲面相對(duì)平緩，說明這兩個(gè)因素對(duì)桑葉多酚含量影響不大，與上邊方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 確定最佳工藝條件 通過響應(yīng)面分析，實(shí)際中，桑葉多酚提取的多酚含量最高是8.35 mg/g，表4可見，此含量下對(duì)應(yīng)的各因素條件為：乙醇濃度68.10%、料液質(zhì)量濃度0.030 g/mL、超聲時(shí)間62.78 min。結(jié)合實(shí)際的操作條件，將最佳的工藝條件調(diào)整為：乙醇濃度70%、料液質(zhì)量濃度0.030 g/mL、超聲時(shí)間60 min，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到多酚含量為8.33 mg/g，與理論值非常接近。

3 討論

響應(yīng)面分析法是根據(jù)多元二次回歸方程作為函數(shù)估算工具，擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)[10]。近年來，許多活性成分如多糖[11]、多酚[12]、花色苷[13]等的提取是運(yùn)用響應(yīng)面分析法輔助傳統(tǒng)有機(jī)溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中利用超聲波、微波等輔助提取植物活性物質(zhì)成分，有效提高了生產(chǎn)效率和提取率。其中超聲波輔助提取法[14]是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的物理效應(yīng)[15]，使溶劑內(nèi)所有的分子振動(dòng)頻率增加，加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，提高目標(biāo)成分的提取率。

植物多酚包括可溶性酚和不溶性酚，組成復(fù)雜，在植物組織中的分布存在很大差異，因此提高桑葉多酚的提取含量應(yīng)考慮到多個(gè)方面。前人在桑葉多酚提取工藝方面已經(jīng)有一些研究報(bào)道，楊上鶯等[16]用正交設(shè)計(jì)的方法考察了桑葉多酚的制備工藝，該法與響應(yīng)面法相比具有試驗(yàn)方法繁雜、精度偏低等局限性。丁雙華等[17]利用響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉多酚的乙醇浸提工藝，采用的是普通提取方法，未用到超聲波輔助提取，而普通提取方法繁瑣復(fù)雜，操作起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究正是綜合響應(yīng)面以及超聲輔助提取的各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，以超聲時(shí)間、超聲功率、料液質(zhì)量濃度、提取溶劑等作為考察指標(biāo)，全方位綜合試驗(yàn)得到桑葉多酚提取的最佳工藝條件。

通過單因素試驗(yàn)，選擇對(duì)多酚含量影響較大的因素，通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案并進(jìn)行試驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果建立桑葉多酚超聲提取回歸方程，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果證明該模型的擬合度好。響應(yīng)面圖分析得出，乙醇濃度極顯著的影響桑葉多酚的提取含量，而料液質(zhì)量濃度和超聲時(shí)間對(duì)其影響不顯著。乙醇濃度和料液質(zhì)量濃度兩兩交互作用、乙醇濃度和超聲時(shí)間兩兩交互作用對(duì)桑葉多酚的含量影響顯著。

實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果明確并簡(jiǎn)化了桑葉多酚的提取工藝，能更好的提供生物活性高的植物多酚樣品，并為以后批量生產(chǎn)桑葉多酚提供理論依據(jù)，提高桑葉的利用率。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助桑葉多酚提取工藝，得到最佳提取工藝為：乙醇濃度為70%，料液質(zhì)量濃度為0.030 g/mL，超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為400 W，提取1次，桑葉多酚提取含量為8.33 mg/g，達(dá)到理論預(yù)測(cè)值的98.8%，表明建立的二次數(shù)學(xué)模型對(duì)桑葉多酚提取工藝條件擬合度好。

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