楊方玉, 張波, 涂敏, 丁小維, 鄧百萬(wàn), 陳文強(qiáng), 劉開(kāi)輝

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.漢中市第八中學(xué)， 陜西 漢中 723000)

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七葉樹(shù)內(nèi)生真菌的分離及活性研究

楊方玉1, 張波1, 涂敏2, 丁小維1, 鄧百萬(wàn)1, 陳文強(qiáng)1, 劉開(kāi)輝1

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.漢中市第八中學(xué)， 陜西 漢中 723000)

[摘要]利用組織培養(yǎng)法，從秦嶺紫柏山七葉樹(shù)莖段中分離得到45株內(nèi)生真菌，通過(guò)真菌形態(tài)特征和ITS序列分析，將其鑒定到7個(gè)屬如鏈格孢屬(Alternaria)、鬼傘屬(Coprinellus)、枝孢屬(Cladosporium)及頸點(diǎn)霉屬(Phoma)等。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法、高效液相(HPLC)及質(zhì)譜(MS)方法檢測(cè)表明，菌株SL-6的代謝產(chǎn)物中存在七葉皂苷類(lèi)化合物。抑菌活性試驗(yàn)顯示，菌株SL-6的發(fā)酵液對(duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)及棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)植物病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。

[關(guān)鍵詞]七葉樹(shù)；內(nèi)生真菌；生物活性

內(nèi)生真菌是指在其生活史的全部或某一階段生活在健康植物組織中，而對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯的外部特征或病害癥狀的微生物[1]。自從1993年Stierle等[2]報(bào)道從短葉紅豆杉的韌皮部分離到的一株內(nèi)生真菌——安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)，可產(chǎn)生與宿主相同的抗腫瘤代謝產(chǎn)物紫杉醇以來(lái)，植物內(nèi)生真菌的研究已經(jīng)成為微生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。目前，特別是從藥用植物中獲得了大量的內(nèi)生真菌，一些內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)生具有生物活性的天然產(chǎn)物例如喜樹(shù)堿[3-4]、紫杉醇及長(zhǎng)春新堿等[5]。以前的文獻(xiàn)報(bào)道表明，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物，并表現(xiàn)出抗炎[6]、抗癌[7]、免疫抑制[8]及抗蟲(chóng)生物功能[9]。因此，內(nèi)生真菌被認(rèn)為是產(chǎn)生具有生物活性次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源之一[10]。

盡管植物內(nèi)生真菌廣泛存在于自然界，但不同種屬真菌的分布具有宿主植物及其組織的特異性，至今許多藥用植物內(nèi)生真菌還未被分離[11-12]。因此，研究藥用植物內(nèi)生真菌有助于發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)生真菌菌種和新的活性化合物。七葉樹(shù)(A.chinensis)又叫梭欏樹(shù)，為無(wú)患子目(Sapindales)，七葉樹(shù)科(Hippocastanaceae)，七葉樹(shù)屬(AesculusLinn.)的落葉喬木，其干燥成熟種子“娑羅子”為常見(jiàn)中藥材，主要活性成分為七葉皂苷A、B、C、D共4類(lèi)組份，根據(jù)德國(guó)DAC定義，七葉皂甙A、B又稱(chēng)β-七葉皂苷，七葉皂甙C、D又稱(chēng)α-七葉皂苷，α-七葉皂苷和β-七葉皂苷是七葉皂苷的異構(gòu)體。七葉皂苷類(lèi)化合物有顯著的消炎、抗?jié)B出、化瘀血的作用，能提高毛細(xì)血管張力，具有控制水腫、改善血液循環(huán)和調(diào)節(jié)胃腸道的功能[13-15]，因此被廣泛應(yīng)用于臨床治療中。然而，目前關(guān)于七葉皂苷的研究主要集中在化學(xué)分離提取及臨床應(yīng)用方面，有關(guān)七葉樹(shù)內(nèi)生真菌的研究報(bào)道較少。本研究分離了秦嶺七葉樹(shù)內(nèi)生真菌，挖掘出產(chǎn)七葉皂甙化合物的真菌及抗菌活性菌株，將為七葉樹(shù)內(nèi)生真菌的利用提供重要的種質(zhì)資源。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)器材

1.1.1試驗(yàn)材料

用于內(nèi)生真菌分離的植物莖段采自秦嶺紫柏山森林地帶(33°40′55″N，106°49′45″E)的多年生七葉樹(shù)(A.chinensis)。

1.1.2主要藥品和儀器

七葉皂苷對(duì)照品(含七葉皂苷A、B、C、D組份)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度≥98%)，分析檢測(cè)所用的甲醇和乙腈為色譜純，其它未注明的藥品均為分析純。

主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、DNA測(cè)序儀(ABI PRISM 377)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、高效液相色譜儀(Agilent)及紫外分光光度儀(Beckman DU-40)等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離

將植物材料置于自來(lái)水下沖洗4～5 h，在無(wú)菌條件下依次用體積分?jǐn)?shù)0.1%的氯化汞浸泡10 min和體積分?jǐn)?shù)70%的酒精浸泡30 s，之后迅速用無(wú)菌水沖洗6次。將表面消毒徹底的七葉樹(shù)韌皮組織切割成0.5 cm2的小塊，并置于改良馬鈴薯培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨0.5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，維生素B1 0.1 g/L，瓊脂粉 12 g/L，pH自然)上，于28 °C恒溫培養(yǎng)2～15 d，挑取菌絲尖端，分離純化內(nèi)生真菌。

1.2.2內(nèi)生真菌的鑒定

用CTAB法[16]提取真菌基因組DNA，用真菌通用引物ITS1(5’-TTCGTAGGTGAACCT GCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增ITS基因片段，PCR反應(yīng)條件按文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖檢測(cè)和切膠回收后直接用于序列的測(cè)定。將所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，下載同源性較高的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。用Clusta-X軟件[18]對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)及人工校正，利用Mega 3.1軟件[19]構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20]。

1.2.3液態(tài)發(fā)酵、代謝產(chǎn)物的提取及分析檢測(cè)

內(nèi)生真菌分別接種到改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，于28 °C搖床(160 r/min)發(fā)酵培養(yǎng)7 d。過(guò)濾收集菌絲體經(jīng)反復(fù)凍融后，被充分研磨。在超聲波下用充分乙酸乙酯浸提菌絲體和發(fā)酵液，合并萃取液并在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，用于后續(xù)檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(體積比為53∶36∶11)，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相流速為1 mL/min及柱溫25 ℃。質(zhì)譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水(體積比為53∶36∶11)，碰撞電壓2 200 V，毛細(xì)管流量2 μL/min。

1.2.4抗菌活性分析

分別采用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)內(nèi)生真菌發(fā)酵液(各取50 μL)對(duì)指示菌-枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaure)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)的抗菌作用。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌的鑒定

從七葉樹(shù)中分離得到45株內(nèi)生真菌，初步根據(jù)菌落及顯微形態(tài)特征，分離菌株初步被歸類(lèi)為Alternariaspp.，Phomaspp.和Aspergillusspp.等類(lèi)群。代表菌株ITS的序列長(zhǎng)為600～650個(gè)堿基，其系統(tǒng)發(fā)育分析如圖1所示，以Saccharomycescerevisiae(Z95941)為外群，菌株SL-6、SL-9及SL-10同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Phomamacrostoma(KF293781)、P.glomerata(FJ517547)及P.medicaginis(KF293990)等的序列同源性達(dá)100%，在進(jìn)化樹(shù)中很好地類(lèi)聚到Phoma分枝上，步長(zhǎng)值為100，因此，SL-6、SL-9和SL-10屬于Phoma的不同種；SL-1同數(shù)據(jù)庫(kù)中Alternariaalternate(KP324980)、A.alternate(KP861901)及A.alternate(KP861900)等的序列同源性高達(dá)100%，并在NJ樹(shù)中聚于Alternaria分枝上，步長(zhǎng)值為100，該菌被鑒定為Alternaria屬真菌；SL-3和SL-7同Helminthosporiumsp.(KJ877647)、H.velutinum(JF502424)及H.velutinum(JN198435)同源性?xún)H為93%，該菌株可能是格孢腔菌目(Pleosporales)未報(bào)到的新成員；SL-5、SL-4和SL-2分別與Acremoniumbrachypenium(NR_077119)、UnculturedAcremoniumcloneF2-K28(KC535108)、Cladosporiumsphaerospermum(KJ728690)、C.Sphaerospermum(KC113297)、C.sphaerospermum(399762972)、Coprinellusradians(HQ380760)及C.domesticus(KP132301)序列同源性在97%～100%之間，分別聚于Acremonium、Cladosporium和Coprinellus分枝上，步長(zhǎng)值為100。因此，菌株SL-5、SL-4和SL-2分別被鑒定為Acremonium、Cladosporium和Coprinellus屬真菌。

圖1　基于ITS鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析七葉樹(shù)內(nèi)生真菌多樣性

2.2真菌七葉皂苷的檢測(cè)

紫外-可見(jiàn)分光光度法光譜掃描結(jié)果如圖2所示，在220 nm處，七葉皂苷對(duì)照品和菌株SL-6發(fā)酵產(chǎn)物的光譜圖相似，可以初步判斷該菌發(fā)酵液中可能含七葉皂苷或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 樣品圖2　紫外吸收檢測(cè)七葉皂苷

HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖3(a)所示，七葉皂苷對(duì)照品中包括七葉皂苷A、B、C及D組份，上述組份的出峰時(shí)間分別為6.969、8.253、9.492、10.831 min，而在菌株SL-6的發(fā)酵提取物中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)組份的保留時(shí)間分別為7.111、8.228、9.136 min(圖3(b))，表明內(nèi)生真菌Phomasp.SL-6謝產(chǎn)物中可能存在七葉皂苷A、B及C或相關(guān)其衍生物。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 樣品圖3　高效液相色譜檢測(cè)七葉皂苷

對(duì)七葉皂苷對(duì)照品和菌株SL-6菌株提取物進(jìn)行質(zhì)譜分析結(jié)果表明，七葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生一個(gè)MH+核質(zhì)比為1 153.5的離子峰(圖4(a))，菌株P(guān)homasp.SL-6的MH+核質(zhì)比為1 153.6的離子峰(圖4(b))，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的質(zhì)譜圖基本一致，進(jìn)一步表明內(nèi)生菌SL-6代謝產(chǎn)生七葉皂苷類(lèi)化合物。

(a) 標(biāo)準(zhǔn)品　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 樣品圖4　質(zhì)譜檢測(cè)七葉皂苷

2.3抗菌活性研究

為了挖掘七葉樹(shù)的抗菌活性菌株，本研究利用濾紙片擴(kuò)散法研究?jī)?nèi)生真菌的抗菌活性(如表1)。菌株Alternariasp.SL-1的發(fā)酵液對(duì)B.subtilis和S.aureus兩種革蘭氏陽(yáng)性菌有微弱的抑制作用，抑菌圈的大小為6～10 mm。此外，Phomasp.SL-10菌株的發(fā)酵液對(duì)T.cucumeris有很微弱的抑制作用。菌株P(guān)homasp.SL-6發(fā)酵液對(duì)植物病源真菌C.gloeosporioides，S.sclerotiorum和V.dahliae具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈為16～26 mm。其余菌株SL-2、SL-3、SL-4、SL-5、SL-7和SL-9的發(fā)酵液未觀察到明顯的抑菌活性。上述研究表明，菌株P(guān)homasp.SL-6在重要植物病源菌的生物防治中可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表1　內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)致病性微生物的抗菌活性

注：Bs=Bacillussubtilis，Ec=Escherichiacoli，Sa=Staphylococcusaureus，Cg=Colletotrichumgloeosporioides，Tc=Thanatephoruscucumeris，Ss=Sclerotiniasclerotiorum，Vd=Verticilliumdahlia；抑菌圈直徑(φ，mm)，“-”表示沒(méi)有抑菌效果，“+”表示6 mm<φ<10 mm，“++”表示10 mm<φ<16 mm，“+++”表示16 mm<φ<26 mm。

3討論

七葉樹(shù)是重要的藥用植物，目前有關(guān)七葉樹(shù)的研究主要集中在種子化學(xué)成分分析、藥理作用[21]以及七葉皂苷的純化[22]等方面，而關(guān)于七葉樹(shù)內(nèi)生真菌分離鑒定的研究鮮有報(bào)道。本研究從秦巴山區(qū)野生七葉樹(shù)內(nèi)共分離得到45株內(nèi)生真菌，它們被鑒定為7個(gè)屬。菌株P(guān)homasp.SL-6發(fā)酵液中存在七葉皂苷，之前有關(guān)Phoma屬也從其他藥用植物中分離報(bào)到過(guò)，例如Camelliajaponica[23]和A.ginnalaMaxim[24]，并且都能夠產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)，如赤霉素、甲基二苯醚[25]以及新型抗腫瘤和抗菌活性代謝產(chǎn)物。本課題組之前從秦嶺中國(guó)紅豆杉、喜樹(shù)內(nèi)中分離到能產(chǎn)紫杉醇和喜樹(shù)堿的真菌，部分菌株具有工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上述藥物的應(yīng)用潛力。菌株P(guān)homasp.SL-6能夠產(chǎn)生七葉皂苷，表明秦嶺地區(qū)藥用植物內(nèi)生菌在植物藥物開(kāi)發(fā)方面有巨大的潛力，需要進(jìn)一步挖掘。

近年來(lái)，內(nèi)生真菌已成為研究人員發(fā)現(xiàn)天然抗菌活性物質(zhì)的重要來(lái)源。江曙等[26]研究發(fā)現(xiàn)藥用植物內(nèi)生真菌具有廣泛的抗菌性。黃東益等[27]在旗草(Brachiariabrizantha)內(nèi)生真菌與旗草抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制能力強(qiáng)的內(nèi)生真菌培養(yǎng)物在旗草體內(nèi)也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性。本研究報(bào)道的秦嶺地區(qū)七葉樹(shù)內(nèi)生真菌Phomasp.SL-6發(fā)酵液能夠很好地抑制3種植物病原菌C.Gloeosporioides、S.sclerotiorum和V.dahlia，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無(wú)明顯的抑制作用，這同此前王緒英[28]發(fā)現(xiàn)植物七葉皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用不一致，可能是由于真菌發(fā)酵液中七葉皂甙含量較低的緣故。下一步的研究工作將集中在分離和解析Phomasp.SL-6發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)，這對(duì)于研發(fā)綠色生物農(nóng)藥具有潛在的科學(xué)意義。

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[責(zé)任編輯：魏 強(qiáng)]

Isolation and characterization of endophytic fungi fromAesculuschinensis

YANG Fang-yu1,ZHANG Bo1,TU Min2,DING Xiao-wei1,DENG Bai-wan1,CHEN Wen-qiang1,LIU Kai-hui1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;2.The Eighth Middle School of Hanzhong City, Hanzhong 723000, China)

Abstract:In this study, a total of forty-five endophytic fungi has been isolated from stems of A.chinensis grown on the Zibai mountain of Qinling. They are classified into 6 genera, such as Alternaria, Coprinellus, Cladosporium, and Phoma, based on morphological characteristics and internal transcribed spacer(ITS) sequence analysis. Of the strains obtained, SL-6 produces escin compounds in culture broths detected by Ultraviolet-visible Spectrophotometry, high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry assays(HPLC-MS). Moreover, the extracts of the strain SL-6 exhibit significantly antagonistic activities against plant pathogenic fungi, including C.gloeosporioides, S.sclerotiorum and V.dahliae.

Key words:A.chinensis;endophytic fungi;bioactivity

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q949.32

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

作者簡(jiǎn)介：楊方玉(1989—)，男，河南省延津縣人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源的開(kāi)發(fā)與利用；[通信作者]劉開(kāi)輝(1979—)，男，陜西省旬陽(yáng)縣人，陜西理工學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)槲⑸镔Y源的開(kāi)發(fā)與利用。

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(11JK0616)

收稿日期：2015-06-27修回日期：2015-08-25

[文章編號(hào)]1673-2944(2016)02-0064-06