孫大林等

摘要：對(duì)披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）中分離的編號(hào)為SP01、RM02的2株蠕形分生孢子內(nèi)生真菌進(jìn)行種屬分類鑒定。觀察真菌的形態(tài)，提取真菌DNA，擴(kuò)增并測(cè)定其ITS、GAPDH序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合形態(tài)特征和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行種屬分類。結(jié)果表明，SP01菌株的形態(tài)特征與凸臍孢屬（Exserohilum）中的E. rostratum最為相似，與E. rostratum的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切；RM02菌株的形態(tài)特征與彎孢屬（Curvularia）中C. spicifera、C. australiensis最為相似，與C. spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。確定披針葉黃華中分離的SP01、RM02分別為E. rostratum和C. spicifera。

關(guān)鍵詞：披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）；內(nèi)生真菌；蠕形分生孢子真菌；鑒定

中圖分類號(hào)：S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4473-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.021

近年研究表明，諸多藥用植物內(nèi)生真菌能夠合成具有生物活性作用的次生代謝產(chǎn)物[1-4]，通過(guò)人工選育和體外培養(yǎng)，該類真菌可以大量合成各種生物活性物質(zhì)[5]，是新型藥物開(kāi)發(fā)的重要資源。此外，內(nèi)生真菌與宿主植物間存在著復(fù)雜的共生關(guān)系，具有提高植物抗病抗逆性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、維持微生態(tài)環(huán)境平衡等重要作用[6]。

披針葉黃華（Thermopsis lanceolata）為豆科黃華屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)東北、華北及西北等省區(qū)的半干旱和干旱地區(qū)，該植物根系發(fā)達(dá)、耐寒抗旱、抗風(fēng)沙、繁殖力強(qiáng)，具有重要的生態(tài)利用價(jià)值。此外，披針葉黃華也是一種藥用植物資源，該植物富含黃華堿、臭豆堿、野決明堿、金雀花堿等多種喹喏里西啶類生物堿，具有抗癌、抗心率失調(diào)、抑菌消炎等多種生物活性作用，民間用于多種疾病的治療[7]。目前尚未見(jiàn)到關(guān)于披針葉黃華內(nèi)生真菌的相關(guān)報(bào)道。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)采自寧夏的披針葉黃華內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行了研究，從中分離到2株具有蠕形分生孢子真菌形態(tài)特征的內(nèi)生真菌。真菌學(xué)界將分生孢子形似蠕蟲(chóng)的半知菌稱為蠕形分生孢子真菌（Helminthosoiroid fungi），屬半知菌絲飽綱（Hyphomyeetes）暗色菌科，主要包括平臍蠕孢屬（離蠕孢屬）、彎孢屬、內(nèi)臍孢屬、凸臍蠕孢屬、長(zhǎng)蠕孢屬和卵蠕孢屬6個(gè)屬。該類真菌寄主范圍寬、分布廣泛，是一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的真菌類群[8]。本研究擬對(duì)分離自披針葉黃華植物組織中的2株蠕形分生孢子真菌進(jìn)行形態(tài)和遺傳發(fā)育分析，根據(jù)真菌的形態(tài)特征及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（Internal transcribed space，ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）序列等信息，對(duì)其進(jìn)行了種屬分類，為進(jìn)一步研究披針葉黃華內(nèi)生真菌的多樣性、次生代謝產(chǎn)物及與宿主植物的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2013年8月于寧夏銀川市采集無(wú)病害披針葉黃華的根和種子，分離出SP01和RM02菌株，保存于北方民族大學(xué)國(guó)家民委發(fā)酵和釀造工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 6.5。水瓊脂+麥稈培養(yǎng)基（TWA+W）：瓊脂13 g，去離子水1 000 mL，pH 6.5，制成平板后，放入滅菌麥稈。

1.1.3 儀器與試劑 C1000型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；5418型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國(guó)OMEGA公司）；DNA聚合酶、DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）；其他有機(jī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 真菌的形態(tài)觀察

將SP01、RM02菌株接種于PDA、TWA+W培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取菌絲至載玻片上，經(jīng)乳酸酚棉蘭染液染色后在顯微鏡下觀察。用目鏡測(cè)微尺測(cè)量分生孢子的大小和菌絲的直徑，根據(jù)真菌的菌絲、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)特點(diǎn)及產(chǎn)孢方式等對(duì)其進(jìn)行初步的種屬分類。

1.3 真菌ITS、GAPDH序列的擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

分別取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的真菌菌絲約200 mg，置于冰中放置的1.5 mL離心管中，用帶有玻璃研磨鉆頭的電鉆間歇研磨菌絲約20 s，然后用DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA。應(yīng)用White等[9]報(bào)道的引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS序列，應(yīng)用Berbee等[10]報(bào)道的引物gpd1和gpd2擴(kuò)增GAPDH序列。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，其中DNA聚合酶2.5 U，PCR緩沖液5 μL，dNTP 4 μL，20 μM引物各2 μL，模板DNA 0.5 μL。具體反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min使其反應(yīng)充分。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，確定成功擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化回收，將純化的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司，分別以ITS1、ITS4引物和gpd1、gpd2引物進(jìn)行雙向測(cè)序，將正反測(cè)序結(jié)果拼接，獲得ITS和GAPDH序列信息。

登錄http//：www.ncbi.nlm.nih.gov，將已獲得的各菌株ITS序列和GAPDH序列提交到GenBank，申請(qǐng)GenBank序列號(hào)。應(yīng)用BLAST在線比對(duì)程序分別將測(cè)定的ITS序列和GAPDH序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的真菌序列進(jìn)行同源性比較，獲得各菌株的種屬初步分類信息；選擇數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)屬或臨近屬權(quán)威菌株的ITS序列和GAPDH序列（表1），應(yīng)用MEGA 4.0軟件中的Clustal W程序?qū)Ω餍蛄羞M(jìn)行聯(lián)配（Aligment），然后根據(jù)聯(lián)配結(jié)果采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)據(jù)集為1 000。

1.4 真菌的種屬分類

根據(jù)各菌株菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特點(diǎn)，產(chǎn)孢方式、生長(zhǎng)特性，并結(jié)合ITS、GAPDH序列同源性比較和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，對(duì)該類真菌進(jìn)行種屬分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 SP01和RM02菌株的形態(tài)特征

SP01菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰黑色，在TWA+W培養(yǎng)基上呈灰褐色。菌絲無(wú)色，分生孢子梗呈深褐色，上部屈膝狀彎曲，未見(jiàn)分支。分生孢子呈淺褐色或深褐色，單生于分生孢子梗頂端或側(cè)部，呈圓柱狀，略彎曲，兩端鈍圓，孢子大小約為（60～90） μm×（13～16） μm，一端具臍點(diǎn)，突出于孢子表面。孢子具有6～9個(gè)假膈膜，兩端膈膜較厚，顏色較深（圖1a）。

RM02菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰綠色，在TWA+W培養(yǎng)基上呈灰褐色。菌絲無(wú)色，在以上2種培養(yǎng)基上，該菌株均只能產(chǎn)生少量的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗呈淡褐色，上部屈膝狀彎曲，偶見(jiàn)分支。分生孢子呈淺褐色，單生或簇生，呈橢圓形，孢子平直，兩端鈍圓，孢子大小約為（10～24） μm×（7～10） μm，一端具臍點(diǎn)，與孢子壁表面平齊。孢子具有3個(gè)假膈膜（圖1b）。

2.2 SP01、RM02菌株ITS、GAPDH的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

SP01、RM02菌株的ITS、GAPDH片段的核苷酸序列測(cè)定結(jié)果顯示，SP01、RM02的ITS片段長(zhǎng)度分別為601 bp、570 bp，GAPDH片段長(zhǎng)度分別為524 bp、530 bp，其ITS序列的GenBank登錄號(hào)分別為KP245767、KP245754，GAPDH序列的GenBank登錄號(hào)分別為KP311327、KP311328。

BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，SP01菌株的ITS、GAPDH序列與凸臍孢屬（Exserohilum）的E. rostratum及其有性型Setosphaeria rostrata的序列一致性最高，均達(dá)99%。RM02菌株的ITS序列與彎孢屬（Curvularia）的C. spicifera、C. australiensis、C. hawaiiensis等菌株的序列一致性最高，為98%～100%。

基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）表明，SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中同處于一個(gè)分支，自檢支持率高達(dá)99%，其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata IP 1129.80、S.rostrata Ex007、S.rostrata ATCC 32197等菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中同處于一個(gè)分支，其中與C.spicifera的DAOM 575355、YW1、BC21ss2、CBS 274.52等菌株及C.spicifera的同物異名菌株C.tetramera CBS 371.72處于同一個(gè)分支，說(shuō)明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。

基于GAPDH序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）表明，SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中同處于一個(gè)分支，自檢支持率也較高，其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata ATCC 32197、S.rostrata ACCC 37579等菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中同處于一個(gè)分支，其中與C.spicifera的DAOM 575355、BC21ss2、CBS 274.52等菌株處于同一個(gè)分支，說(shuō)明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。

3 小結(jié)與討論

在本研究中，SP01菌株的分生孢子呈長(zhǎng)圓柱形，具有多個(gè)假膈膜，孢子兩端膈膜較厚且顏色較深，孢子一端具臍點(diǎn)，臍點(diǎn)明顯突出于孢子外壁表面，孢子頂生或側(cè)生，這些形態(tài)特點(diǎn)與Exserohilum中的E.rostratum較為相似[8]。此外，基于ITS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也表明，SP01與Exserohilum各種同屬于一個(gè)類群，且與E.rostratum的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。因此，本研究將SP01鑒定為E.rostratum（嘴突凸臍蠕孢）。

RM02菌株的分生孢子呈橢圓形，具3個(gè)假膈膜，孢子平直，兩端鈍圓，孢子一端具臍點(diǎn)，臍點(diǎn)與孢子壁表面平齊，該菌具有平臍孢屬（Bipolaris）和彎孢屬（Curvularia）真菌的典型特征，其中與平臍孢屬真菌B.spicifera、B.australiensis最為相似[8]?；贗TS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，RM02菌株與彎孢屬（Curvularia）菌株處于同一類群，與C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，其中與C.spicifera遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。而C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis分別是B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis的同物異名，故本研究將RM02鑒定為C.spicifera≡Bipolaris spicifera（長(zhǎng)穗離蠕孢）[11，12]。

在蠕形分生孢子真菌中，突出的臍點(diǎn)是凸臍孢屬區(qū)別于平臍孢屬、內(nèi)臍孢屬等其他蠕形菌的最典型特征。但在實(shí)際觀察中，真菌的形態(tài)變異較大，受培養(yǎng)條件的影響較大，僅據(jù)此來(lái)區(qū)分它們?nèi)菀自斐苫煜?。彎孢屬和平臍孢屬的相似程度很高，而且具有相同的有性?旋孢腔菌屬（Cochliobolus）。有學(xué)者認(rèn)為分生孢子是否彎曲或分生孢子的膈膜類型可作為區(qū)分彎孢屬和平臍孢屬的重要依據(jù)[11]。但本研究表明，平臍孢屬中的某些種的孢子也會(huì)出現(xiàn)彎曲，而彎孢屬中的某些種的孢子是直的。Alcorn認(rèn)為Bipolaris的分生孢子的膈膜為假膈膜，而Curvularia的膈膜為真膈膜，Bipolaris、Curvularia應(yīng)為兩個(gè)獨(dú)立的屬[12]。但Sivanesan認(rèn)為，Curvularia中的未成熟或成熟的孢子中其膈膜并未與外壁相連，也是假膈膜[13]。因此，僅根據(jù)真菌的形態(tài)很難將2個(gè)屬中的各個(gè)種嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)來(lái)[8]。

近年來(lái)，在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析技術(shù)為真菌的種屬分類提供了必要的技術(shù)手段，如ITS、GAPDH、LSU、EF-1α、Brn1等序列已廣泛用于蠕形分生孢子真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究[8]。Li等[11]、Manamgoda等[12]對(duì)Bipolaris、Curvularia真菌的ITS、GAPDH序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，Bipolaris和Curvularia的各個(gè)種均被分別劃分到Cochliobolus的2個(gè)類群中。Manamgoda等[13]、Tan等[14]根據(jù)ITS、GAPDH、EF-1α等序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，對(duì)Bipolaris、Curvularia中的各種進(jìn)行了重新劃分，其中將B. spicifera、B.australiensis、B. hawaiiensis等明確劃分到Curvularia中。在本研究中，基于ITS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均將B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis劃分到Curvularia類群中，與Bipolaris類群明顯處于不同的進(jìn)化樹(shù)分支，這與Brebee等[10]、Manamgoda等[13]的報(bào)道相一致。據(jù)Shimizu等[15]、Sun等[16]、孫廣宇等[17]報(bào)道，Brn1序列適用于對(duì)Exserohilum、Bipolaris、Curvularia中不同菌株的遺傳變異分析，而且能夠區(qū)分E.rostratum中的種間變異。本研究的結(jié)果表明，ITS、GAPDH序列也適用于對(duì)Exserohilum各種的區(qū)分。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHAO J，ZHOU L，WANG J，et al. Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants[J].A. Méndez-Vilas （Ed.） Current Research，Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology，2010，1：567-576.

[2] STIERLE A，STROBEL G，STIERLE D B. Taxonl and taxane production by Taxomyces andreana， an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.

[3] 蘇經(jīng)遷，黃 彬，邱 慧，等.產(chǎn)生物堿和石杉?jí)A甲蛇足石杉內(nèi)生真菌的初步研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（19）：1477-1481.

[4] 孫建秋，郭良棟，臧 威，等.藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布[J].中國(guó)科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2008， 38（5）：475-484.

[5] BANDARA W M M S，SENEVIRATNE G，KULASOORIYA S A. Interactions among endophytic bacteria and fungi： Effects and potentials[J].Journal of Biosciences，2006，31（5）：645-650.

[6] 袁志林，章初龍，林福呈.植物與內(nèi)生真菌互作的生理與分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28（9）：4430-4439.

[7] 李 勇，趙曉瑞，張學(xué)禮.披針葉黃華的化學(xué)成分研究[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2008，29（4）：68-69.

[8] 張?zhí)煊睿瑢O廣宇.中國(guó)真菌志（第三十卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[9] INNIS M A，GELFAND D H，SNINSKY J J，et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M].New York：Academic Press，1990.315-322.

[10] BERBEE M L，PIRSEYEDI M，HUBBARD S. Cochliobolus phy-logenetics and the origin of known， highly virulent pathogens， inferred from ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene sequences[J].Mycologia，1999，91（6）：964-977.

[11] LI K N，ROUSE D I，GERMAN T L. PCR primers that allow intergeneric differentiation of ascomycetes and their application to Verticillium spp.[J]. Appl Environ Microbiol，1995，60 （12）：4324-4331.

[12] MANAMGODA D S，CAI L，BAHKALI A H，et al. Cochliobolus：An overview and current status of species[J].Fungal Divers，2011，51（1）：3-42.

[13] MANAMGODA D S，CAI L，CROUS P W，et al. A phylogenetic and taxonomic re-evaluation of the Bipolaris-Cochliobolus-Curvularia Complex[J]. Fungal Diversity，2012，56（1）：131-144.

[14] TAN Y P， MADRID H， CROUS P W， et al. Johnalcornia gen. et. comb. nov.， and nine new combinations in Curvularia based on molecular phylogenetic analysis[J]. Australasian Plant Pathol， 2014， 43（6）：589-603.

[15] SHIMIZU K， TANAKA C， PENG Y L， et al. Phylogeny of Bipolaris inferred from nucleotide sequence of Brn1， a reductase gene involve in melanin biosynthesis[J]. J Gen Appl Microbiol， 1998， 44（4）：251-258.

[16] SUN G Y，OIDE S，TANAKA E，et al. Species separation in Curvularia "geniculata" group inferred from Brn1 gene sequences[J].Mycoscience，2003，44（3）：239-244.

[17] 孫廣宇，張雅梅，張 榮.突臍孢屬Brn1基因核苷酸序列比較及系統(tǒng)發(fā)育研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2004，23（4）：480-486.