趙　英，劉小翠，廖志明，盧永昌

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.青海民族大學(xué)青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007；3.青海民族大學(xué)青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007)

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HPLC同時(shí)測定四數(shù)獐牙菜中3種有效成分含量

趙英1，2，3，劉小翠1，2，3，廖志明1，2，3，盧永昌1，2，3

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.青海民族大學(xué)青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007；3.青海民族大學(xué)青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007)

摘要：采用高效液相色譜法同時(shí)測定四數(shù)獐牙菜中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，3種化學(xué)成分均達(dá)到基線分離，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的線性范圍分別為0.15～21.05 mg/L(R=0.999 8)、0.25～28.05 mg/L(R=0.999 9)、0.10～20.00 mg/L(R=0.999 8)，回收率分別為99.1% (RSD=1.94%)、101.5%(RSD=2.05%)、96.0%(RSD=1.94%)，表明該測定方法快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于四數(shù)獐牙菜中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；獐牙菜苦苷；龍膽苦苷；獐牙菜苷；四數(shù)獐牙菜

四數(shù)獐牙菜SwertiatetrapteraMaxim.為一年生草本，龍膽科獐牙菜屬植物，高5～30 cm，主根呈黃褐色且粗壯，產(chǎn)于青海、西藏、四川、甘肅等地，主要生長于海拔2 000～4 000 m的潮濕山坡、河灘、疏林下等地[1]。其主要化學(xué)成分有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、齊墩果酸、當(dāng)藥黃素等[2]?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究表明，獐牙菜屬植物中含有的環(huán)烯醚萜類成分包括：獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷等[3]。其中獐牙菜苦苷具有提高皮膚機(jī)能、抑制中樞神經(jīng)、促進(jìn)毛發(fā)生長、鎮(zhèn)痛抗炎等作用[4-5]；龍膽苦苷具有保肝、抑菌、抗原蟲和抗病毒，促進(jìn)胃液分泌等作用[6]；獐牙菜苷則具有抗肝細(xì)胞損傷、退熱和抗驚厥等作用[7-8]。對于龍膽科植物測定其中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷的方法主要是利用薄層掃描和高效液相色譜法2種方法[9-11]，但針對上述3種有效成分的同時(shí)測定方法還未見報(bào)道。筆者利用高效液相色譜法同時(shí)測定了四數(shù)獐牙菜中3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為藥材質(zhì)量評價(jià)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司， ZORBAX SB-C18色譜柱)；XS205 Dual Range電子天平(蘇州江東精密儀器有限公司)；KH-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；除熱源型超純水器(成都浩純儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)。

甲醇(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠，高效液相色譜專用試劑，分析純)；磷酸(上海聯(lián)合化工廠，分析純)；獐牙菜苦苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13070203，純度>98%)；龍膽苦苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13082205，純度>98%)；獐牙菜苷(上海源葉生物科技有限公司，批號：400-666-5481，純度>98%)。

樣品采集：四數(shù)獐牙菜2014年8月采于青海省互助北山林場，由青海民族大學(xué)林鵬程教授鑒定。樣品陰干粉碎后過60目(孔徑0.3 mm)篩，冷藏保存。

2試驗(yàn)方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取獐牙菜苦苷對照品1.03 mg，龍膽苦苷對照品1.20 mg，獐牙菜苷對照品0.99 mg，分別置于1 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，配制成相應(yīng)濃度的對照品儲備液，使用時(shí)稀釋成所需濃度。

2.2供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取已粉碎過篩的四數(shù)獐牙菜樣品1.0 g，加入甲醇15 mL，使用超聲波提取器提取1 h，抽濾，濾渣再用15 mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇超聲提取兩次，合并濾液，定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，在選定的色譜條件下測定有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 柱；流動相：甲醇和水(含體積分?jǐn)?shù)0.04%的磷酸)，0～5 min用體積分?jǐn)?shù)90%的水等度洗脫，5～10 min用體積分?jǐn)?shù)90%至80%的水線性洗脫，10～30 min用體積分?jǐn)?shù)80%至60%的水線性洗脫，流速1 mL/ min；檢測波長為254 nm；柱溫30 ℃，色譜圖見圖1，結(jié)果表明待測成分均被洗脫且達(dá)到基線分離。

1.tR1為獐芽菜苦苷的保留時(shí)間；2.tR2為龍膽苦苷的保留時(shí)間；3.tR3為獐芽菜苷的保留時(shí)間圖1　對照品及四數(shù)獐牙菜樣品色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of standard substance and Swertia tetraptera Maxim

2.4線性關(guān)系的測定

精密量取3種對照品儲備溶液，以甲醇分別稀釋到相應(yīng)濃度：獐牙菜苦苷0.005 15、0.025 75、0.051 5、0.077 25、0.103 g/L，龍膽苦苷0.006、0.03、0.06、0.09、0.12 g/L，獐牙菜苷0.004 95、0.024 75、0.049 5、0.074 25、0.099 g/L。每次均進(jìn)樣10 μL，以峰面積作為定量依據(jù)，測得各組分的回歸方程如表1。

2.5精密度試驗(yàn)

取濃度為0.052 g/L獐牙菜苦苷、0.060 g/L龍膽苦苷、0.049 5 g/L獐牙菜苷的對照品溶液，在已選定的色譜條件下測定相應(yīng)色譜峰的峰面積，計(jì)算得其RSD(n=5)分別為0.244%，0.673%，0.603%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表1　回歸方程和線性范圍

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h時(shí)測定3種對照品的峰面積。結(jié)果顯示3種對照品獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為1.97%、1.03%、2.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取四數(shù)獐牙菜樣品1.0 g共5份，按“2.2”項(xiàng)下的方法操作，在已選定的色譜條件下測定獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷3種物質(zhì)，最終計(jì)算其RSD分別為2.63%、0.97%、2.23%，結(jié)果表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份已測定含量的四數(shù)獐牙菜樣品各0.1 g，按“2.2”項(xiàng)下的方法，分別加入一定量相應(yīng)的對照品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)(見表2)，測得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的平均回收率分別為99.1%(RSD=1.94%)、101.5%(RSD=2.05%)、96.0%(RSD=1.94%)，證明本方法具有良好的回收率。

表2　3種組分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9含量測定

取“2.2”項(xiàng)下制備的四數(shù)獐牙菜樣品溶液按上述色譜條件進(jìn)行分析，經(jīng)DAD檢測器檢測3種待測組分的紫外光譜峰和純度與對照品一致后，用外標(biāo)法，以峰面積積分值計(jì)算最終可得3種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)分別為獐牙菜苦苷0.209 3%、龍膽苦苷1.339 4%、獐牙菜苷0.056 3%。

3討論

3.1提取方法的選擇

在對四數(shù)獐牙菜提取時(shí)，采用超聲、回流、微波3種提取方法進(jìn)行比較試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)超聲波提取1 h明顯比溶劑回流提取1 h提取效果顯著，微波法提取的效果較好，但在加熱過程中對溶劑的損耗相對較大，因此比較分析最終采取超聲波提取方法進(jìn)行提取。

3.2檢測波長的確定

分別將對照品溶液進(jìn)樣，在200～400 nm范圍內(nèi)使用DAD檢測器掃描其吸收光譜，綜合比較各對照品的吸收強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)各對照品均在254 nm處有較高吸收，最終選擇在254 nm進(jìn)行檢測。

本文所建立的方法具有提取快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，可用于四數(shù)獐牙菜中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，對全面評價(jià)藥物質(zhì)量具有重要意義。

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(責(zé)任編輯王龍杰)

Simultaneously Determination of Three Effective Components inSwertiatetrapteraMaxim.

ZHAO Ying1，2，3，LIU Xiaocui1，2，3，LIAO Zhiming1，2，3，LU Yongchang1，2，3

(1. College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai 810007，China；2. Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai 810007，China；3. Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province，Xining Qinghai 810007，China)

Abstract:RP-HPLC was used to determine the quantity and quality of swertiamarin，gentiopicroside and sweroside in Swertia tetraptera Maxim. The results showed that three compounds were base-isolated. The linear ranges of swertiamarin，gentiopicroside and sweroside were 0.052～1.030 μg (R=0.999 8), 0.060～1.200 μg (R=0.999 9), and 0.050～0.99 μg(R=0.999 8) respectively，the average recoveries were 99.1% (RSD=1.94%), 101.5% (RSD=2.05%), and 96.0% (RSD=1.94%) respectively. This method is simple，rapid and reliable with good reproducibility，and can be used as the determination method for swertiamarin，gentiopicroside and sweroside in Swertia tetraptera Maxim.

Keywords:RP-HPLC； swertiamarin； gentiopicroside； sweroside； Swertia tetraptera Maxim.

中圖分類號：O415

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-6600(2016)01-0118-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160554)；青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展專項(xiàng)(2014-Z-Y13)

收稿日期：2015-10-29

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.01.018

通信聯(lián)系人：盧永昌(1968—)，男，青海西寧人，青海民族大學(xué)教授。E-mail：qhlych@126.com