張志誠 趙文緊 劉志紅 鄭敬民

炎性細(xì)胞因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞C3a受體表達(dá)的調(diào)控

張志誠 趙文緊 劉志紅 鄭敬民

目的：為更好了解腎臟組織中C3aR表達(dá)調(diào)控因素，我們研究了多種炎性細(xì)胞因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞)C3a受體(C3aR)表達(dá)的調(diào)控作用。 方法：用多種炎性細(xì)胞因子[干擾素γ(IFN-γ)、C3a、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)]刺激HK2細(xì)胞，利用熒光定量PCR、免疫組化及免疫印跡的方法檢測(cè)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)水平。 結(jié)果：炎性細(xì)胞因子IFN-γ能夠顯著促進(jìn)HK2細(xì)胞C3aR的表達(dá)上調(diào)[與正常對(duì)照組相比，C3aR mRNA表達(dá)水平的約增長5倍(P=0.001)，蛋白水平表達(dá)上調(diào)大約1.6倍(P=0.046)]，且HK2細(xì)胞C3aR mRNA水平表達(dá)上調(diào)與IFN-γ呈劑量及時(shí)間依賴關(guān)系；而其他的炎性細(xì)胞因子如TNF-α、TGF-β、IL-1β甚至生物活性多肽C3a均未觀察到對(duì)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)造成影響。 結(jié)論：腎小管上皮細(xì)胞表面可表達(dá)生物活性肽段C3aR，而且炎癥細(xì)胞因子IFN-γ能夠明顯增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞C3aR表達(dá)，預(yù)示C3a/C3aR軸可能參與了腎臟局部炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)并且與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。

炎癥細(xì)胞因子 干擾素γ 腎小管上皮細(xì)胞 C3a受體

C3a受體(C3aR)是補(bǔ)體C3裂解產(chǎn)物C3a特異性結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體，該受體最先發(fā)現(xiàn)在骨髓源性的骨髓及淋巴細(xì)胞上表達(dá)，包括單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸/堿性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞等；近來研究發(fā)現(xiàn)，在腦、肺、心、肝臟、軟骨以及腎臟等器官組織細(xì)胞中均能檢出C3aR的表達(dá)[1]。在三種途徑的補(bǔ)體活化過程中，C3被C3轉(zhuǎn)化酶裂解為C3a和C3b，C3b進(jìn)一步參與補(bǔ)體活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終形成膜攻擊復(fù)合物(C5b-9)，而C3a則通過激活C3aR，可趨化并激活外周血白細(xì)胞，促使白細(xì)胞脫顆粒和分泌多種炎性介質(zhì)，在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]；而白細(xì)胞分泌的多種炎性細(xì)胞因子又對(duì)不同組織細(xì)胞中C3aR的表達(dá)起著調(diào)控作用[3-5]。如在軟骨細(xì)胞中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)能顯著增加C3aR 的mRNA表達(dá)水平[3]；TNF-α和C3a則可介導(dǎo)肌腱組織細(xì)胞C3aR表達(dá)上調(diào)[4]；樹突狀細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖(LPS)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)、或前列腺素E2的刺激下，均能使其C3aR的表達(dá)顯著上調(diào)[5]；白細(xì)胞介素1(IL-1)促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)C3aR[6]等。在腎臟中雖然仍有一定的爭(zhēng)論[7]，有關(guān)C3aR在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)也有報(bào)道[8]，但確切的生理機(jī)制仍不清楚。既往我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病(DN)患者腎組織中C3aR表達(dá)上調(diào)[9]，但其上調(diào)的機(jī)制未知，有研究表明，DN患者腎組織中炎性細(xì)胞因子濃度增高[10]。我們認(rèn)為炎性因子可能促進(jìn)腎組織C3aR的表達(dá)，為了更好地了解腎臟組織中C3aR表達(dá)調(diào)控因素，我們研究了多種炎性細(xì)胞因子[IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)]對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞)C3aR表達(dá)調(diào)控作用。

材料與方法

材料和試劑 HK2細(xì)胞購于美國美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 美國)，TRIZOL試劑(Invitrogen 美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Takara 日本)，C3aR、18S RNA引物(金維智生物科技有限公司)，抗人C3aR抗體(Santa Cruz 美國)，GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Bioworld 中國)，重組人TNF-α、IFN-γ、TGF-β1(R&D system 美國)；重組人IL-1β(SIGMA 美國)；重組人活性C3a多肽(Merck 美國)；HRP標(biāo)記的二抗及顯色試劑盒(珠海市泉暉企業(yè)有限公司)，細(xì)胞裂解液、ECL顯影劑(碧云天)，PVDF膜。

實(shí)驗(yàn)方法和步驟

HK2細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 HK2細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HK2細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于12孔板中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，待孔內(nèi)細(xì)胞密度長至80%融合時(shí)換成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化12～18h。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，濃度梯度組中各個(gè)炎癥細(xì)胞因子組分別如下：IFN-γ(10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)、TGF-β1(1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)、TNF-α(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)、IL-1β(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)、C3a(0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml)以及IL-1β+TNF-α(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)，刺激時(shí)間24h；在時(shí)間梯度刺激組中，各炎癥細(xì)胞因子濃度為：IFN-γ(100 ng/ml)、TGF-β1(10 ng/ml)、TNF-α(10 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)、C3a(1 μg/ml)及IL-1β+TNF-α(各10 ng/ml)，時(shí)間分組為6h、12h、24h及48h組。每組每個(gè)觀察指標(biāo)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

細(xì)胞爬片的制作 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于蓋玻片上，置于37℃、5%CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，待長至60%～70%融合時(shí)換成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化12～18h后，細(xì)胞爬片隨機(jī)分為正常對(duì)照組及IFN-γ刺激組(100 ng/ml)，刺激24h后進(jìn)行固定，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

HK2細(xì)胞蛋白提取 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80%融合時(shí)換成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化12～18h，細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組及IFN-γ刺激組(10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)，每組每個(gè)觀察指標(biāo)設(shè)3個(gè)重復(fù)，24h后提取HK2細(xì)胞蛋白，置-80℃冰箱備用。

細(xì)胞總RNA的提取和熒光定量PCR分析 細(xì)胞總RNA的提取采用TRIZOL試劑；cDNA合成按試劑盒說明進(jìn)行。熒光定量PCR按試劑盒說明書進(jìn)行，以18S RNA為內(nèi)參于ABI公司的7900型熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件是95℃ 1 min，然后進(jìn)行如下40循環(huán)：95℃ 15s，60℃ 30s。所用引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR分析引物序列

圖1 炎癥細(xì)胞因子通過不同時(shí)間的刺激對(duì)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)調(diào)控IL-1β:白細(xì)胞介素1β；TNF-α:腫瘤壞死因子α；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子β；IFN-γ:干擾素γ；A：各種炎癥細(xì)胞因子刺激6h組； B：各種炎癥細(xì)胞因子刺激12h組；C：各種炎癥細(xì)胞因子刺激24h組；D：各種炎癥細(xì)胞因子刺激48h組;*：與對(duì)照組相比，P<0.05

免疫組化染色 從冰箱中取出細(xì)胞爬片升至室溫并風(fēng)干， PBS潤洗一遍，透膜5 min，用3%H2O2PBS溶液孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，再用3% BSA 封閉30 min，以抗人C3aR抗體室溫孵育2h(陰性對(duì)照組用等體積3%BSA封閉液代替)，PBS洗3遍(5 min/遍)后，滴加HRP標(biāo)記的二抗孵育20 min，PBS洗3遍(5 min/遍)后，底物顯色，最后以蘇木素復(fù)染10 min，脫水、透明、封片并放于顯微鏡下觀察。

Western Blot蛋白免疫印跡 用BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸，蛋白上樣每孔20 μg，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉，TBST洗膜，一抗(C3aR 1∶ 3 000、GAPDH1∶ 10 000)4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶ 10 000)室溫孵育1～1.5h，TBST洗膜，ECL顯色液曝光，采用Western印跡自動(dòng)成像儀掃描并獲得顯影圖像，其結(jié)果用Image J進(jìn)行定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；定性指標(biāo)以百分比表示，組間比較采用Χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

IFN-γ促進(jìn)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá) 各種炎癥細(xì)胞因子通過不同時(shí)間的刺激對(duì)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)調(diào)控分析。在IFN-γ濃度為100 ng/ml條件下，刺激6h、12h、24h及48h組中HK2細(xì)胞中C3aR mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組均明顯升高(P均<0.05)，其中在24h之內(nèi)，HK2細(xì)胞C3aR mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而升高，在24h組HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)上調(diào)最明顯[(5.08±1.545)vs(1.00±0.231)，P=0.011]，然而長時(shí)間的培育刺激(48h)則使C3aR mRNA相對(duì)表達(dá)量與24h組相比有所下降[(1.53±0.192)vs(1.00±0.170)，P=0.022]，而其余炎癥細(xì)胞因子的4個(gè)時(shí)間組中HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組先比未見明顯增高(圖1)。表示各種炎癥細(xì)胞因子在同一刺激時(shí)間下(24h)不同濃度對(duì)HK2細(xì)胞C3aR mRNA 表達(dá)調(diào)控分析，研究發(fā)現(xiàn)，低濃度到高濃度(10 ng/ml～100 ng/ml)IFN-γ均能顯著上調(diào)HK2細(xì)胞中C3aR mRNA表達(dá)(P均<0.05)，且C3aR mRNA表達(dá)水平隨著IFN-γ濃度增高而增加，其中在IFN-γ濃度為100 ng/ml組中HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)水平最高[(5.15±0.708)vs(1.00±0.202)，P=0.001]，其余炎癥細(xì)胞因子低濃度到高濃度組中HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比未見明顯增高。HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)結(jié)果顯示IFN-γ能夠明顯促進(jìn)HK2細(xì)胞中C3aR mRNA表達(dá)，且在一定的范圍內(nèi)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)水平隨著IFN-γ刺激濃度或刺激時(shí)間的增加而上調(diào)(圖2)。

圖2 不同濃度炎癥細(xì)胞因子刺激對(duì)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)調(diào)控IL-1β:白細(xì)胞介素1β；TNF-α:腫瘤壞死因子α；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長因子β；IFN-γ:干擾素γ；A:IFN-γ濃度組(10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)； B:TGF-β1濃度組(1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)；C:TNF-α濃度組(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)；D:為IL-1β濃度組(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)；E:C3a濃度組(0.1 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml)；F:IL-1β+TNF-α濃度組(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml);*：與對(duì)照組相比，P<0.05

干擾素γ促進(jìn)HK2細(xì)胞C3aR蛋白表達(dá) 為了進(jìn)一步探究IFN-γ 對(duì)HK2細(xì)胞中C3aR 蛋白水平表達(dá)調(diào)控，我們利用細(xì)胞免疫組化的方法對(duì)IFN-γ 組的HK2細(xì)胞及正常對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行染色?；谌旧Y(jié)果顯示(圖3)，與正常對(duì)照的HK2細(xì)胞相比， IFN-γ組HK2細(xì)胞中針對(duì)C3aR免疫染色明顯增高;而且Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HK2細(xì)胞C3aR蛋白表達(dá)上調(diào)與IFN-γ成劑量依賴關(guān)系；且與對(duì)照組相比，在IFN-γ 100 ng/ml濃度組中HK2細(xì)胞C3aR蛋白表達(dá)上調(diào)明顯(約增加1.6倍，P=0.046)(圖4)，說明IFN-γ能夠明顯增強(qiáng)HK2細(xì)胞中C3aR 蛋白水平表達(dá)。

圖3 IFN-γ組HK2細(xì)胞中針對(duì)C3aR免疫染色明顯增強(qiáng) (IH，×200)A:陰性對(duì)照；B:HK2對(duì)照細(xì)胞(未用IFN-γ刺激)；C:經(jīng)IFN-γ 100 ng/ml刺激24h后的HK2細(xì)胞

圖4 不同濃度干擾素γ(IFN-γ)刺激對(duì)HK2細(xì)胞C3aR蛋白表達(dá)調(diào)控

討 論

補(bǔ)體系統(tǒng)主要經(jīng)過經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑而被激活，再經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成C3a[8]。作為一種促炎性介質(zhì)，C3a通過與表達(dá)在各種細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性受體(C3aR)結(jié)合來發(fā)揮不同的生物學(xué)作用[11]。如在內(nèi)毒素休克中，C3a對(duì)機(jī)體而言起著保護(hù)性作用，Kildsgaard等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠盲腸結(jié)扎穿刺的膿毒癥模型中，C3aR-/-小鼠的死亡率明顯高于野生型小鼠；而在關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，C3a則會(huì)加重大鼠的炎性反應(yīng)，Hawlisch等[13]發(fā)現(xiàn)C3aR-/-小鼠能夠減輕由卵清蛋白引起的氣道高反應(yīng)性及早期的支氣管收縮，證明C3aR的過量表達(dá)會(huì)促進(jìn)哮喘的疾病進(jìn)展。因此，C3aR作為一個(gè)重要的G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，其在非免疫細(xì)胞中的功能非常值得研究。

一些研究顯示在不同種疾病中能觀察到C3aR的表達(dá)異常。如腦膜炎患者其C3aR過表達(dá)于反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及浸潤于腦組織中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上，相反，在正常的腦組織切片中未檢出C3aR的表達(dá)； Benoist等[14]則發(fā)現(xiàn)在過敏性皮膚炎或者過敏性接觸性皮炎患者中，其CD4+和CD8+T細(xì)胞中能夠檢出C3aR的表達(dá)，而其他亞型的T細(xì)胞則無該受體的表達(dá)。而在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)C3aR在DN腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)并于DN的病理進(jìn)程具有一定的相關(guān)性[9,15]，但具體機(jī)制尚不明確。為了更好地了解DN患者腎臟組織中C3aR表達(dá)調(diào)控因素，本實(shí)驗(yàn)研究了多種炎性細(xì)胞因子對(duì)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)的調(diào)控作用。多種炎癥細(xì)胞因子刺激HK2細(xì)胞后，利用熒光定量PCR、免疫組化及Western Blot的方法來檢測(cè)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)變化，結(jié)果顯示IFN-γ能夠顯著的促進(jìn)HK2細(xì)胞C3aR的表達(dá)上調(diào)，且HK2細(xì)胞C3aR的表達(dá)上調(diào)與IFN-γ成劑量及時(shí)間依賴關(guān)系；而其他的炎性細(xì)胞因子如：TNF-α、TGF-β1、IL-1β及C3a均未觀察到對(duì)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)影響。

DN是一種進(jìn)展性的腎臟疾病，是糖尿病常見的并發(fā)癥，能增加糖尿病患者的死亡率[16]。既往認(rèn)為代謝及血流動(dòng)力學(xué)因素是DN腎臟損害主要原因[17]，然而近幾年的研究顯示，炎性反應(yīng)在DN的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道DN患者腎組織能夠檢測(cè)到巨噬細(xì)胞的浸潤[18]，Wu等[19]研究也證明Th1細(xì)胞的激活及其活化引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)DN患者腎組織損害。作為一種重要的炎性細(xì)胞因子，IFN-γ屬于干擾素家族中一員，主要由Th1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌，在機(jī)體的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能夠明顯增強(qiáng)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)，我們推測(cè)，DN患者腎臟組織免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的浸潤和激活促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞C3aR的表達(dá)上調(diào)，也預(yù)示著C3a/C3aR軸在DN中參與了腎臟局部的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并與DN的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道在腎小管細(xì)胞上可以檢測(cè)到高表達(dá)的IFN-γ特異性受體[22]，Gerritsma等[23]研究也證明IFN-γ能夠激活腎小管上皮細(xì)胞，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞分泌補(bǔ)體系統(tǒng)成分(補(bǔ)體C2、C4、H因子等)和趨化因子[IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)]。我們推測(cè)HK2細(xì)胞IFN-γ受體激活而使自身活化可能參與其C3aR表達(dá)的上調(diào)，然而，IFN-γ增強(qiáng)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)的具體機(jī)制仍不清楚，需要我們進(jìn)一步研究探索。

1 Mueller-Ortiz SL,Morales JE,Wetsel RA.The receptor for the complement C3a anaphylatoxin (C3aR) provides host protection against Listeria monocytogenes-induced apoptosis.J Immunol,2014,193(3):1278-1289.

2 Niebuhr M,B?umer W,Kietzmann M,et al.Participation of complement 3a receptor (C3aR) in the sensitization phase of Th2 mediated allergic contact dermatitis.Exp Dermatol,2012,21(1):52-56.

3 Schulze-Tanzil G,Kohl B,El Sayed K,et al.Anaphylatoxin receptors and complement regulatory proteins in human articular and non-articular chondrocytes:interrelation with cytokines.Cell Tissue Res,2012,350(3):465-475.

4 Busch C,Girke G,Kohl B,et al.Complement gene expression is regulated by pro-inflammatory cytokines and the anaphylatoxin C3a in human tenocytes.Mol Immunol,2013,53(4):363-373.

5 Li K,Fazekasova H,Wang N, et al.Expression of complement components,receptors and regulators by human dendritic cells.Mol Immunol,2011,48(9-10):1121-1127.

6 Takabayashi T,Shimizu S,Clark BD,et al.Interleukin-1 upregulates anaphylatoxin receptors on mononuclear cells.Surgery,2004,135(5):544-554.

7 Tschernig T,Kiafard Z,Dibbert C, et al.Use of monoclonal antibodies to assess expression of anaphylatoxin receptors in rat and murine models of lung inflammation.Exp Toxicol Pathol,2007,58(6):419-425.

8 Danobeitia JS,Djamali A,Fernandez LA.The role of complement in the pathogenesis of renal ischemia-reperfusion injury and fibrosis.Fibrogenesis Tissue Repair,2014,7:16.

9 鄭敬民,朱小東,張明超,等.高表達(dá)C3aR的肥大細(xì)胞在糖尿病腎病患者腎組織中的分布及病理意義分析.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2011,38(3):262-268.

10 Navarro-González JF,Mora-Fernández C,Muros de Fuentes M,et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy.Nat Rev Nephrol,2011,7(6):327-340.

11 Schaefer M,Konrad S,Thalmann J,et al.The transcription factors AP-1 and Ets are regulators of C3a receptor expression.J Biol Chem,2005,280(51):42113-42123.

12 Kildsgaard J,Hollmann TJ,Matthews KW,et al.Cutting edge targeted disruption of the C3a receptor gene demonstrates a novel protective anti-inflammatory role for C3a in endotoxin-shock.J Immunol,2000,165(10):5406-5409.

13 Hawlisch H,Wills-Karp M,Karp CL,et al.The anaphylatoxins bridge innate and adaptive immune responses in allergic asthma.Mol Immunol,2004,41(2-3):123-131.

14 Benoist C，Mathis D.Mast cells in autoimmune disease.Nature,2002,420(6917):875-878.

15 鄭敬民,朱小東,張明超,等.過敏毒素受體(C3aR)在db/db糖尿病腎病小鼠腎臟中的表達(dá)及病理意義分析.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2010(8):847-854.

16 Caramori ML,Mauer M.Diabetes and nephropathy.Curr Opin Nephrol Hypertens,2003,12(3):273-282.

17 Gross JL,de Azevedo MJ,Silveiro SP,et al.Diabetic nephropathy:diagnosis,prevention,and treatment.Diabetes Care,2005,28(1):164-176.

18 Prodjosudjadi W,Gerritsma JS,van Es LA,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 in normal and diseased human kidneys:an immunohistochemical analysis.Clin Nephrol,1995,44(3):148-155.

19 Wu CC,Chen JS,Lu KC,et al.Aberrant cytokines/chemokines production correlate with proteinuria in patients with overt diabetic nephropathy.Clin Chim Acta,2010,411(9-10):700-704.

20 Hertzog P,Forster S,Samarajiwa S.Systems biology of interferon responses.J Interferon Cytokine Res,2011,31(1):5-11.

21 Pollard KM,Cauvi DM,Toomey CB,et al.Interferon-γ and systemic autoimmunity.Discov Med,2013,16(87):123-131.

22 Farrar MA,Schreiber RD.The molecular cell biology of interferon-gamma and its receptor.Annu Rev Immunol,1993,11:571-611.

23 Gerritsma JS,Gerritsen AF,De Ley M,et al.Interferon-gamma induces biosynthesis of complement components C2,C4 and factor H by human proximal tubular epithelial cells.Cytokine,1997,9(4):276-283.

(本文編輯 青 松)

Inflammatory cytokines regulate the expression of receptors for complement C3a on human renal tubular epithelial cells

ZHANGZhicheng,ZHAOWenjin,LIUZhihong,ZHENGJingmin

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases，JinglingHospital，SouthernMedicalUniversity，Nanjing210016,China

ZHENGJingmin(E-mail:zhengjingmin@yahoo.com)；LIUZhihong(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective：In previous work,we found that the increased expression of C3aR in renal tissue from patients with diabetic nephropathy,but the mechanism by which factor induces C3aR expression increased is not fully understood. Here,in order to better understand the regulatory factors for expression of C3aR in renal tissues,we studied the regulation of expression for C3a receptors in human renal tubular epithelial cells (HK2 cells) by multiple inflammatory cytokines. Methodology：Multiple inflammatory cytokines(IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β) were used to be co-cultivation with HK2 cells. Levels of messengers and protein for the C3a receptor (C3aR) in HK2 cells were shown by fluorescence quantitative-polymerase chain reaction、immunochemical staining and Western blot. Results：We discovered that inflammatory cytokine interferon-gamma (IFN-γ) can significantly promote the expression of C3aR in HK2 cells (Compared with control group,C3aR mRNA expression levels increase about 5 times,P=0.001<0.05,protein levels were up-regulated approximately 1.6-fold,P=0.046<0.05) and the up-regulation of C3aR on mRNA levels was dose- and time-dependent for it. However,other cytokines such as: TNF-α、TGF-β1、IL-1β and even biologically active polypeptide C3a were not observed visible impact on the expression of C3aR in HK2 cells. Conclusion：This present study not only proved tubular epithelial cell surface expressed C3a receptor (C3aR),but also proved that inflammatory cytokine interferon-γ could significantly enhance the expression of C3aR in HK2 cells,indicating that the C3a/C3aR axis may be involved in the regulation of renal local inflammatory reaction. It also suggested that C3a/C3aR axis was a certain degree of correlation with the occurrence and development of diabetic kidney disease.

inflammatory cytokines interferon-gamma renal tubular epithelial cells C3a receptor

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.02.007

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81370828)

南方醫(yī)科大學(xué)金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科 碩士研究生(張志誠)，國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

鄭敬民(E-mail:zhengjingmin@yahoo.com)；劉志紅(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)

2016-02-17

? 2016年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有