李善家，韓多紅，王恩軍，武 燕

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050; 2.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，甘肅 張掖 734000)

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外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞種子萌發(fā)和幼苗保護酶活性的影響

李善家1，韓多紅2，王恩軍2，武 燕1

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050; 2.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，甘肅 張掖 734000)

摘要：為了探究外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞(Lycium ruthenium)種子萌發(fā)及抗氧化物酶系活性的影響，對采自于河西走廊黑河中游的黑果枸杞進行種子萌發(fā)及幼苗生長試驗，測定其發(fā)芽率(GP)、發(fā)芽勢(GV)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)、相對鹽害率和抗氧化物酶系[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)]等指標。結(jié)果顯示，25 mmol·L-1的NaCl處理，對黑果枸杞種子的萌發(fā)具有促進作用，50～300 mmol·L-1的NaCl處理則有抑制作用；黑果枸杞種子萌發(fā)的NaCl濃度的臨界值是50 mmol·L-1，極限值是300 mmol·L-1；隨著NaCl濃度的增加，SOD、POD和CAT活性均不同程度地表現(xiàn)為“先上升，后下降”的趨勢。在添加外源甜菜堿處理后，各NaCl濃度處理下的SOD、POD和CAT活性均有不同程度的增加。綜上表明，甜菜堿能有效減緩鹽脅迫對黑果枸杞種子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生的傷害，提高種子及幼苗的抗鹽能力。

關(guān)鍵詞:甜菜堿; 鹽脅迫; 種子萌發(fā); 抗氧化酶

鹽堿地是地球陸地上分布較廣泛的一種土地資源，隨著現(xiàn)代工業(yè)和灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，環(huán)境持續(xù)惡化，鹽堿地的面積也在逐年擴大，已成為全球重要的后備土地資源。我國從濱海到內(nèi)陸，從低地到高原都分布著不同類型的鹽堿土壤，它們主要分布于西北、華北、東北和濱海地區(qū)，總面積達到2 000萬hm2，約占總耕地面積的10%[1]。黑河流域地處西北干旱區(qū)，屬于典型的內(nèi)流盆地，氣候干燥，蒸發(fā)量是降水量的35～77倍，惡劣的自然條件和人為的不合理灌溉導致了嚴重的土壤鹽漬化。如何利用已經(jīng)鹽漬化的土地，尋找適合其生長的植物成為解決土地資源困境的主要途徑。在鹽脅迫作用下，植物生長受到抑制，光合作用減弱，代謝失調(diào)，嚴重時出現(xiàn)植株萎蔫，甚至死亡。甘氨酸甜菜堿是一種在較大生理pH值范圍內(nèi)呈電中性的季銨類化合物，極易溶于水，廣泛分布在植物、動物和細菌體內(nèi)。近年來, 外源甜菜堿與植物抗逆性的研究日益受到人們的重視，在鹽脅迫、水分及低溫等脅迫下, 一些植物均檢測到較高濃度的甜菜堿類化合物的積累[2]。甜菜堿作為滲透調(diào)節(jié)劑、酶的保護劑，其積累使許多代謝關(guān)鍵酶在滲透脅迫下能繼續(xù)保持活性，在一定程度上保持了鹽脅迫下細胞膜的完整性[3]。

黑果枸杞(Lyciumruthenium)，為茄科(Solanaceae)枸杞屬多年生耐鹽、抗旱植物，多分布于我國西北地區(qū)的鹽堿土荒地、鹽化沙地、路旁等各種鹽漬化土壤或荒漠環(huán)境。果實入藥，其味甘、性平，是民族醫(yī)藥中的常用藥材，據(jù)《晶珠草本》、《四部醫(yī)典》記載，藏醫(yī)以其成熟的果實入藥，治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥[4]；而《維吾爾藥志》中將其果實和根皮治療尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血等病癥，具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、補血安神、生津止渴、潤肺止咳、清熱除蒸、清肺降火、補虛等功效[5]。其成熟漿果中富含紫紅色素，又屬于珍稀的天然花色苷類色素資源，具有清除自由基、抗氧化的功能[6]。目前，對黑果枸杞的研究主要集中在天然花色苷色素和多糖提取工藝及藥理研究方面[7-9]，部分學者也對其種子萌發(fā)的耐鹽性進行了研究[10-12]。但對于鹽脅迫下添加甜菜堿等方面的研究鮮有報道，為此，本研究通過分析鹽脅迫下外源甜菜堿處理對黑果枸杞種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，探討黑果枸杞在鹽脅迫下的耐受性及其閾值，旨為河西走廊大片鹽堿化土地上的引種馴化、培育保護和大面積種植等提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

黑果枸杞成熟種子于2013年9月采自甘肅省張掖市荒漠鹽堿地，為多年生野生種。將種子洗凈后，自然風干，隨即開始試驗。

1.2試驗設(shè)計與測定方法

1.2.1種子萌發(fā)指標的測定選擇籽粒飽滿、大小一致的種子，用5%的NaClO消毒3 min，蒸餾水沖洗6次。設(shè)定NaCl的濃度為0、25、50、100、150、200、300 mmol·L-1共7個處理，以NaCl濃度0為對照(CK)，添加的甜菜堿濃度為10 mmol·L-1(表1)。依照國際種子檢驗規(guī)程，發(fā)芽床采用濾紙法，將吸脹后的種子置于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加入配制好的處理液，每個培養(yǎng)皿中放50粒種子，每個處理均設(shè)3次重復，置于人工氣候箱中，設(shè)定溫度為25 ℃，光照時間為10 h，光照強度為2 000 lx。每天觀察統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，第3天計算發(fā)芽勢，第13天計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和相對鹽害率。

表1　鹽脅迫及外源甜菜堿對黑果枸杞種子及幼苗的試驗處理

發(fā)芽勢(Germination vigor,GV)=(3 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試所有種子數(shù))×100%。

發(fā)芽率(Germination percentage,GP)=(13 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試所有種子數(shù))×100%。

發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt)。；

活力指數(shù)(Vigor index,VI)=S×Gi。

式中，Gt為t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)，S為平均根長，根長使用游標卡尺進行測量。

相對鹽害率=(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率×100%。

1.2.2幼苗抗氧化酶活性的測定選取長勢良好的幼苗，將幼苗從培養(yǎng)皿中取出，根部用無菌蒸餾水沖洗干凈，移入裝有蛭石的育苗缽(直徑15 cm×高5 cm)內(nèi)，用Hoagland培養(yǎng)液進行澆灌，在幼苗二葉期時定苗，每缽留生長一致的幼苗15株，3個重復，50 d后進行處理。每天每缽分早晚加5 mL處理液，以蒸餾水為對照。處理7 d后測定保護酶的活性。過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法測量[13]，以每分鐘吸光度的變化表示酶活力的大小，即以每分鐘A值減小0.01定義為1個酶活力單位(U)；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑顯色法(NBT)測定[13]，以抑制NBT光化還原50%所需的酶量為1個酶活力單位(U)，然后再計算出酶活力。過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定[13]，以每分鐘A值減小0.1定義為1個酶活力單位(U)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(P<0.05)，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較；采用Excel 2010制圖。

2結(jié)果與分析

2.1外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

不同濃度的鹽脅迫都對黑果枸杞的種子萌發(fā)產(chǎn)生了影響，25 mmol·L-1處理有一定的促進作用，50～300 mmol·L-1處理有抑制作用。在NaCl、NaCl+甜菜堿處理下(圖1)，T1的發(fā)芽勢分別為55.11%、58.17%，均顯著高于CK(40.83%)(P<0.05)；T2與CK間無顯著差異(P>0.05)。T3～T6，各處理的發(fā)芽率隨處理濃度的增大而降低，且顯著低于CK(P<0.05)；在T6處理中，發(fā)芽勢為0。NaCl+甜菜堿處理下，各處理的發(fā)芽勢與NaCl脅迫下相比沒有明顯的增大，說明添加外源甜菜堿對種子發(fā)芽整齊度影響不大。

在NaCl處理下(圖2)，25 mmol·L-1的發(fā)芽率(69.17%)高于CK(66.25%)，50 mmol·L-1(63.33%)的低于CK，但25、50 mmol·L-1與CK間無顯著差異(P>0.05)。100～300 mmol·L-1的發(fā)芽率均顯著低于CK(P<0.05)，且隨濃度的增大而降低，在300 mmol·L-1時為0。在NaCl+甜菜堿處理下，25 mmol·L-1(70.51%)、50 mmol·L-1(68.68%)的發(fā)芽率均高于CK(66.25%)，但與CK間無顯著性差異(P>0.05)。100～300 mmol·L-1，各處理的發(fā)芽率也隨處理濃度的增大而降低，且顯著低于CK(P<0.05)。NaCl+甜菜堿處理下，50～300 mmol·L-1的發(fā)芽率均比NaCl處理下的高，且隨著濃度的增大下降的趨勢變緩。

圖1　不同處理下黑果枸杞種子的發(fā)芽率

注：T1、T2、T3、T4、T5、T6同表1所示。不同小寫字母表示NaCl或NaCl+甜菜堿處理處下CK、T1、T2、T3、T4、T5和T6差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：T1、T2、T3、T4、T5、T6 Same at table 1.Different lower case letters show significant difference among CK, T1, T2, T3, T4, T5 and T6 under NaCl or NaCl+Betaine treatment at 0.05 level.

圖2　不同處理下黑果枸杞種子的發(fā)芽勢

2.2外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

在NaCl處理下(圖3)，T1的發(fā)芽指數(shù)與CK間差異不顯著(P>0.05)；T2～T6的發(fā)芽指數(shù)均顯著低于CK(P<0.05)，且隨濃度的增大而降低，在T6時為0。在NaCl+甜菜堿處理下，T1的發(fā)芽指數(shù)(8.13)顯著高于CK(7.63)，T2～T6的發(fā)芽指數(shù)均顯著低于CK。

在NaCl、NaCl+甜菜堿處理下(圖4)，T1～T6的活力指數(shù)均低于CK，并隨濃度的增大而降低；在NaCl處理下，各處理與CK間存在顯著性差異(P<0.05)。但在NaCl+甜菜堿處理下，各處理的活力指數(shù)與NaCl脅迫下相比均有不同程度的增大，說明外源甜菜堿可緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響。

圖3　不同處理下黑果枸杞種子的發(fā)芽指數(shù)

圖4　不同處理下黑果枸杞種子的活力指數(shù)

在NaCl+甜菜堿處理下，T2～T6的發(fā)芽率均比NaCl處理下的高，但各處理的發(fā)芽勢與NaCl脅迫下相比沒有明顯的增大，說明添加外源甜菜堿對種子發(fā)芽整齊度影響不大；發(fā)芽率，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有所增大(圖1-4)。

2.3外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞種子相對鹽害率的影響

在NaCl處理下(圖5)，T1的相對鹽害指數(shù)最小，為-4.4%，T6最大，為100%；T1、T2與CK之間沒有顯著性差異(P>0.05)，T3～T6均顯著高于CK(P<0.05)。在NaCl+甜菜堿處理下，T1的相對鹽害指數(shù)更小，為-9.47，T6最大，為100%；T1、T2與CK之間沒有顯著性差異(P>0.05)，T3～T6各處理均顯著高于CK(P<0.05)。在NaCl+甜菜堿處理下，與NaCl相比，T1降低了115.23%，T2降低了84.77%，但T6沒有降低，說明添加甜菜堿能緩解低濃度的鹽脅迫傷害，但對高濃度鹽脅迫作用不明顯。

圖5　不同處理下黑果枸杞種子的相對鹽害率

2.4外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞幼苗POD、SOD、CAT活性的影響

在NaCl處理下(圖6)，幼苗中POD含量隨濃度的增加而呈現(xiàn)出了先升高后降低的趨勢，在T3時最大，為6.28 U·g-1，是CK的165%，T6時最小，為1.99 U·g-1；在NaCl+甜菜堿處理下，幼苗中POD活性均比NaCl處理下的有不同程度地增加，但也隨著處理濃度的增加而逐漸下降；T2～T6各處理均與CK間存在顯著性差異(P<0.05)。其中NaCl+甜菜堿處理下的T3最大，為7.59 U·g-1，是NaCl處理下T3的121%；T4～T6，在NaCl+甜菜堿處理下較NaCl處理，幼苗中POD活性下降的幅度減小。

圖6　不同處理下黑果枸杞幼苗POD的活性

在NaCl和NaCl+甜菜堿處理下(圖7)，幼苗中SOD活性均隨濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在T3時最大，分別為9.28、11.59 U·g-1，分別是CK的292%、364%。在NaCl處理下，T1～T6與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)，而在NaCl+甜菜堿處理下，T2～T5與CK間均存在顯著性差異；NaCl+甜菜堿處理相比于NaCl處理，幼苗中SOD含量均出現(xiàn)了不同程度的增加，且在T4-T6處理間，隨濃度增大而下降，但下降的幅度較小。

圖7　不同處理下黑果枸杞幼苗SOD的活性

在NaCl和NaCl+甜菜堿處理下(圖8)，幼苗中CAT活性均隨處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在T3時最大，分別為6.28、8.59 U·g-1，分別是CK的224%、307%。在NaCl處理下，T1～T5與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)，而在NaCl+甜菜堿處理下，T2～T5與CK間均存在顯著性差異；NaCl+甜菜堿相比于NaCl處理，幼苗中CAT含量均出現(xiàn)了不同程度的增加，其中最大增加了36.78%；在T4～T6處理時，CAT活性均隨濃度增大而下降，但NaCl+甜菜堿處理下的下降幅度較小。

圖8　不同處理下黑果枸杞幼苗CAT的活性

3討論與結(jié)論

植物最重要的繁殖器官是種子，因此植物種子在萌發(fā)階段的耐鹽狀況可以反映該物種的耐鹽能力[14]。通常情況下，非鹽生植物在鹽脅迫環(huán)境中其生長受到抑制，而鹽生植物生長則需要一定濃度的鹽環(huán)境才能正常生長，只有當外界鹽濃度超過生長最適鹽度時其生長才減緩，甚至在缺Na+時不能完成其生活史[15]。本研究中，當NaCl濃度小于25 mmol·L-1時，對黑果枸杞種子的萌發(fā)有一定的促進作用，但促進作用不明顯，當濃度大于25 mmol·L-1時，則有抑制作用，且抑制程度隨脅迫濃度的增加而加強，當濃度達到300 mmol·L-1時，種子失去萌發(fā)能力，這與其他研究者對黑果枸杞[10-11]和紫蘇(Perillafrutessens)[16]的研究結(jié)果一致。在添加外源甜菜堿后，鹽脅迫下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)等萌發(fā)指標均有不同程度的增加，且在隨鹽濃度增加而下降時，降低的幅度變小。說明黑果枸杞是鹽生植物，其種子的萌發(fā)需要一定的鹽分，適度的鹽分可促進種子萌發(fā)，但過高的鹽分則會對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，與關(guān)于紅砂(Reaumuriasongarica)[17]的研究結(jié)果一致。添加外源甜菜堿可有效的緩解鹽脅迫對其種子萌發(fā)的傷害作用。

鹽脅迫可引起體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，由于ROS的增加，細胞體內(nèi)的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性都會有所升高以清除產(chǎn)生的ROS[15,18]。一般來講，在鹽分脅迫下，植物體內(nèi)的(SOD、POD、CAT)等酶活性與植物的抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)，能有效地清除活性氧，抑制膜質(zhì)過氧化[16]。逆境中保護酶活性增強或維持較高的水平，才能清除活性氧自由基使之保持較低水平，防止自由基對生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞[19]。本研究中，隨著鹽脅迫濃度的增加，抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均不同程度地表現(xiàn)為“先上升，后下降”的趨勢；在100 mmol·L-1的范圍內(nèi)，SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)了不同程度的升高，且均高于CK；當鹽脅迫濃度大于100 mmol·L-1時，保護酶活性均隨濃度的增加而下降；原因是在低濃度鹽脅迫下，幼苗可通過提高保護酶活性加強耐鹽性從而減輕鹽對自身的傷害，但這種能力是很有限的，當鹽含量超出一定程度后，保護酶的活性就會降低，這與譚會娟等[20]對紅砂耐鹽性的研究結(jié)果是一致的。在添加外源甜菜堿后，在各個處理下的SOD、POD和CAT活性均高于NaCl處理下的值，在鹽脅迫濃度大于100 mmol·L-1并不斷增大時，三大保護酶活性均隨濃度的增加而下降，但降低的幅度減小。

甜菜堿作為一種非毒性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要分布于植物葉綠體和細胞質(zhì)中逐漸積累以降低滲透勢，同時作為保護物質(zhì)維持植物正常的生理功能和代謝活動[2]，在鹽脅迫環(huán)境下，其還可以不同程度地提高細胞保護酶的活性，降低活性氧自由基對質(zhì)膜的傷害和膜脂過氧化作用水平，維持細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性[21]。相關(guān)研究也證明了鹽脅迫下施用適宜濃度的甜菜堿可改善黑果枸杞幼苗的耐鹽能力，提高其對鹽脅迫逆境的適應(yīng)性[21]。綜上所述，鹽脅迫下添加適宜濃度的外源甜菜堿可有效的緩解鹽脅迫對黑果枸杞種子萌發(fā)的影響，提高其萌發(fā)率，萌發(fā)速度和出苗整齊度等；可顯著地提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性，增強了清除細胞內(nèi)氧自由基的能力，減輕了鹽脅迫對其幼苗的傷害，為黑果枸杞的引種馴化、種質(zhì)資源的保護以及西北干旱鹽堿地的合理利用提供科學數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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Effects of exogenous betaine on seed germination and antioxidase activities ofLyciumrutheniumseedlings under NaCl stress

Li Shan-jia1, Han Duo-hong2, Wang En-jun2, Wu Yan1

(1.School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China;2.College of Agricultural and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China)

Abstract:In order to investigate the effects of exogenous betaine on seed germination, activities of antioxidase enzymes of Lycium ruthenium under NaCl stress. The L. ruthenium seed germination and seedling growth were studied in middle reaches of Heihe River of Hexi Corridor. Several physiological indexes, such as the germination percentage (GP), germination vigor (GV), germination index (GI), vigor index (VI), and relative salt damage rate, antioxidant enzymes (SOD, POD and CAT) were measured. The results indicated that, low NaCl concentration (25 mmol·L-1) could promote the seed germination but high NaCl concentration (50～300 mmol·L-1) could inhibit the seed germination. The NaCl concentration threshold for seed germination in L. ruthenium was 50 mmol·L-1, the maximum was 300 mmol·L-1; The SOD, POD and CAT activity showed a trend of first rising and then falling along with the salt concentration increasing. After the treatment by exogenous betaine, SOD, POD and CAT activity increased to some extent, but they had less decrease range under NaCl stress. Exogenous betaine could significantly alleviate the damages to the seeds and seedlings of L. ruthenium under NaCl stress and promote the salt resistance of the seeds and seedlings.

Key words:Lycium ruthenicum; exogenous glycinebetaine; NaCl stress; seed germination; antioxidase

Corresponding author:Han Duo-hongEmai:handuohong@163.com

中圖分類號：S567.1+9;Q945.78

文獻標識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)4-0674-07*

通信作者：韓多紅(1977-)，男，甘肅張掖人，副教授，本科，主要從事植物資源開發(fā)及藥用植物研究。E-mail:handuohong@163.com

基金項目：國家自然科學基金——黑河下游荒漠植物黑果枸杞分布格局及鹽堿適應(yīng)性研究(41261013)；甘肅省青年科技基金計劃——黑河流域荒漠植被生態(tài)化學計量特征及其機制研究(1308RJYA031)；甘肅省自然科學基金金——河西走廊常見栽培中藥材耐堿特性的研究(145RJZG191)

收稿日期：2015-07-13接受日期：2016-01-19

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0404

李善家,韓多紅,王恩軍,武燕.外源甜菜堿對鹽脅迫下黑果枸杞種子萌發(fā)和幼苗保護酶活性的影響.草業(yè)科學,2016,33(4)：674-680.

Li S J,Han D H,Wang E J,Wu Y.Effects of exogenous betaine on seed germination and antioxidase activities ofLyciumrutheniumseedlings under NaCl stress.Pratacultural Science，2016,33(4)：674-680.

第一作者：李善家(1980-)，男，甘肅蘭州人，講師，博士，主要從事干旱環(huán)境植物生理生態(tài)學研究。E-mail:lishanjia@lut.cn