張建美　許皖　鐘贛生　趙桐　范盎然　柳海艷　郭巖松　修琳琳　王思睿

100029　北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院[張建美(碩士研究生)、許皖(碩士研究生)、郭巖松(碩士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學院方藥系(鐘贛生、柳海艷)，科研實驗中心(范盎然)；中國中醫(yī)藥出版社(趙桐)

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甘遂半夏湯加減甘遂甘草不同給藥次數(shù)對腹水大鼠水通道蛋白-2基因及腎凋亡的影響

張建美許皖鐘贛生趙桐范盎然柳海艷郭巖松修琳琳王思睿

100029北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院[張建美(碩士研究生)、許皖(碩士研究生)、郭巖松(碩士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學院方藥系(鐘贛生、柳海艷)，科研實驗中心(范盎然)；中國中醫(yī)藥出版社(趙桐)

【摘要】目的觀察不同給藥次數(shù)條件下的甘遂半夏湯加減甘遂甘草反藥組合對腹水模型大鼠腎臟水通道蛋白(aquaporin, AQP)-2 mRNA 表達及腎組織凋亡的影響。 方法采用Walker-256細胞制造癌性腹水模型，將Wistar大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、全方給藥一次組、去草給藥一次組、去遂給藥一次組、去草遂給藥一次組、全方給藥二次組、去草給藥二次組、去遂給藥二次組、去草遂給藥二次組，共計11組。給藥一次組每天上午給藥一次，給藥二次組上午下午各給藥一次，一二次組每天給藥總量一致。腹水長成14天取材，摘取腎臟，液氮保存，進行PCR和免疫組化實驗。 結(jié)果甘遂半夏湯全方給藥一次組和全方給藥二次組的AQP-2 mRNA 表達及腎組織凋亡無明顯差異。但全方組的AQP-2 mRNA表達及腎組織凋亡均較全方去一味或兩味反藥組有降低趨勢。 結(jié)論含甘遂甘草反藥組合的甘遂半夏湯全方給藥一次組和給藥二次組抑制AQP-2 mRNA表達和對癌性腹水造成的腎組織細胞過度凋亡的減緩作用無明顯差異，且均優(yōu)于全方去掉一味或兩味反藥組。

【關(guān)鍵詞】甘遂；甘草；反藥組合；水通道-2信使RNA；腎組織凋亡

甘遂半夏湯首載于東漢張仲景的《金匱要略》[1]:“病者脈伏，其人欲自利，利反快，雖利心下續(xù)堅滿，此為留飲欲去故也，甘遂半夏湯主之?！爆F(xiàn)代醫(yī)家主要將其應(yīng)用于滲出性胸膜炎、肝硬化腹水等癥[2]。但由于甘遂半夏湯組方中包含甘遂甘草兩味中藥，屬中藥配伍禁忌中相反藥物配伍，醫(yī)家在臨床使用過程中多有忌憚，大大限制了其使用。然而近年大量科研工作者的實驗表明，甘遂甘草反藥組合的使用并不是完全禁忌的，而是受不同條件限制的[3-4]。為此，筆者以癌性腹水大鼠為模型，進行了甘遂半夏湯加減甘遂甘草反藥組合對大鼠腎臟水通道蛋白(aquaporin, AQP)-2 mRNA 表達及腎組織凋亡影響的實驗研究，以探討給藥次數(shù)是否會影響甘遂甘草配伍后產(chǎn)生的毒性和藥效，以及該影響是否與反藥組合相關(guān)。

1材料與方法

1.1實驗動物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級。動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2006-0009。

1.2實驗藥物

醋甘遂為大戟科植物甘遂EuphorbiakansuiT. N. Liou ex T. P. Wang的干燥塊根醋制而成，由安徽豐原銅陵中藥飲片廠(120301)提供；炙甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖蜜制而成，由安徽豐原銅陵中藥飲片廠(120201)提供。法半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb) Breit. 的塊莖，經(jīng)甘草和生石灰炮制而成，由安徽豐原銅陵中藥飲片廠(100701)提供；白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall. 的根，自行浸泡、切片、烘干備至實驗所需飲片，由磐安科信中藥材生產(chǎn)力促進中心提供；呋塞米由江蘇安邦艾普森藥業(yè)有限公司提供(H32021428)提供。

1.3藥物制備

陽性藥(呋塞米)：給藥濃度為4.2 g/kg。藥液制備為0.42 g/mL。

甘遂半夏湯處方：醋甘遂1 g/kg(研末)，炙甘草15 g/kg，法半夏0.9 g/kg，白芍1.5 g/kg, 蜂蜜1.5 g/kg。(此劑量為課題前期結(jié)果，醋甘遂與炙甘草按照1∶15比例配伍時，具有一定的肝損傷)

甘遂半夏湯全方藥液的制備：將炙甘草、法半夏、白芍加入10倍量水浸泡1小時，大火煮沸后小火煎煮1小時，將藥液倒出。再加入8倍量水煎煮，大火沸騰后小火煎煮1小時。將兩次煎煮的藥液合并，加入蜂蜜，放置于水浴鍋上濃縮至1.89 g/mL，臨用時按比例加入醋甘遂粉末，加水至1.99 g/mL。

甘遂半夏湯去炙甘草藥液的制備：將法半夏、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至0.78 g/mL，臨用時按比例加入醋甘遂粉末，加水至0.49 g/mL。

甘遂半夏湯去醋甘遂藥液的制備：將炙甘草、法半夏、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至1.89 g/mL。

甘遂半夏湯去炙甘草醋甘遂藥液的制備：將法半夏、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至0.39 g/mL。

1.4試劑

PCR實驗試劑：DEPC處理水(北京索來寶科技有限公司， 生產(chǎn)批號：20140822)；Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司，生產(chǎn)批號：66014)；Gold View核酸染料(北京索來寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20140510)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，生產(chǎn)批號：00169216]；OligdT[生工生物工程(上海)股份有限公司，生產(chǎn)批號：109302I]；2×tag mix(北京索來寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20140901)；Marker I DNA Ladder(北京索來寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20140402)；6×DNAloading Buffer(北京索來寶科技有限公司, D1010)；5×TBE(北京索來寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20141021)；Agarose 瓊脂糖(伯齊科技有限公司，生產(chǎn)批號：111860)；三氯甲烷(北京化工廠，生產(chǎn)批號：20140312)；異丙醇(北京化工廠，生產(chǎn)批號：20140417)；無水乙醇(北京化工廠，生產(chǎn)批號：20140409)。

腎臟凋亡檢測試劑：1MTris-Hcl緩沖液(Ph=7.5)(北京索來寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20140403)；蛋白酶K(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：14374846)；3%雙氧水(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：131023)；二甲苯(北京益利精細化學品有限公司，生產(chǎn)批號：1208122)。

1.5造模與給藥方法

將凍存于-70℃冰箱中的Walker-256細胞于37℃水浴中復蘇，分為0.5 mL、0.8 mL、1 mL的不同劑量注入大鼠體內(nèi)，大鼠長出腹水后抽取其腹水以每只1 mL的劑量注入健康大鼠體內(nèi)進行二次傳代，二次傳代的大鼠長出腹水后，選取黃色澄清腹水進行細胞計數(shù)，生理鹽水稀釋至1.68×106個細胞/mL，注入正式實驗的大鼠體內(nèi)，每只注射1 mL。1.6分組

將大鼠按體質(zhì)量進行隨機分組，組別為空白組、模型組、陽性對照組、甘遂半夏湯全方給藥一次組(簡稱全方一次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草給藥一次組(簡稱去草一次組)、甘遂半夏湯全方去醋甘遂給藥一次組(簡稱去遂一次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草醋甘遂給藥一次組(簡稱去草遂一次組)、甘遂半夏湯全方給藥二次組(簡稱全方二次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草給藥二次組(簡稱去草二次組)、甘遂半夏湯全方去醋甘遂給藥二次組(簡稱去遂二次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草醋甘遂給藥二次組(簡稱去草遂二次組)，共計11組。

每組20只大鼠，各組于造模后第二天開始灌胃?？瞻捉M、模型組分別1 mL/100 g每天一次給予生理鹽水灌胃。給藥一次組及陽性藥組按1 mL/100 g每天一次灌胃，給藥二次組上午下午按照每次0.5 mL/100 g每天兩次灌胃。1.7樣本取材與指標檢測

給藥14天取材。所有大鼠在取材前一天晚上8點禁食不禁水，禁食12小時，次日取材前1小時灌胃一次，之后10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，迅速取出一側(cè)腎臟，選取同一部位腎組織約黃豆大小一塊，置于凍存管中，液氮凍存。取另一側(cè)腎臟放入10%甲醛溶液中固定，待檢測相關(guān)指標。每組選取8個組織樣本進行RT-PCR檢測，選取3個組織樣本進行腎臟免疫組化調(diào)亡檢測。1.7.1腎臟AQP-2 mRNA指標檢測RT-PCR法對腎臟AQP-2 mRNA表達進行檢測。

(1)PCR引物合成:AQP引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，具體堿基序列如表1所示。

(2)cDNA擴增:取各組RT反應(yīng)產(chǎn)物配制PCR

表1　PCR引物信息

擴增反應(yīng)液，成分組成如下：GAPDH Forward Primer 0.25 μL，GAPDH Reverse Primer 0.25 μL，AQP-2 Forward Primer 0.4 μL，AQP-2 Reverse Primer 0.4 μL，2x tag mix 10 μL，CDNA 2 μL，dH2O 6.7μL。

反應(yīng)條件：

Stage 1:預(yù)變性——94℃: 3分鐘

Stage 2:PCR反應(yīng)——(Reps: 32)94℃:30秒→59℃:30秒→72℃:1分鐘→72℃延伸8分鐘

(3)數(shù)據(jù)采集:1.2% 瓊脂糖凝膠電泳。以GAPDH作為內(nèi)標，計算公式如下：RNA含量=目的基因/GAPDH

1.7.2腎臟免疫組化凋亡檢測Tunnel法檢測腎臟細胞凋亡，操作按說明。光鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件進行細胞計數(shù)。

1.8統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1不同給藥次數(shù)條件下的甘遂半夏湯加減甘遂甘草反藥組合對腹水大鼠腎臟AQP-2 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組、陽性藥組、去草一次組、去遂一次組、去遂二次組、去草遂一次組、去草遂二次組腎臟AQP-2 mRNA表達量升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；而與模型組比較，全方一次組、去草一次組表達量降低，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)，全方二次組表達量具有降低趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與全方一次組比較，去遂一次組、去草遂一次組表達量升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與全方二次組比較，去草二次組、去遂二次組、去草遂二次組表達量具有升高趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2，圖1。

表2　各組大鼠AQP-2 mRNA表達的結(jié)果

注： 每組選取8個樣本進行RT-PCR檢測。在后期數(shù)據(jù)分析中，空白組及模型組不符合正態(tài)分布，每組分別有兩個數(shù)據(jù)被剔除。

圖1　各組大鼠腎臟AQP-2 mRNA電泳結(jié)果

2.2不同給藥次數(shù)條件下的甘遂半夏湯加減甘遂甘草反藥組合對腹水大鼠腎組織凋亡的影響

與空白組相比較，模型組、陽性藥組、去草一次組、去遂一次組、去草遂一次組、去草遂二次組大鼠腎組織凋亡增加，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；其余各給藥組凋亡具有增加趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與模型組比較，陽性藥組、全方一次組、去遂一次組、去草遂一次組、全方二次組、去草遂二次組凋亡減輕，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)。與全方一次組比較，去遂一次組、去草遂一次組凋亡增加，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；去草一次組凋亡具有增加趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與全方二次組比較，去草遂二次組凋亡增加，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；去草二次組凋亡具有增加趨勢，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　大鼠腎組織凋亡的結(jié)果±s)

3討論

以往對于“十八反”的探討多在生理狀態(tài)下集中在單純的反藥藥對上，而本實驗以含有反藥組合的復方為基礎(chǔ)，在特定病理模型的基礎(chǔ)上進行研究。甘遂半夏湯為治療腹水的經(jīng)典名方，本實驗選取與甘遂半夏湯逐水作用密切相關(guān)的腎臟指標AQP-2基因表達及腎臟細胞凋亡為研究對象，從一定程度上反映出甘遂甘草反藥組合對甘遂半夏湯治療腹水作用的影響。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)，又稱水蛋白，它是一組與水通透相關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白。其中AQP-2是加壓素依賴性水通道蛋白,主要位于腎集合管主細胞管腔側(cè)及其附近的囊泡內(nèi)，用以調(diào)節(jié)腎臟集合管對水通透性，在調(diào)節(jié)腎臟水平衡中起到了重要作用[5]。它可使水液的重吸收增加，尿量減少，尿液濃縮。研究表明，AQP-2數(shù)量受抗利尿激素的調(diào)節(jié)，當激素水平降低時,主細胞管腔膜出現(xiàn)胞吞作用，形成含AQP-2的囊泡遷移到管腔膜下的胞漿內(nèi)，導致AQP-2數(shù)量相應(yīng)地減少[6]。另有臨床報道，肝硬化腹水患者尿液AQP-2含量明顯高于無腹水患者[7]。本實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組及多個給藥組AQP-2 mRNA表達升高，提示walker-256惡性腹水模型可能影響AQP-2 mRNA表達，使腎集合管對水重吸收增強，尿量減少，導致腹水的進一步發(fā)展，此結(jié)果與臨床報道中AQP-2變化趨勢一致。與模型組比較，全方一次組和全方二次組AQP-2 mRNA表達降低，提示甘遂半夏湯可以抑制集合管對水的重吸收，增加尿量，從而減緩惡性腹水的進一步發(fā)展，但給藥次數(shù)對這種減緩作用無影響，且全方組的作用優(yōu)于全方去掉一味或兩味反藥組。

細胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞自主有序的死亡，此過程是由基因控制的。細胞凋亡與被動的細胞壞死不同，它是一個主動過程，并涉及基因的激活、表達以及調(diào)控等一系列作用。它是機體為了更好地適應(yīng)環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程[8]。本實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組及各個給藥組平均光密度值升高，說明walker-256癌性腹水模型對大鼠腎組織造成了損傷。與模型組比較，全方一次組和全方二次組平均光密度值降低，說明甘遂半夏湯具有減緩癌性腹水造成的腎組織細胞過度凋亡的作用。但給藥次數(shù)未對這種減緩作用造成影響，且全方的作用優(yōu)于全方去掉一味或兩味反藥組。

參考文獻

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(本文編輯： 蒲曉田)

Comparing the effect ofGansuiBanxiadecoction plus or reduce kansui and glycyrrhiza on AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue in ascites rats under different times

ZHANGJian-mei，XUWan，ZHONGGan-sheng，etal.

SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstract】ObjectiveTo find out the effect of Gansui Banxia decoction plus or reduce kansui and glycyrrhiza under different times of administration on AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue in malignant ascites rats. MethodsWalker-256 cells were used to induce the malignant ascites rat model. The Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, furosemide group, once or twice of Gansui Banxia decoction group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed kansui group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza and kansui group. Once group was gavaged at morning, and twice group was gavaged at morning and afternoon, which total dose was as much as the once group. After 14 days’ feed, kidney was collected and kep in liquid nitrogen and then RT-PCR and immunohistochemistry experiments was conducted. ResultsThe result of AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue showed no difference in once and twice Gansui Banxia decoction group, but showed a decreasing tendency compared to the groups removed one or two imcompatible pairs. ConclusionDiuresis of Gansui Banxia decoction is better than it removed one or two imcompatible pairs. Gansui Banxia decoction can reduce the excessive apoptosis of kidney tissue and the effect of whole prescriptionis is better than it removed one or two imcompatible pairs.

【Keywords】Kansui；Glycyrrhiza；Anti herb combination；Aquaporin-2 mRNA；Apoptosis of kidney tissue

(收稿日期：2016-01-05)

Corresponding author:ZHONG Gan-sheng, E-mail： zhonggansheng@sohu.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.005

作者簡介：張建美(1986- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥性理論研究。E-mail：kkmm20110814@163.com通訊作者： 鐘贛生(1961- )，碩士，教授，博士生導師。研究方向：中藥藥性理論研究。 E-mail：zhonggansheng@sohu.com

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (2011CB505306)；北京中醫(yī)藥大學2015年度基本科研業(yè)務(wù)費項目(在讀研究生項目)(2015-JYB-XS033)