張建美　許皖　鐘贛生　趙桐　賈旭　柳海艷　郭巖松　修琳琳　王思睿

100029　北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[張建美(碩士研究生)、許皖(碩士研究生)、郭巖松(碩士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系(鐘贛生、柳海艷)，科研實驗中心(賈旭)；中國中醫(yī)藥出版社(趙桐)

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甘遂半夏湯加減甘遂甘草不同給藥次數(shù)對腹水大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

張建美許皖鐘贛生趙桐賈旭柳海艷郭巖松修琳琳王思睿

100029北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[張建美(碩士研究生)、許皖(碩士研究生)、郭巖松(碩士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系(鐘贛生、柳海艷)，科研實驗中心(賈旭)；中國中醫(yī)藥出版社(趙桐)

【摘要】目的同給藥次數(shù)條件下的甘遂半夏湯加減甘遂甘草反藥組合對腹水模型大鼠肝臟病理形態(tài)的影響。 方法采用Walker-256細(xì)胞制造癌性腹水模型，將Wistar大鼠按體重隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、全方給藥一次組、去草給藥一次組、去遂給藥一次組、去草遂給藥一次組、全方給藥二次組、去草給藥二次組、去遂給藥二次組、去草遂給藥二次組，共計11組。給藥一次組每天上午給藥1次，給藥二次組上午、下午各給藥1次，一二次組每天給藥總量一致。腹水長成14天后取材，摘取肝臟，制成病理切片，在光鏡下觀察大鼠肝臟的病理形態(tài)變化，并進行半定量評分。 結(jié)果模型組肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，全方給藥一次組及二次組肝損傷較模型組明顯減輕，且一次組的減輕程度大于二次組。與全方一次組比較，去草一次組、去遂一次組、去草遂一次組肝損傷加重；與全方二次組比較，去草二次組、去遂二次組、去草遂二次組肝損傷加重。結(jié)論全方給藥一次組和二次組對肝損傷均有一定的改善作用，給藥一次組的改善作用優(yōu)于給藥二次組；全方組損傷修復(fù)及抗炎作用優(yōu)于全方去掉一味或兩味反藥組。

【關(guān)鍵詞】反藥組合；甘遂；甘草；肝臟病理形態(tài)

“本草明言十八反，半蔞貝蘞及攻烏，藻戟遂芫俱戰(zhàn)草，諸參辛芍叛藜蘆”?！笆朔础睂儆谥兴幣湮榻煞懂?，即某些藥物合用會降低、破壞藥效或產(chǎn)生劇烈的毒副作用，所以應(yīng)該避免配合應(yīng)用[1]。然而關(guān)于反藥能否同用的爭論，從古至今從未停止。古有孫思邈云“草石相反，使人迷亂，力甚刀劍”。現(xiàn)代科研工作者在大戟配伍甘草對大鼠肝功能及肝臟微粒體中細(xì)胞色素氧化酶P4503A2的影響實驗中發(fā)現(xiàn)大戟和甘草合用后谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著增高，對大鼠肝功能損害嚴(yán)重[2]。然而古今不少醫(yī)家學(xué)者提出了相反觀點，如《金匱要略》中甘遂半夏湯用甘遂配伍甘草治療“留飲欲去”；已故名醫(yī)蒲輔周多次自服海藻甘草發(fā)現(xiàn)“海藻與甘草同用，只是服后心中稍感難受而已”，用于臨床，發(fā)現(xiàn)其軟堅散結(jié)之力更強[3]。那么“十八反”中反藥組合到底能否同用，大批科研工作者從不同學(xué)科領(lǐng)域、不同角度作了大量實驗研究。然而現(xiàn)今對“十八反”的研究多從藥物的配伍劑量、配伍比例、入藥方式、炮制品種、給藥途徑、給藥時間等方面開展，且多在生理條件下進行[4]。本實驗以含有甘遂甘草反藥組合的甘遂半夏湯為載體，在癌性腹水模型大鼠的基礎(chǔ)上，探討甘遂甘草反藥組合在不同給藥次數(shù)的條件下對大鼠肝臟病理形態(tài)的影響，以期為今后相關(guān)實驗研究提供參考，也為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1材料

1.1實驗動物

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g， SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2006-0009。

1.2實驗藥物

醋甘遂：大戟科植物甘遂EuphorbiakansuiT. N. Liou ex T. P. Wang的干燥塊根醋制而成(批號：120301)；炙甘草：豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖蜜制而成(批號：120201)；法半夏：天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb) Breit. 的塊莖，經(jīng)甘草和生石灰炮制而成(批號：100701)以上藥物均購自安徽豐原銅陵中藥飲片廠。白芍：毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall. 的根，自行浸泡、切片、烘干備至實驗所需飲片(批號：20120315)購自磐安科信中藥材生產(chǎn)力促進中心。

呋塞米(批號：H32021428)購自江蘇安邦艾普森藥業(yè)有限公司。

1.3實驗試劑

甲醛溶液(批號：1111132)購自西隴化工股份有限公司；生理鹽水(批號：1D11090302)購自山東齊都藥業(yè)有限公司；水合氯醛(批號：T20101114)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲苯(批號：1408112)購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；蘇木素染色液(批號：20140119)、伊紅染色液(批號：20141120)均購自天合力恩化學(xué)試劑；石蠟(批號：20141119)購自上海華永石蠟有限公司；中性樹脂(批號：20140901)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4實驗儀器

自動脫水機(ASP300)購自德國Leica公司；Nikon 50i型正置顯微鏡購自日本尼康公司；石蠟烤片機購自德國Leica公司；切片機(RM2135)購自德國Leica公司。

1.5藥物制備

陽性藥(呋塞米)的制備：給藥濃度為4.2 g/kg；藥液制備為0.42 g/mL。

甘遂半夏湯處方：醋甘遂1 g/kg(研末)，炙甘草15 g/kg，法半夏0.9 g/kg，白芍1.5 g/kg, 蜂蜜1.5 g/kg(由課題前期實驗結(jié)果得出：當(dāng)醋甘遂與炙甘草配伍比例為1∶15時，具有一定的肝損傷)。

甘遂半夏湯全方藥液的制備：將炙甘草、法半夏、白芍加入10倍量水浸泡1小時，大火煮沸后小火煎煮1小時，將藥液倒出。再加入8倍量水煎煮，大火沸騰后小火煎煮1小時。將兩次煎煮的藥液合并，加入蜂蜜，放置于水浴鍋上濃縮至1.89 g/mL，臨用時按比例加入醋甘遂粉末，加水至1.99 g/mL。

甘遂半夏湯去炙甘草藥液的制備：將法半夏、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至0.78 g/mL，臨用時按比例加入醋甘遂粉末，加水至0.49 g/mL。

甘遂半夏湯去醋甘遂藥液的制備：將法半夏、炙甘草、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至1.89 g/mL。

甘遂半夏湯去炙甘草醋甘遂藥液的制備：將法半夏、白芍按照全方的煎煮方法濃縮至0.39 g/mL。

1.6造模方法

將Walker-256細(xì)胞分別以0.5 mL、0.8 mL、1 mL劑量注入大鼠體內(nèi)，待出現(xiàn)腹水后再抽取腹水以1 mL/只的劑量注入大鼠體內(nèi)進行二次傳代，二次傳代的大鼠長出腹水后，選取淡黃色的腹水進行細(xì)胞計數(shù)，以細(xì)胞濃度為1.68×106個/mL注入正式實驗的大鼠體內(nèi)，每只注射1 mL。

1.7給藥方法

將大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、甘遂半夏湯全方給藥一次組(簡稱全方一次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草給藥一次組(簡稱去草一次組)、甘遂半夏湯全方去醋甘遂給藥一次組(簡稱去遂一次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草醋甘遂給藥一次組(簡稱去草遂一次組)、甘遂半夏湯全方給藥二次組(簡稱全方二次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草給藥二次組(簡稱去草二次組)、甘遂半夏湯全方去醋甘遂給藥二次組(簡稱去遂二次組)、甘遂半夏湯全方去炙甘草醋甘遂給藥二次組(簡稱去草遂二次組)，共計11組。每組大鼠20只，各組于造模后第二天開始給藥，給藥方法參照臨床實際用藥情況設(shè)計：空白組、模型組給予生理鹽(1 mL/100 g)水灌胃，每天1次；給藥一次組及陽性對照組給予相應(yīng)的實驗藥物(1 mL/100 g)灌胃，每天1次；給藥二次組給予相應(yīng)的實驗藥物(0.5 mL/100 g)灌胃，每天2次，上下午各1次。1.8樣本處理方法

連續(xù)給藥14天后取材。所有大鼠在取材前禁食12小時，次日取材前1小時灌胃1次，之后行10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，迅速取出肝右葉組織(每只大鼠所取組織大小、位置基本相同，1 cm×1 cm×0.5 cm)，用10%甲醛溶液固定一周，逐級酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，片厚6 μm，采用HE染色法，于光鏡下觀察肝臟的病理形態(tài)改變并拍照。

1.9評分標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計方法

1.9.1肝細(xì)胞損傷評分標(biāo)準(zhǔn)0分：肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞正常，無病變；1分：肝細(xì)胞變性或點狀壞死；2分：肝細(xì)胞變性或灶性壞死；3分：肝細(xì)胞壞死不到1/3肝小葉；4分：肝細(xì)胞壞死超過1/3肝小葉。

1.9.2炎細(xì)胞浸潤評分標(biāo)準(zhǔn)0分：正常，無炎細(xì)胞浸潤；1分：炎細(xì)胞散在浸潤，少見；2分：炎細(xì)胞在某一局部聚集成群；3分：炎細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性分布[5]。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，各組之間比較采用兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HE染色鏡下觀察

空白組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞索排列整齊，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉內(nèi)和肝小葉間無明顯纖維組織增生。肝索間有不規(guī)則肝竇，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，分布規(guī)律，竇內(nèi)可見少量紅細(xì)胞。細(xì)胞呈多邊形，大小均一，偶見雙核，細(xì)胞內(nèi)未見明顯空泡。匯管區(qū)可見小葉間動脈、靜脈和膽管。見圖1空白組。

模型組：肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎細(xì)胞浸潤，在中央靜脈附近肝細(xì)胞腫大，肝細(xì)胞廣泛空泡樣變，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染，局灶性出現(xiàn)肝細(xì)胞溶解和壞死。見圖1模型組。

陽性藥組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失，較模型組減輕。肝細(xì)胞廣泛空泡樣變，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染。細(xì)胞腫大數(shù)量明顯減少。偶見炎細(xì)胞浸潤。見圖1陽性藥組。

全方一次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)較為整齊，炎細(xì)胞浸潤減少，空泡樣變依然廣泛存在，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染。見圖1全方一次組。

空白組模型組陽性藥組全方一次組去草一次組去遂一次組去草遂一次組全方二次組去草二次組去遂二次組去草遂二次組

圖1各組大鼠肝細(xì)胞組織形態(tài)(HE染色，A×20，B×40)

去草一次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失，炎細(xì)胞浸潤明顯，大量空泡樣變，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染。局灶性出現(xiàn)肝細(xì)胞溶解和壞死，偶見肝細(xì)胞水腫。見圖1去草一次組。

去遂一次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失，空泡樣變廣泛存在，大量炎細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染。見圖1去遂一次組。

去草遂一次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染，大量炎細(xì)胞浸潤，空泡樣變依然大量存在。見圖1去草遂一次組。

全方二次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞溶解或壞死，空泡樣變廣泛存在，炎細(xì)胞浸潤減少，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)嗜酸性變伴核深染。見圖1全方二次組。

去草二次組: 肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失, 空泡樣變廣泛存在,炎細(xì)胞浸潤廣泛存在。見圖1去草二次組。

去遂二次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，空泡樣變未見改善，散在肝細(xì)胞嗜酸性變伴核深染，部分地區(qū)可見炎細(xì)胞大量浸潤。見圖1去遂二次組。

去草遂二次組：肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，遠離中央靜脈處呈現(xiàn)局灶性肝細(xì)胞溶解或壞死，散在嗜酸性變，可見炎細(xì)胞聚集成群現(xiàn)象，空泡樣變廣泛存在。見圖1去草遂二次組。

2.2病理組織學(xué)檢查積分結(jié)果

肝細(xì)胞損傷評分：與空白組比較，模型組及各給藥組評分上升具有顯著性差異；與模型組比較，全方一次組和全方二次組評分下降具有顯著性差異；與全方一次組比較，全方二次組、去草一次組、去遂一次組、去草遂一次組評分上升具有顯著性差異；與全方二次組比較，去草二次組、去遂二次組、去草遂二次組評分上升具有顯著性差異。

炎細(xì)胞浸潤評分：與空白組比較，模型組及各給藥組評分上升具有顯著性差異；與模型組比較，全方一次組和全方二次組評分下降具有顯著性差異，其余各組也有不同程度下降；與全方一次組比較，全方二次組評分無差異，去草一次組、去遂一次組、去草遂一次組評分上升具有顯著性差異；與全方二次組比較，去草二次組、去遂二次組、去草遂二次組評分上升具有顯著性差異。見表1。

3討論

甘遂半夏湯首載于張仲景的《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》篇，“病者脈伏，其人欲自利，利反快，雖利，心下續(xù)堅滿，此為留飲欲去故也，甘遂半夏湯主之”。甘遂半夏湯為張仲景治療留飲的經(jīng)方，但由于其含有甘遂甘草反藥組合，屬于中醫(yī)所說的“十八反”的范疇，在臨床應(yīng)用中受到了限制。但同時有一些醫(yī)家認(rèn)為反藥同用可以起到相反相激的作用，因此對于一些疾病會有特殊的療效。有學(xué)者歸納總結(jié)甘遂半夏湯的臨床應(yīng)用報道發(fā)現(xiàn)，甘遂半夏湯主要用于留飲內(nèi)停導(dǎo)致的胸腹脹滿、食欲不振、二便不通、苔膩、脈沉弦等癥[6]。本實驗通過給大鼠腹腔注射腫瘤細(xì)胞，形成腹水模型，屬于中醫(yī)“痰飲”范疇，為甘遂半夏湯的治療范圍。

通過前期文獻研究，有學(xué)者從肝臟功能[6]、肝臟酶學(xué)[7-8]等方面研究了甘遂甘草反藥組合對肝臟的毒性，但未得出統(tǒng)一定論。本實驗通過腹水大鼠肝臟病理組織學(xué)檢查積分結(jié)果及病理圖片可以看出，Walker-256癌細(xì)胞對大鼠肝臟造成了一定程度的組織損傷及炎性感染。甘遂半夏湯給藥一次組及給藥二次組對損傷具有一定的修復(fù)作用，同時發(fā)揮了抗炎作用，且給藥一次組的損傷修復(fù)作用強于給藥二次組。而全方去掉一味或兩味反藥之后，損傷修復(fù)及抗炎作用均明顯降低。

有研究表明，給藥時間對維持穩(wěn)定的有效血藥濃度至關(guān)重要，不按規(guī)定間隔時間用藥，血藥濃度會產(chǎn)生很大波動，過高可發(fā)生毒性反應(yīng)，過低則無效[9]。藥物在臨床應(yīng)用中，一次給藥量在安全的劑量范圍內(nèi)，但若短時間內(nèi)多次給藥，導(dǎo)致藥物在體內(nèi)蓄積就會產(chǎn)生毒性反應(yīng)[10]。因此科學(xué)合理的實效關(guān)系，在控制不良反應(yīng)的發(fā)生、制定和調(diào)整最佳給藥方案等方面最有重要作用。對于不同疾病的治療，應(yīng)該設(shè)置不同的給藥頻次、給藥間隔、給藥周期[11]。本實驗設(shè)置了每天一次給藥和兩次給藥的不同組別，發(fā)現(xiàn)給藥一次組的損傷修復(fù)作用強于給藥二次組。

表1　腹水大鼠肝臟病理組織學(xué)檢查積分(n，分)

注： 與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與全方一次組比較，dP<0.01；與全方二次組比較，eP<0.01。因每組大鼠均有死亡，但均不超過5只，故每組均取15例。

本實驗以癌性腹水大鼠為模型，探討加減甘遂甘草反藥組合的甘遂半夏湯在不同給藥次數(shù)條件下對大鼠肝臟病理形態(tài)的影響。實驗結(jié)果表明，甘遂半夏湯全方一次組和二次組對癌性腹水模型造成的肝損傷有一定的改善作用，一次組的改善作用強于二次組，同時表現(xiàn)出一定的抗炎作用。全方去掉一味或兩味反藥后損傷修復(fù)及抗炎作用均明顯降低。然而，人體是一個有機的整體，對肝臟病理形態(tài)的影響只是本課題組研究的一小部分，至于甘遂甘草同用對其他器官作用如何，仍需要繼續(xù)努力探索，以期對臨床合理用藥提供參考。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Comparing the effect ofGansuiBanxiadecoction plus or reduce kansui and glycyrrhiza on pathological morphology of liver of ascites rat under different times

ZHANGJian-mei，XUWan，ZHONGGan-sheng，etal.

SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of combination of incompatible herb of kansui and glycyrrhiza in modification of prescriptions of Gansui Banxia decoction on pathological morphology of liver of ascites rats under different times of administration. MethodsWalker-256 cells were used to make the malignant ascites rat model. The Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, furosemide group, once or twice of Gansui Banxia decoction group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed kansui group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza and kansui group. Once group was gavaged at morning, and twice group was gavaged morning and afternoon, which the total dose was as much as the once group. After 14 days’ feed, the liver of every rat was collected to observe pathomorphological changes, and semi-quantitative ratings was conducted. Results Liver cell damage of model group was very serious, while the once and twice of Gansui Banxia decoction group was alleviated, and the once group was better than twice group .Compared with the once of Gansui Banxia decoction group, the liver cell damage of once of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza group, once of Gansui Banxia decoction removed kansui group, once of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza and kansui group was aggravated. Compared with the twice of Gansui Banxia decoction group, the liver cell damage of twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza group, twice of Gansui Banxia decoction removed kansui group, twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza and kansui group was aggravated. ConclusionThe once and twice of Gansui Banxia decoction group has certain improvement effect on liver injury, and the once group is better than twice group; Injury repair and anti inflammatory effect of Gansui Banxia decoction group is beteer than Gansui Banxia decoction removed one or two incompatible herb.

【Keywords】Combination of incompatible herb；Kansui；Glycyrrhiza；Pathological morphology of liver

(收稿日期：2016-01-05)

Corresponding author:ZHONG Gan-sheng, E-mail：zhonggansheng@sohu.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.004

作者簡介：張建美(1986- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥性理論研究。E-mail：kkmm20110814@163.com通訊作者： 鐘贛生(1961- )，碩士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥性理論研究。 E-mail：zhonggansheng@sohu.com

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (2011CB505306)；北京中醫(yī)藥大學(xué)2015年度基本科研業(yè)務(wù)費項目(在讀研究生項目)(2015-JYB-XS033)

·甘遂甘草反藥研究專題·