黃爍丹　鄒婕　莊宇嫦　熊蓉　張小燕　鄭炎　邱美蘭

514012 梅州，梅州市婦幼保健院遺傳病防治中心(黃爍丹，鄒婕，莊宇嫦，熊蓉，張小燕)；521000 潮州，潮州凱普生物化學有限公司博士后科研工作站(鄭炎，邱美蘭)

?

廣東梅州地區(qū)地中海貧血基因突變類型分析

黃爍丹鄒婕莊宇嫦熊蓉張小燕鄭炎邱美蘭

514012 梅州，梅州市婦幼保健院遺傳病防治中心(黃爍丹，鄒婕，莊宇嫦，熊蓉，張小燕)；521000 潮州，潮州凱普生物化學有限公司博士后科研工作站(鄭炎，邱美蘭)

【摘要】目的探討廣東梅州地區(qū)人群中α、β地中海貧血患者基因突變類型、基因攜帶率及其特征。方法收集由梅州市六縣一市一區(qū)轉(zhuǎn)診或轉(zhuǎn)送到梅州市婦幼保健院的血液標本，標本來源者均為廣東省梅州市戶籍人口。對血液學篩查為陽性表型指標的樣本進行α和β地中海貧血基因檢測。結(jié)果血液學篩查陽性29 852例，確定為地中海貧血18 770例。共檢出α地中海貧血基因突變6種，基因頻率最高的是--SEA，占75.224%；共檢出14種β地中海貧血基因突變，以IVS-II-654(C-T)發(fā)生頻率最高，占38.069%，CD41/42 (-TTCT)次之，占33.626%。結(jié)論廣東梅州地區(qū)的α地中海貧血基因突變以--SEA為主，β地中海貧血以IVS-II-654(C-T)發(fā)生頻率最高，制訂地貧防控策略時應結(jié)合地區(qū)基因型分布特點，以降低重型地貧患兒的出生率。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血；基因檢測；基因突變；導流雜交；防控體系

Prevention and control system

地中海貧血(地貧)，是由于珠蛋白基因突變造成其蛋白缺陷或合成不足而引起的一種遺傳性溶血性疾病[1]。其發(fā)病機制為血紅蛋白形成單位珠蛋白鏈分子結(jié)構(gòu)發(fā)生缺陷，使其不能形成正常的四聚體(ααββ)，而絕大多數(shù)珠蛋白缺陷是由基因缺陷導致的。地貧的發(fā)病在遺傳上遵循孟德爾遺傳法則，可以根據(jù)父母雙方致病基因攜帶的情況推測出后代患病的幾率和發(fā)病的嚴重程度。因此，針對婚齡、育齡人群的篩查是防控地貧尤其是重癥地貧發(fā)生的重要手段，而對新生兒進行地貧篩查，可及時、有效地發(fā)現(xiàn)地貧患兒，及早進行治療和干預，減少重癥地貧患兒給家庭、社會帶來的負擔。本研究基于梅州地方政府支持的地貧篩查工程建立的三級防控體系，從初篩-基因檢測-遺傳咨詢等環(huán)節(jié)建立一套完整的地貧篩查、監(jiān)控、確診和管理體系，收集并整理數(shù)年來的篩查數(shù)據(jù)，總結(jié)梅州地區(qū)，特別是客家人群地貧基因型分布、攜帶率等基礎(chǔ)資料，為進一步提高防控工作水平提供參考。

對象與方法

一、研究對象

收集2006年1月至2014年12月由梅州市六縣一市一區(qū)轉(zhuǎn)診或轉(zhuǎn)送到梅州市婦幼保健院的血液標本，標本來源者均為梅州戶籍人口，年齡從出生后12 d～58歲，男女比例約3∶2。

二、方法

1. 血液學篩查

成年人：血常規(guī)檢測結(jié)果紅細胞平均體積(MCV)<80 fl和(或)紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)<27 pg和(或)血紅蛋白電泳有異常(血紅蛋白A2>3.5%或血紅蛋白A2<2.5%，或出現(xiàn)血紅蛋白C，或出現(xiàn)血紅蛋白E)則判斷為地貧篩查陽性。新生兒采用毛細管血紅蛋白電泳法篩查：出現(xiàn)血紅蛋白Bart’s區(qū)帶判斷為α地貧篩查陽性，血紅蛋白A<9.5%判斷為β地貧篩查陽性。血常規(guī)檢查采用日本希森美康XS-500i五分類全自動血液分析儀。血紅蛋白電泳采用法國Sebia公司Capillarys 2neonat fast全自動毛細管電泳分析儀。成年人和新生兒中，只要有1項初篩指標呈陽性，即進行3項地貧基因檢測。

2. 地貧基因檢測

樣本采集：新生兒采集足跟血于血斑采集卡中，成年人采集靜脈抗凝血于抗凝管中。

采用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，獲得的DNA用α和β地貧基因檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)進行地貧基因檢測，試劑盒檢測范圍包括3種缺失型α地貧(--SEA、-α3.7和 -α4.2)和3種突變型(CS、QS、WS)及β-地貧16種突變型[IVS-II-654(C-T)、-28(A-G)、-29(A-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD27/28(+C)、CD26(G-A)、CD41/42 (-TTCT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T, G-A)、IVS-I-5(G-C)、Cap(-AAAC)、Int(T-G)、CD31(-C)]。試劑盒由潮州凱普生物化學有限公司提供，檢測儀器為凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。

結(jié)果

1. 血液篩查結(jié)果

出現(xiàn)1項陽性指標的標本共計29 852例，均進行地貧基因芯片檢測，該芯片利用多重PCR和導流雜交技術(shù)對22種α和β地貧基因突變進行檢測，檢測范圍覆蓋了中國人群中95%以上的地貧基因缺陷，見圖1。

圖1　α-和β-地貧基因檢測結(jié)果

二、基因分布

經(jīng)檢測確定為地貧基因突變體18 770例，占總檢測數(shù)62.877%。其中α地貧13 289例(占70.799%)，主要的基因類型依次為--SEA/αα、βN/βN，-α3.7/αα、βN/βN和-α4.2/αα、βN/βN；β地貧4 777例(占25.450%)，主要的基因類型依次為αα/αα、β654/βN，αα/αα、β41-42/βN和αα/αα、β-28/βN；α/β地貧704例(占3.751%)，主要的基因類型依次為--SEA/αα、β654/βN，--SEA/αα、β41-42/βN和--SEA/αα、β-28/βN，見表1。在上述的18 770例確定地貧基因型陽性樣本中，共檢出6種α地貧基因突變，以--SEA發(fā)生頻率最高，占75.224%；共檢出14種β地貧基因突變，以IVS-II-654(C-T)發(fā)生頻率最高，占38.069%，CD41/42 (-TTCT)次之，占33.626%。見表2、3。

表1

廣東梅州地區(qū)地貧檢測結(jié)果(n=18 770)

續(xù)表

檢出類型檢出突變類型例數(shù)百分比(%)檢出類型檢出突變類型例數(shù)百分比(%)αα/αα、β41-42/β41-42120.064αCSα/αα、β17/βN30.016αα/αα、β654/β654120.064αQSα/αα、β654/βN10.005αα/αα、β-28/β14-1510.005αWSα/αα、β654/βN60.032αα/αα、β654/β14-1510.005αWSα/αα、β-28/βN20.011αα/αα、β-28/β1760.032αWSα/αα、β41-42/βN110.059αα/αα、β-28/βCap20.011αWSα/αα、β27-28/βN10.005αα/αα、β26/βCap10.005αWSα/αα、β71-72/βN10.005β地貧αα/αα、β41-42/β1740.021α/β地貧αWSα/αα、β17/βN20.011αα/αα、β41-42/β2620.011-α4.2/αα、β71-72/β71-7210.005αα/αα、β41-42/β27-2820.011-α4.2/αα、β41-42/β41-4210.005αα/αα、β41-42/β-28100.053-α3.7/αα、β-28/β41-4210.005αα/αα、β41-42/β4310.005-α3.7/αα、β654/β65410.005αα/αα、β41-42/β654160.085-α3.7/αα、β654/β2610.005αα/αα、β41-42/βCap50.027--SEA/-α3.7、β41-42/βN50.027αα/αα、β654/β1720.011--SEA/-α3.7、β-28/βN30.016αα/αα、β654/β2620.011--SEA/-α3.7、β17/βN10.005αα/αα、β654/β-2850.027--SEA/-α3.7、β654/βN10.005αα/αα、β654/β-2910.005--SEA/-α3.7、βCap/βN10.005αα/αα、β654/β71-7210.005--SEA/-α4.2、β41-42/βN40.021總計18770100

表2

廣東梅州地區(qū)α地貧基因頻率分布情況

注：a染色體數(shù)指檢測中發(fā)現(xiàn)的攜帶致病突變的染色體數(shù)目，雜合型突變?nèi)旧w數(shù)目為1、純合型為2

討論

我國南方是地貧高發(fā)區(qū)，特別是廣西、廣東、海南、云南等地區(qū)的α地貧基因攜帶率在0.25%～15.00%，β地貧基因攜帶率在0.02%～4.80%[2]。地貧分為α型、β型、δβ型和δ型4種，以β和α地貧較為常見[3-4]。其中，α地貧是由于α珠蛋白基因突變引起的，多數(shù)為缺失突變，也有部分點突變；β地貧是由β珠蛋白基因突變引起，其發(fā)病機制較為復雜，目前已知的基因突變超過100種，多數(shù)為點突變，也有部分缺失突變[3,5]。

表3

廣東梅州地區(qū)β地貧基因頻率分布情況

注：a染色體數(shù)指檢測中發(fā)現(xiàn)的攜帶致病突變的染色體數(shù)目，雜合型突變?nèi)旧w數(shù)目為1、純合型為2

血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征是由于4個α基因全部缺失導致α蛋白鏈不能合成所致，而我國血紅蛋白Bart’s水腫胎兒主要是--SEA純合所致[6]。本研究在18 770例確定基因型的陽性樣本中，--SEA缺失占α地貧基因突變的75.224%，因此，重型α地貧(血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征)是梅州地區(qū)新生兒出生缺陷的重要防控目標。

我國南方地區(qū)的β地貧基因突變以CD41/42 (-TTCT)發(fā)生頻率最高[7]。然而，本研究的數(shù)據(jù)顯示梅州地區(qū)β地貧基因突變發(fā)生率最高的為IVS-II-654(C-T)，占38.069%，CD41/42(-TTCT)次之，占33.626%，這與之前Lin等[8]報道一致，與江西贛州、福建和臺灣等客家人群聚居地區(qū)情況一致[9-11]。這說明地貧基因突變類型與人群分布密切相關(guān)。

廣東省梅州市是客家人群聚居地，地貧發(fā)生率約13.4%，發(fā)生率高于廣東省全省平均水平[12]。重型α地貧(血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征)在梅州市出生缺陷類型中占比例最高；重型β地貧發(fā)生率為3.8/10 000；目前梅州市存活的重型β地貧患者約有100多例，長期在梅州治療的有50多例。地貧的高發(fā)已經(jīng)嚴重影響了出生人口素質(zhì)，中重度地貧患兒的出生給家庭和社會帶來了沉重的負擔。本研究通過大量的臨床數(shù)據(jù)闡明了梅州地區(qū)的地貧基因類型和頻率，結(jié)合本地區(qū)基因型分布特點，制訂符合當?shù)氐牡刎毞揽夭呗院图夹g(shù)流程，有助于預防重型地貧患兒出生。

由于目前尚無有效的治療方法，應對地貧的主要手段是預防。因此做好人群中地貧特別是重癥地貧致病成因的宣傳教育、人群篩查、基因和產(chǎn)前診斷的，是預防重型地貧患兒出生以及控制地貧的有效手段。相比于傳統(tǒng)的血常規(guī)等檢測技術(shù)，基因檢測不僅可以更準確地確定受試者“是/否”患有地貧，還能精確地對絕大部分致病基因攜帶者的突變位點進行診斷，預測其及后代罹患地貧的幾率和嚴重程度，更好地指導遺傳咨詢和隨訪工作。

參考文獻

[1]黃爍丹，占偉，鄒婕，莊宇嫦，熊蓉，朱莎莎，張華能，梁國彥.濾紙干血斑DNA自動化提取及其在地中海貧血基因診斷中的應用. 新醫(yī)學，2015，46(8)：524-527.

[2]Lin M, Zhu JJ, Wang Q, Xie LX, Lu M, Wang JL, Wang CF, Zhong TY, Zheng L, Pan MC, Wu JR, Wen YF, Liu GR, Zhan XF, Lin F, Yang LY.Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and betathalassemia in Chinese.Blood Cells Mol Dis,2012,48(2):86-90.

[3]Galanello R, Origa R. Beta-thalassemia.Orphanet J Rare Dis,2010,5:11.

[4]Harteveld CL, Higgs DR. Alpha-thalassaemia.Orphanet J Rare Dis,2010,5:13.

[5]Kazazian HH Jr, Boehm CD. Molecular basis and prenatal diagnosis of beta-thalassemia.Blood, 1988,72(4):1107-1116.

[6]肖維威，徐湘民，徐鈐. 中國人缺失型α-地中海貧血的分子基礎(chǔ)及產(chǎn)前基因診斷. 第一軍醫(yī)大學學報, 1998, 18(1): 68-71.

[7]陳善昌，湯偉光，胡靜云，陳棟，彭小媚.疑為地中海貧血人群3 000例β-地中海貧血復查及基因突變類型分析.廣西醫(yī)學，2015，37(6):807-809.

[8]Lin M, Wen YF, Wu JR, Wang Q, Zheng L, Liu GR, Huang Y, Yang H, Lin F, Zhan XF, Lin CP, Yang HT, Weng QQ, Huang FT, Wang Y, Yao MQ, Chen HZ, Wu DH, Zeng JB, Zeng RX, Yang H, Li GC, Lu M, Zhu JJ, Xie LX, Wang JL, Yang LY.Hemoglobinopathy: molecular epidemiological characteristics and health effects on Hakka people in the Meizhouregion, southern China.PLoS One,2013,8(2):e55024.

[9]Lin M, Zhong TY, Chen YG, Wang JZ, Wu JR, Lin F, Tong X, Yang HT, Hu XM, Hu R, Zhan XF, Yang H, Luo ZY, Li WY, Yang LY.Molecular epidemiological characterization and health burden of thalassemia in Jiangxi Province, P.R.China. PLoS One, 2014,9(7):e101505.

[10]徐兩蒲,黃海龍, 王燕，鄭琳，王林鑠，許金榜，黃欣欣，林元. 福建省籍各地市人群地中海貧血的分子流行病學研究.中華醫(yī)學遺傳學雜志, 2013,30(4):403-406.

[11]Liu SC, Peng CT, Lin TH, Wang SJ, Shih MC, Tien N, Chang CC, Lu JJ, Lin CY.Molecular lesion frequency of hemoglobin gene disorders in Taiwan.Hemoglobin,2011,35(3):228-236.

[12]吳艷麗.梅州地區(qū)育齡人群地中海貧血基因的檢測與分析.國際檢驗醫(yī)學雜志，2015，36(4):442-443.

Analysis of gene mutation type of thalassemia in Meizhou, Guangdong Province

HuangShuodan,ZouJie,ZhuangYuchang,XiongRong,ZhangXiaoyan,ZhengYan,QiuMeilan.

MaternalandchildhealthhospitalinMeizhou,Meizhou514012,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the type of gene mutation, rate of carrying thalassemia gene and relevant characteristics of patients diagnosed with α- and β-thalassemia in Meizhou, Guangdong Province. MethodsBlood samples were obtained from Meizhou registered residents admitted or transferred to Maternal and Child Health Care Center of Meizhou. The samples with positive phenotype screened by hematological detection were prepared for gene detection of α- and β-thalassemia. ResultsA total of 29 852 cases yielded positive phenotype screened by hematological test and 18 770 were identified with thalassemia by gene detection. Six types of α-thalassemia gene mutation were identified with the highest gene frequency of 75.224% for--SEA. Fourteen types of β-thalassemia gene mutation were detected with the highest gene frequency of 38.069% for IVS-II-654(C-T), followed by 33.626% for CD41/42 (-TTCT). ConclusionsIn Meizhou, Guangdong Province,--SEAis the dominant type of α-thalassemia gene mutation, and IVS-II-654(C-T) for β-thalassemia gene mutation. Prevention and control strategies should be established according to the distribution characteristics of gene mutation type, aiming to decrease the birth rate of infants with thalassemia major.

【Key words】Thalassemia; Gene detection; Gene mutation; Flow-through hybridization platform;

(收稿日期：2015-11-15)(本文編輯：林燕薇)

Corresponding author, Huang Shuodan, E-mail：jinmi@yeah.net

通訊作者，黃爍丹，E-mail：jinmi@yeah.net

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.013

·臨床研究論著·